鏡の国のアリス：単一細胞のタイムラプス顕微鏡と縦トラッキング抗がん治療薬を研究します

サマリー

ここでは、抗がん治療薬に応答して単一細胞を縦断的に追跡する長期のタイムラプス顕微鏡法について説明します。

要約

抗癌剤への単一細胞の応答は、集団の応答を決定する際に有意に寄与し、したがって、全体的な結果の主要な要因です。イムノブロッティングは、フローサイトメトリーおよび固定細胞実験は、多くの場合、細胞が抗がん剤への対応方法を研究するために使用されています。これらのメソッドは重要ですが、彼らはいくつかの欠点を持っています。癌細胞と正常細胞の間で、異なるがん由来の細胞、および過渡希応答の間の薬物応答における変動性は、集団平均化アッセイを使用して直接追跡し、長手方向にそれらを分析することができることなく理解することは困難です。顕微鏡は、画像の生細胞に特に適しています。技術の進歩だけでなく、細胞の追跡だけでなく、様々な細胞応答の観察を可能解像度で日常画像セルに私たちを有効にします。私たちは、の連続タイムラプスイメージングを可能にする詳細なアプローチについて説明します基本的に限り、一般的に96時間まで、所望のようにのための薬剤応答中に細胞。アプローチのバリエーションを使用して、細胞が週間モニターすることができます。遺伝的にコード化された蛍光バイオセンサーの採用により多数のプロセス、経路および応答が続くことができます。我々は、追跡し、細胞増殖および細胞周期進行、染色体ダイナミクス、DNA損傷の定量化、および細胞死を含む例を示します。我々はまた、技術とその柔軟性のバリエーションを議論し、いくつかの一般的な落とし穴を強調表示します。

概要

単一細胞の生細胞の顕微鏡縦追跡は新しい技術ではありません。最古の顕微鏡から、愛好家や科学者は、単一の細胞および生物、彼らの行動、および開発^1-3を観察し、研究しています。 1950年代のバンダービルト大学の後期のデビッド・ロジャースからの有名な例は、 黄色ブドウ球菌の菌と食作用⁴の最終的過程を追いかけて血液塗抹標本中のヒト好中球を示しています。化学勾配の検知、力学および細胞運動性、細胞の形状のダイナミクス、接着、および病原体の食作用の速度：この生細胞ムービーは、単一の実験で観察され、相関させることができるか、複数のプロセスの優れた説明図です。

完全に自動化された顕微鏡や高感度デジタルカメラの出現がfの範囲の細胞生物学の基本的な質問をするために顕微鏡を用いて研究者数の増加をもたらしました細胞は^5,6を移動し、ダイナミクスや膜輸送^9-11をオルガネラする^7,8分割の仕方ROM。 1953年にフリッツ・ゼルニケのためのノーベル賞を獲得し、位相コントラスト（PC）を含む非蛍光、明視野顕微鏡、、、および微分干渉コントラスト（DIC）は、微小管の束を含む細胞および核だけでなく、サブ細胞構造の観察を可能に、染色体、核小体、細胞小器官ダイナミクス、太いアクチン繊維^12。遺伝的にコードされる蛍光タンパク質や細胞小器官に対する蛍光色素の開発が飛躍的にタイムラプス顕微鏡^13-15に影響^を与えています。この記事の焦点ではないが、共焦点および多光子顕微鏡を用いて細胞スフェロイドにおけるその場 （生体顕微鏡） で撮像がアプローチの別の拡大を表しており、使用してこれらのアプローチを^16-19を議論^する優れた記事があります。

抗CANCに対する細胞の応答えー薬または天然物は、分子や細胞スケールで決定されます。治療後の細胞応答と運命を理解することは、多くの場合、免疫蛍光検出に人口平均化アッセイ（ 例えば 、免疫ブロット法、全ウェル対策）、または固定の時点を含み、単一の細胞を測定する、フローサイトメトリー。集団内の薬物への単一細胞応答の不均一性は、腫瘍において特に飽和で同じ薬物で処置された細胞株および腫瘍全体で見られる応答の変動のいくつかを説明することができます。指定された単一の細胞または細胞の集団を追跡する縦のアプローチ長期的には、分子応答経路の直接的な研究を可能にするあまり一般的ではないが、非常に強力なアプローチである、の異なる表現型（ 例えば 、細胞死や細胞分裂）、観察細胞と細胞の集団内で変動し、どのようにこれらの要因は、人口の応答ダイナミクス^20-22に貢献しています。楽観的、できること単一細胞の反応を観察し、定量化するためには、薬物は、彼らが時々失敗する理由、仕事、そしてどのように最高のそれらを使用する方法の我々の理解を向上させるのに役立ちます。

長期的タイムラプス顕微鏡、縦追跡、および薬物応答の解析の手法は、多くの研究者に利用可能であると表現型の応答^20,21を観察する透過光のみを使用して、シンプルにすることができます。アプローチの主なコンポーネントは以下のとおりです。目的の細胞の適切な準備、環境室と自動顕微鏡、画像を取得し、保存するためのコンピュータと一体化したカメラ、および時間経過と対策を検討し、細胞を分析するためのソフトウェアを任意の蛍光バイオセンサー。私たちは、明視野および/または広視野落射蛍光顕微鏡を使用している限り、数日間培養した細胞のタイムラプス顕微鏡検査を行うための多くのヒントを詳細なプロトコルを提供します。このプロトコールは、培養で増殖させることができる任意の細胞株のために使用することができます抗癌治療への応答を研究します。我々は、取得したデータの例を提供し、複数の異なる遺伝的にコードされた蛍光バイオセンサーおよび位相差顕微鏡の例を用いて分析し、簡単に何をすることができ、プローブの異なる種類の、長期の時間経過、縦トラッキングの長所と短所を議論します非直接アプローチ、そして我々はアプローチを使用して考えていない経験の浅い研究者、および経験豊富な研究者に興味や価値があることを願っていますいくつかのバリエーションから理解することは困難である。このアプローチを学びました。

プロトコル

以下のプロトコルは、取得の設定や実験条件について、 図4、図 6の実験によって定義されたパラメータを使用しています。これらのパラメータの多くは、他の実験に適合するように修正することができる（ すなわち、露光時間、ビニング、蛍光チャネルなど ）。すべての手順は、制度ガイドラインと規則を遵守しなければならないと制度バイオセーフティ委員会によって承認されます。顕微鏡メーカーのウェブサイトでは、ライブセルイメージングのための優れた情報が含まれています。

1.顕微鏡およびイメージングソフトウェア

1. 倒立顕微鏡の多種多様でライブセルイメージングを実行します。最も一般的な顕微鏡は、落射蛍光とスピニングディスク共焦点を広視野ています。ここでは、200ワットのメタルハライド光源を用いて自動化された電動式広視野落射蛍光顕微鏡を使用しています。
2. ステージ上部または顕微鏡環境室を入手します。ここで、ステージトンを使用オペアンプ環境室。
3. タイムラプス顕微鏡を実行するためのユーティリティで顕微鏡を操作する商用ソフトウェアを使用してください。
4. 画像解析用の市販のソフトウェアまたはImageJのを使用してください。他の多くの分析ツールが市販されており^、8,18を公開されているの多くのカスタムメイドのプログラムがあります。

2.細胞プロセスおよび表現型応答の可視化

1. 明視野顕微鏡で細胞を可視化します。微分干渉コントラスト単独位相コントラストは、抗癌薬の応答に対する応答を研究するために非常に有益であることができます。これらのプロセスは、有糸分裂、細胞運動性およびアポトーシスを含むことができます。
2. 蛍光バイオセンサーを用いて細胞構造、細胞小器官およびプロセスを視覚化します。蛍光プローブは、特定の細胞内のプロセスを追跡するのに有益です。これらは、微小管ダイナミクス、ミトコンドリアと小胞体のダイナミクス、タンパク質の蓄積および局在化を含むことができ、分子シグナル（ 例えば 、リン酸化、カルシウム）。

試料の調製

1. 標準の加湿細胞培養インキュベーター（ 例えば、37 ^O C、5％CO _2、相対湿度80％）で細胞培養認定皿で細胞を増殖させます。
   1. EBSSとMEMでHT1080細胞を成長させます。 10％v / vのFBS、1％v / vのペニシリン/ストレプトマイシン、1％（v / v）のピルビン酸ナトリウム、1％v / vの非必須アミノ酸を含む培地を補います。
2. イメージングの2日前に、認定された無菌層流フード内で12ウェル＃1.5ガラスボトムディッシュの3ウェルにプレート50,000 HT1080 FUCCI細胞。実験の開始のための〜60％のコンフルエンスを達成するために播種した細胞の数を調整します。実験の細胞株および性質に応じて、セル密度が小さくてもよいです。
   注：細胞密度は、細胞株の成長を、実験結果に大きな影響を有していてもよいです。実験間variabilitを最小限にするために、細胞を数えます密度に起因するyの。
   1. 環境室や実験に必要な条件、単一ウェル皿中のプレート細胞（典型的には、35-または60ミリメートル）、4も35-mmディッシュ、6、12または24ウェル細胞培養プレート、またはに応じて、様々なフォーマットでカバースリップスライド。細胞培養プラスチックを通して＃1.5ほとんどの対物レンズは、ガラスのこの厚さのために最適化されているように、ガラス、およびイメージングのガラス底プレートを使用して、非常に悪いです。
      注：一部の細胞株が成長し、ガラス上に生存しません。これらの場合において、ガラスは、細胞接着（ 例えば 、ポリリジンまたはコラーゲン）を高めるためにコーティングすることができます。一部の企業は、光細胞培養プラスチックを製造し、これは実行可能なオプションである場合、それは経験的に決定されなければなりません。

4.環境チャンバーセットアップ

1. 前のいずれかの実験に、セットアップ環境室を^37°Cのそれは80％の湿度〜で動作し、そのように試料位置での温度となるように。ほとんどの培養細胞は、培地中の重炭酸ナトリウム緩衝液を5％CO ₂ /バランス空気雰囲気中で成長します。セットアップに応じて、いずれかの5％CO ₂の環境制御装置を設定し、それが空気で100％のCO _2を混合_し 、または5％CO ₂ /バランスエアガス認定、プレミックスを使用します。ガス流速については、製造元の指示に従ってください。
   注：一部の細胞系は、それらがCO ₂なしで維持することができ、その場合にCO ₂非依存性培地中で増殖します。具体的に設計された画像形成媒体は、自家蛍光化合物の添加を制限することも可能です。所望の細胞型のための論文媒体の成長は事前に実験的に決定されなければなりません。
2. 撮影の前に、水溜りを滅菌蒸留水で（製造者の指示に従って）満たされていることを確認します。所望の温度設定に環境室をオンにして、顕微鏡ステージの挿入図に配置します。ガスを保存するには、この時点でフローを開始しないでください。
   注意：ステージトップチャンバーとステージインセットおよび/またはそれが実験に運動アーチファクトを導入することができるチャンバへの接続コード上の任意のテンションとの間の空きスペースがある場合。
   1. ステージに結合するように、その中にチャンバを、チャンバを挿入する前段階のはめ込み開口部の縁の上にパラフィンフィルムの断片を置き、そして何の接続は、チャンバを引いていないことを確認してください。
3. チャンバーは^37℃。に平衡することを許可します細胞生理学に影響を与えるとドリフトを導入することができる撮像中の温度変動を防止するための安定した温度を維持します。温度平衡に到達すると、通常の環境に応じて、1時間に30分を必要とします。
   1. 温めながらチャンバー内に井戸内の水と「ダミー」の料理を挿入します。室を確保する手助け水模倣でサンプルを充填したイメージング皿は、十分に温め、安定化されます。予め温めた滅菌水でチャンバーを充填温度安定化に必要な時間を短縮し、実験試料の添加時に温度低下を最小限に抑えます。

5.顕微鏡セットアップ

1. 顕微鏡、関連するコンピュータ、および任意の必要な周辺機器の電源を入れます。
   1. 光源に応じて、必要になるまでこれをオンにするのを待つ（ 例えば 、LED）。
2. 低い位置にある対物レンズタレットを使用すると、使用する20X 0.7 NAの対物レンズを選択します。
3. 目的以上のサンプルを置きます - これは、試料がチャンバー内にあるときに、それが簡単に細胞を見つけることになります。
4. 彼らは以前の実験から知られている場合は、この時点で撮像パラメータを定義します。

6.顕微鏡にし、チャンバー内に細胞を輸送

1. 環境室にインキュベーターから撮像される細胞をトランスポートします。これは比較的低いCO ₂の効果を制限するために迅速に行われていることを確認してください大気中および細胞上の温度を低下させました。サンプル輸送及び流出した場合のクリーンアップのためのすべての機関のバイオセーフティガイドラインに従ってください。
   1. 大きな環境変化を避けるために密封された発泡スチロールの容器または絶縁された袋に細胞を置きます。
2. 製造元の指示に従ってチャンバー内に試料イメージング皿を挿入します。
3. 細胞は、環境チャンバ内に固定された後、安定した環境を維持し、すぐに雰囲気ガスの供給源（複数可）をオンにするために、チャンバをシール。
   1. いくつかの環境室はタイトな、密封された蓋を利用しないように、成長培地の上に蒸着、無菌層、胚認定鉱物油を遅延させます。ガラス撮像領域を妨げないように注意しながら試料皿の周囲のエッジの周りにガス透過性パラフィンフィルムを包みます。ローカライズされた、二次加湿方法を採用することができます。試料皿の蓋に結露がperforを減少させることができます明視野顕微鏡のマンス。
4. 初期の実験中の熱ドリフトの影響を最小限にするために、時間経過を開始する前に30分待ちます。所要時間は、イメージング皿のサイズやその他の要因によって異なります。経験的に決定します。

7.イメージングを設定します

1. 最良のデータを表現する撮影条件を選択します。 、露光時間を制限する低い強度の光を使って光の長い波長によって励起されたプローブを選択することにより、光毒性を避けるための予防措置を講じてください。
2. X、Y、および画像化される各位置に対するz平面と所望の波長（複数可）を定義します。時間分解能は、位置と波長の数によって制限されます。ほとんどの細胞プロセスの長期タイムラプスについては、すべての10 1つの画像を取得 - 20分。より高い時間分解能（短い間隔、 例えば 、1分）、より多くのデータポイントを提供し、したがって、より強固な細胞追跡だけでなく、複数の集積をもたらします露光、大きなデータセット。
   1. - 50ミリ秒、テキサスレッド/ TRITC - 40ミリ秒、明視野 - 20ミリ秒FITC / GFP：HT1080 FUCCIが動的緑色と赤色蛍光タンパク質を持っているように（代表的な結果を参照）、以下の露光時間を使用します。 2×2のビンを使用してください。
3. 高度な設定の下で、デフォルトパラメータを使用して、ソフトウェア制御のオートフォーカスを有効にします。推奨ステップサイズで10μmのオートフォーカス範囲を定義します。タイムラプスを開始する前にこれを実行してください。光毒性および光退色を低減するために、蛍光と明視野画像と決してとオートフォーカス。
   1. 電動ステージで任意の顕微鏡上でソフトウェア制御オートフォーカスシステムを使用し、直接サンプルに焦点を当てます。しかし、それらは、実験の取得速度を制限することができます。ハードウェア制御の連続フォーカシングシステムは、タイムラプス顕微鏡検査のためにうまく機能し、それ以上の位置に結像するか、買収の高いレートを可能にする、速度を向上させます。しかしながら、それら空気 - ガラス界面の検出に依存しているとよく全体のガラスの厚さの変化にサンプルのフォーカスを失う可能性があります。
4. メディアは^37℃。に温めてきた所望の薬物濃度を含有する培地の半分を交換してください部分的なメディアの交換は、熱ドリフトを低減することができます。この実験における条件は、車両（DMSO）、1μMのselinexorと10μMのPD0332991です。
   注：このステップは、実験を一時停止し、再起動することにより、買収を開始した後もを行うことができます。これは、単一の細胞の前および後の薬物応答の長手追跡を可能にします。薬物安定性や代謝が懸念される場合は、一時停止と交換するメディアが同じ方法で行うことができます。薬剤分解または代謝を試験するために、処理された細胞からの培地はまた、薬物の作用を試験するためにナイーブな細胞上に配置することができます。
5. タイムラプスを開始します。
6. タイムラプスを実行すると、撮像されたフィールドがフォーカスとchambeに残っていることを確認してくださいrは湿度の高い^37℃。を維持します
   1. 時点間の時間のギャップの間に取得を一時停止することにより、必要に応じてフォーカスを調整します。
7. 必要に応じて、より長い実験中にチャンバに水を追加します。 37 ^O℃で予熱した、滅菌蒸留水を添加することにより、チャンバを冷却する避けます

8.タイムラプスエンディング

1. 実験が完了するまで実行したとき、それが自動的に停止するように設定されていない場合、取得を停止します。
2. 正常に完了していないデータが失われる可能性があれば、ほとんどのソフトウェアパッケージを自動的に取得中に保存しているが、時間経過は、ハードドライブに正しく保存されていることを確認してください。
3. 顕微鏡からチャンバーを外し、承認機関バイオ安全手順に従ってバイオハザード廃棄物への細胞の処分。

9.縦の追跡と分析時系列データの

1. ある分析のための方法論を選択します。関心の生物学的プロセスのための適切な。 ImageJの、MATLABを使用したプログラム、およびカスタム・プラットフォームのための多くのプラグインは、特定の用途のために製造されています。 図4、図 5に示されているように、以下の方法論は、核と核の蛍光プローブの分析の追跡をカバーしています。
2. ImageJの中で利用されるチャネルのための.tif画像スタックを開きます。また、Bioformatsプラグインを使用して、ImageJの中で直接取得プログラムからネイティブファイルを開きます。
3. （使用する場合）明視野画像または核ラベルチャネルを使用して、1つの細胞の核内に関心領域（ROI）を描き、ROIマネージャーに追加します。注：画像化された細胞は核ラベルを持っている場合（ 例えば 、ヒストンH2B-EGFP。）、その後自動細胞追跡は時間を通じて興味（ROIを）個々の核を表すの領域を作成するために利用することができます。
4. 次の時点に進み、同じnucleu内のROIを配置秒。 ROIマネージャーにROIを追加します。
5. 追跡し、細胞事象（有糸分裂、アポトーシス、 など 。）又は細胞がもはや追跡することはできませんがあるまで、個々の細胞のためのROIを作り続ける（ すなわち 、フレームの外に移動するか、実験は終了）。
6. ROIは、彼らがフィールドにいる時間を介して細胞のために確立されている場合には、関心の蛍光チャネルにそれらを重ね合わせます。すべての時点について、各チャネルにおける蛍光の平均強度を測定します。後で使用するためにROIのリストを保存します。
   1. 種々の測定は、異なる実験における用途のためのROI内で行うことができます。分析→設定の測定をクリックして...分析方法を選択するメニューを表示する（ 例えば 、ROI内の平均強度、積分強度、 等 。）。
7. 追跡しながら、個々の細胞（ 例えば 、アポトーシス、分裂、生存）のための細胞の運命に注意してください。これは、生存曲線とfurtheを作成できますrの人口分析。
8. 両方のチャネルの平均強度で、治療（ 図5B、C）に応答して細胞周期動態を表示する散布図を作成します。
   注：プロットは、経時的に個々のセルのために作成または追跡細胞集団にわたって平均化することができます。定量的イメージングは​​、癌治療に応答して、複雑な応答と細胞の関係を確立するために重要になる場合があります。長期タイムラプス顕微鏡、縦追跡およびデータ分析は、顕微鏡および分析ツールのタイプのための多くのオプションで、多段階のプロセスであり、 図1に提供される一般的な概要を次の。

結果

長期タイムラプス顕微鏡と直接縦トラッキングは、薬物応答の間に多くの抗がん効果の研究を可能にします。 図1の概要に続いて、細胞の複数の例は、抗がん剤で処理し追跡し、異なるアプローチを用いて分析することを検証した蛍光レポーターを発現して示されています。

単独の位相差顕微鏡は、非常に有益であるとロバスト有糸分裂、有糸分裂期間および停止、異常な細胞分裂、および細胞死^21,23,24対間期に報告します。細胞分裂を標的とする薬剤、多くの場合、抗有糸分裂薬と呼ばれる、開発され続けている。彼らのp53の状態が異なるだけでマッチした乳癌由来MCF7細胞株のペアの2 作品1及び図2の例を図 、500で処理されましたその標的抗がん剤の種類のnMのそして長引く有糸分裂²⁰で得られた有糸分裂モータータ...

ディスカッション

タイムラプス顕微鏡と縦トラッキングのメリット

それは研究者が個々の細胞とその運命だけでなく、全人口を追跡することを可能にするよう顕微鏡は、薬剤応答の縦断的研究のための理想的な楽器です。細胞の集団内で薬物応答における変動は、抗癌治療設計のための主要な問題です。単一細胞の長手方向の追跡は、研究者がこの変動を観察し、それが細胞集団に関連した根底にあるメカニズムと影響を理解し始めることができます。蛍光プローブの様々な利用することは一般的で、まれ両方の応答の表現型を観察し、理解するための多くの方法を提供します。タイミングと異なる細胞運命の寄与人口の応答に、特定の表現型と運命の間の関係、および処理時の細胞株または状態間の応答の違いを学ぶことができるものの例です。多くの癌関連プロセスを研究することができます。この記事で強調表示されていないいくつかは、アポトーシス、オートファジーと細胞死、および壊死記者^39-42、細胞浸潤^43,44、および細胞運命決定^27を決定^したp53のダ...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
タキソール(パクリタキセル)	シグマ	T7191	微小管安定化薬
エトポシド	セレックケム	S1225	トポイソメラーゼII阻害剤
Selinexor	Karyopharm Therapeutics	na	XPO1 / CRM1阻害剤、ギフト
ネシン-5阻害剤	メルクセローノ	na	ギフト、アメリカンカスタムケミカルズコーポレーションからも入手可能です。CAS 858668-07-2
細胞増殖培地	HyClone(フィッシャー)またはMediatech		多くの企業が利用可能
5% CO2/バランス空気、認定	エアガス	Z03NI7222004379
35 mmディッシュ、20 mmガラス底	Cellvis	D35-20-1.5-N	多くの企業が利用可能
35 mm 4ウェルディッシュ、20 mmガラス底	Cellvis	D35C4-20-1.5-N	多くの企業が利用可能
35 mm皿、格子ガラス底	MatTek	P35G-2-14-CGRD	多くの会社が利用可能
マルチウェル、ガラス底	Cellvis	P12-1.5H-N	多くの会社が利用可能
オリンパスIX81 倒立落射蛍光顕微鏡	オリンパス
オリンパスIX2-UCBコントローラー	オリンパス
PRIOR LumenPro200	Prior Scientific	Lumen200PRO
PRIOR Proscan III電動ステージ	Prio Scientific	H117
STEV chamber	InVivo Scientific	STEV.ECUです。HC5 STAGE TOP
環境コントローラーユニット	InVivo Scientific	STEV.ECUです。HC5 STAGE TOP
浜松 オルカ R2 CCD コントローラー付	浜松	C10600
ニコン エクリプス Ti	ニコン
ニコン レーザー打ち上げ	ニコン
SOLA ライトエンジン	ルーメンコール
iXon Ultra 897 EM-CCD	ANDOR
TOKAI HIT inclubation chamber	東海ヒット	ティッシュ