ここでは、抗がん治療薬に応答して単一細胞を縦断的に追跡する長期のタイムラプス顕微鏡法について説明します。
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この記事について
サマリー
要約
抗癌剤への単一細胞の応答は、集団の応答を決定する際に有意に寄与し、したがって、全体的な結果の主要な要因です。イムノブロッティングは、フローサイトメトリーおよび固定細胞実験は、多くの場合、細胞が抗がん剤への対応方法を研究するために使用されています。これらのメソッドは重要ですが、彼らはいくつかの欠点を持っています。癌細胞と正常細胞の間で、異なるがん由来の細胞、および過渡希応答の間の薬物応答における変動性は、集団平均化アッセイを使用して直接追跡し、長手方向にそれらを分析することができることなく理解することは困難です。顕微鏡は、画像の生細胞に特に適しています。技術の進歩だけでなく、細胞の追跡だけでなく、様々な細胞応答の観察を可能解像度で日常画像セルに私たちを有効にします。私たちは、の連続タイムラプスイメージングを可能にする詳細なアプローチについて説明します基本的に限り、一般的に96時間まで、所望のようにのための薬剤応答中に細胞。アプローチのバリエーションを使用して、細胞が週間モニターすることができます。遺伝的にコード化された蛍光バイオセンサーの採用により多数のプロセス、経路および応答が続くことができます。我々は、追跡し、細胞増殖および細胞周期進行、染色体ダイナミクス、DNA損傷の定量化、および細胞死を含む例を示します。我々はまた、技術とその柔軟性のバリエーションを議論し、いくつかの一般的な落とし穴を強調表示します。
概要
単一細胞の生細胞の顕微鏡縦追跡は新しい技術ではありません。最古の顕微鏡から、愛好家や科学者は、単一の細胞および生物、彼らの行動、および開発1-3を観察し、研究しています。 1950年代のバンダービルト大学の後期のデビッド・ロジャースからの有名な例は、 黄色ブドウ球菌の菌と食作用4の最終的過程を追いかけて血液塗抹標本中のヒト好中球を示しています。化学勾配の検知、力学および細胞運動性、細胞の形状のダイナミクス、接着、および病原体の食作用の速度：この生細胞ムービーは、単一の実験で観察され、相関させることができるか、複数のプロセスの優れた説明図です。
完全に自動化された顕微鏡や高感度デジタルカメラの出現がfの範囲の細胞生物学の基本的な質問をするために顕微鏡を用いて研究者数の増加をもたらしました細胞は5,6を移動し、ダイナミクスや膜輸送9-11をオルガネラする7,8分割の仕方ROM。 1953年にフリッツ・ゼルニケのためのノーベル賞を獲得し、位相コントラスト（PC）を含む非蛍光、明視野顕微鏡、、、および微分干渉コントラスト（DIC）は、微小管の束を含む細胞および核だけでなく、サブ細胞構造の観察を可能に、染色体、核小体、細胞小器官ダイナミクス、太いアクチン繊維12。遺伝的にコードされる蛍光タンパク質や細胞小器官に対する蛍光色素の開発が飛躍的....
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プロトコル
以下のプロトコルは、取得の設定や実験条件について、 図4、図 6の実験によって定義されたパラメータを使用しています。これらのパラメータの多くは、他の実験に適合するように修正することができる（ すなわち、露光時間、ビニング、蛍光チャネルなど ）。すべての手順は、制度ガイドラインと規則を遵守しなければならないと制度バイオセーフティ委員会によって承認されます。顕微鏡メーカーのウェブサイトでは、ライブセルイメージングのための優れた情報が含まれています。
1.顕微鏡およびイメージングソフトウェア
- 倒立顕微鏡の多種多様でライブセルイメージングを実行します。最も一般的な顕微鏡は、落射蛍光とスピニングディスク共焦点を広視野ています。ここでは、200ワットのメタルハライド光源を用いて自動化された電動式広視野落射蛍光顕微鏡を使用しています。
- ステージ上部または顕微鏡環境室を入手します。ここで、ステージトンを使用オペアンプ環境室。
- タイムラプス顕微鏡を実行するためのユーティリティで顕微鏡を操作する商用ソフトウェアを使用してください。
- 画像解析用の市販のソフトウェアまたはImageJのを使用してください。他の多くの分析ツールが市販されており、8,18を公開されているの多....
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結果
長期タイムラプス顕微鏡と直接縦トラッキングは、薬物応答の間に多くの抗がん効果の研究を可能にします。 図1の概要に続いて、細胞の複数の例は、抗がん剤で処理し追跡し、異なるアプローチを用いて分析することを検証した蛍光レポーターを発現して示されています。
単独の位相差顕微鏡は、非常に有益であるとロバスト有糸分裂、有糸分裂期間および停止、異常な細胞分裂、および細胞死21,23,24対間期に報告します。細胞分裂を標的とする薬剤、多くの場合、抗有糸分裂薬と呼ばれる、開発され続けている。彼らのp53の状態が異なるだけでマッチした乳癌由来MCF7細胞株のペアの2 作品1及び図2の例を図 、500で処理されましたその標的抗がん剤の種類のnMのそして長引く有糸分裂20で得られた有糸分裂モータータ.......
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ディスカッション
タイムラプス顕微鏡と縦トラッキングのメリット
それは研究者が個々の細胞とその運命だけでなく、全人口を追跡することを可能にするよう顕微鏡は、薬剤応答の縦断的研究のための理想的な楽器です。細胞の集団内で薬物応答における変動は、抗癌治療設計のための主要な問題です。単一細胞の長手方向の追跡は、研究者がこの変動を観察し、それが細胞集団に関連した根底にあるメカニズムと影響を理解し始めることができます。蛍光プローブの様々な利用することは一般的で、まれ両方の応答の表現型を観察し、理解するための多くの方法を提供します。タイミングと異なる細胞運命の寄与人口の応答に、特定の表現型と運命の間の関係、および処理時の細胞株または状態間の応答の違いを学ぶことができるものの例です。多くの癌関連プロセスを研究することができます。この記事で強調表示されていないいくつかは、アポトーシス、オートファジーと細胞死、および壊死記者39-42、細胞浸潤43,44、および細胞運命決定27を決定したp53のダ.......
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開示事項
著者には開示すべき利益相反はありません。
謝辞
技術サポートを提供してくださったJoshua Marcus氏と、技術的なアドバイスを提供してくださったRichard J. McIntosh光学顕微鏡コア施設のディレクターであるJolien Tyler博士に感謝します。この研究は、コロラド大学ボルダー校とコロラド大学ボルダー大学院からJ.D.O. R.T.B.への資金提供によって支援されました。これは、NIHからの博士課程前研修助成金(T32 GM008759)によって部分的にサポートされています。セリネクサーについてはKaryopharm Therapeutics, Inc.、キネシン-5阻害剤についてはMerck Seronoに感謝します。FUCCIプラスミドは、宮脇淳氏(理化学研究所、日本)からMTA経由で提供されています。mCherry-BP1-2はAddgeneのものでした。H2b-mCherryとβ-tubulin-EGFPを発現するHeLaは、Daniel Gerlich氏(IMBA, Austrian Academy of Sciences, Austria)によるものです。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| タキソール(パクリタキセル) | シグマ | T7191 | 微小管安定化薬 |
| エトポシド | セレックケム | S1225 | トポイソメラーゼII阻害剤 |
| Selinexor | Karyopharm Therapeutics | na | XPO1 / CRM1阻害剤、ギフト |
| ネシン-5阻害剤 | メルクセローノ | na | ギフト、アメリカンカスタムケミカルズコーポレーションからも入手可能です。CAS 858668-07-2 |
| 細胞増殖培地 | HyClone(フィッシャー)またはMediatech | 多くの企業が利用可能 | |
| 5% CO2/バランス空気、認定 | エアガス | Z03NI7222004379 | |
| 35 mmディッシュ、20 mmガラス底 | Cellvis | D35-20-1.5-N | 多くの企業が利用可能 |
| 35 mm 4ウェルディッシュ、20 mmガラス底 | Cellvis | D35C4-20-1.5-N | 多くの企業が利用可能 |
| 35 mm皿、格子ガラス底 | MatTek | P35G-2-14-CGRD | 多くの会社が利用可能 |
| マルチウェル、ガラス底 | Cellvis | P12-1.5H-N | 多くの会社が利用可能 |
| オリンパスIX81 倒立落射蛍光顕微鏡 | オリンパス | ||
| オリンパスIX2-UCBコントローラー | オリンパス | ||
| PRIOR LumenPro200 | Prior Scientific | Lumen200PRO | |
| PRIOR Proscan III電動ステージ | Prio Scientific | H117 | |
| STEV chamber | InVivo Scientific | STEV.ECUです。HC5 STAGE TOP | |
| 環境コントローラーユニット | InVivo Scientific | STEV.ECUです。HC5 STAGE TOP | |
| 浜松 オルカ R2 CCD コントローラー付 | 浜松 | C10600 | |
| ニコン エクリプス Ti | ニコン | ||
| ニコン レーザー打ち上げ | ニコン | ||
| SOLA ライトエンジン | ルーメンコール | ||
| iXon Ultra 897 EM-CCD | ANDOR | ||
| TOKAI HIT inclubation chamber | 東海ヒット | ティッシュ |
参考文献
- Abercrombie, M., Heaysman, J. E., Pegrum, S. M. The locomotion of fibroblasts in culture I. Movements of the leading edge. Exp Cell Res. 59, 393-398 (1970).
- Abercrombie, M., Heaysman, J. E. Obser....
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再版と許可
