上皮から間葉への移行(EMT)は、癌が浸潤性になることを可能にします。EMTを調査するために、血清と酵素を欠いた神経幹細胞(NSC)ベースのinvitroモデルが記載されています。この標準化されたシステムにより、細胞遊走、遺伝子およびタンパク質発現の定量的および定性的な評価が可能になります。創薬に適したモデルです。
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方法論記事
創薬に適していEMT調査のための酵素および無血清神経幹細胞培養モデル
* These authors contributed equally
この記事について
サマリー
要約
間葉移行（EMT）に上皮は、上皮が間葉への分化転換のプロセスについて説明します。 EMTはまた、一般的に最も頻度の高い悪性脳腫瘍、神経膠芽腫で発生胚発生時の基本的な過程です。 EMTは、乳癌、肺癌、大腸癌、胃癌などの脳外の複数の癌において観察されています。 EMTは中心部に移動、浸潤や転移形成を促進することにより、悪性腫瘍にリンクされています。 EMT誘導のメカニズムは完全には理解されていません。ここでは、皮質の神経幹細胞（NSC）の標準化された単離およびその後のEMT誘導のためのin vitroの系を記述しています。このシステムは、単一細胞または移植片培養のいずれかを使用するための柔軟性を提供します。このシステムでは、ラットまたはマウス胚前脳NSCは、定義された培地で培養し、血清酵素を欠いています。 NSCはOLIG2及びSOX10、oligodendrocで観察された2つの転写因子を発現しましたYTE前駆細胞（OPCの）。このシステムを使用して、ZEB1、ZEB2、およびTwist2を含むFGF-、BMP-とTGFβシグナル伝達の間の相互作用は相乗BMP-/TGFβ-相互作用を示唆し、TGFβ活性化大幅に強化された細胞遊走を観察しました。結果は、FGF-、BMP-のネットワークを指し、EMTの誘導および維持に関与することがTGFβシグナリング。このモデル系は、in vitroで EMTを調査するために適切です。これは、コスト効率で、高い再現性を示しています。また、それらの移動応答（定量的な距離測定）に対する異なる化合物の比較を可能にし、EMTを阻害または増強する化合物のハイスループットスクリーニング（定性的測定）。モデルは、したがって、EMTに影響を与える物質の薬物ライブラリをテストするのに適しています。
概要
胚発生のいくつかの段階では、上皮細胞は互いに（ 例えば、タイトジャンクション）への強い接着性を失い、間葉移行（EMT）に上皮と呼ばれるプロセスで渡り鳥の表現型を獲得する1。 EMTは、間葉系、神経堤細胞のような追加の細胞型、神経上皮2から分離する集団の形成に必要とされます。 EMTは、胚の段階ではないだけに不可欠であるだけでなく、創傷治癒3および中枢神経系（CNS）病変4脱髄における再生などの成体生物における生理学的プロセスを、維持するために、成人期の後の段階で必要。
上皮性腫瘍は、最終的に癌の進行1,3につながる、移動、浸潤や転移の開始段階として、EMTを再活性化することが知られています。 EMTは確かに集中強いマイグレーション1,3にリンクされています。 Cのセルラーステップonditioning、開始受けるとEMTを維持することは十分に理解し、さらなる調査を必要としていません。
ここでは、定義された成長因子とメディア（無血清および無酵素の使用量）とのNSCに基づいて標準化されたin vitroで EMTモデル系は、提示されています。このモデル系は、EMTの作業科学者のための関連性です。カタツムリ、ゼブとツイストのタンパク質ファミリーは、両方の開発や病....
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プロトコル
すべての動物の手順は、「実験動物の管理と使用に関する指針」（NIH出版、 第 8版、2011年）に続き、バーゼルの動物福祉委員会（動物の管理と使用に関するスイスのガイドライン）によって承認されました。このガイドラインによって、動物プロトコルは「最低動物の重症度グレード」を考えられています。
拡大培地の調製
注：組織培養のための標準として、無菌状態での作業。
- 2 15ミリリットルのチューブに乗り、およびL-グルタミンを含まないDMEM / F12の5ミリリットルを追加（1：1）500ミリリットル中瓶から2 15ミリリットルのチューブのそれぞれに。最初の15 mlチューブに、50mgのヒトアポトランスフェリン、プトレシン1 Mストック（0.1mMの最終濃度）の50μlのナトリウムセレン、500μMストック（最終濃度30 nM）を30μlのを追加します。
- 元のDMEM / F12瓶に0.2μmのシリンジフィルターを通して濾過。
- 第15ミリリットルチューブに、12.5 mgのインスリンを追加します。加えます6から1 M NaOHを9滴。渦は、完全にインスリンを溶解します。元のDMEM / F12瓶に0.2μmのシリンジフィルターを通して濾過。
注：NaOHが有毒で腐食性です。保護手袋、コート、および安全ゴーグルを使用してください。 - DMEM / F12培地ボトルに5ミリリットルのペニシ....
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結果
このEMTモデル系は、単一の細胞として、または開発神経管の特定の領域、中央の皮質（ 図1および図 2）からの外植片の両方NSCの標準化された単離に基づいています。定量的評価のために、外植片を、500μmの格子培養皿（ 図3）の中央に右を播種しました。中央の皮質からの外植片は、第1の成長因子（ 表1）の異なる組合せでさらに2日間、続いて二日間FGF2に暴露しました。私たちは、発展途上の神経管の他の領域よりも大きい皮質から始まりました。我々は、BMP4で培養唯一の外植片が移動応答（ 表1と補足図2）を示したことを観察しました。
次ポドプラニン（PDPN）式が定義された条件の下で分析しました。 PDPNは貫通sであります複数.......
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ディスカッション
この研究でのNSCを用いたEMTの分析のための標準化されたシステムは、（ 補足図3にまとめた）に記載されています。標準化は、再現性（ 表1および2）を保証します。 NSCを現像皮質、通常はEMTを受けない組織に由来します。これは、EMTにおける初期段階の分析のために有利です。 EMTにおける最初のステップは、十分に遺伝的変化を蓄積してきたし、既にEMTの機能を採用していることが、腫瘍細胞で研究することはできません。ほとんどの悪性腫瘍が異種の侵襲性および非侵襲性細胞の両方を含有しているので、一次腫瘍サンプルは、EMTを理解することが理想的ではありません。提示されたプロトコルは、EMT誘導の初期段階を研究するための新規モデルとEMTの研究者を提供します。ここでは、ゼブとツイスト・ファミリーのキーEMT誘導因子が順次活性化されていることを示しています。最初の段階の間にZEB1とZEB2がアップレギュレートされ、第二段階Twist2中に（FigurE 6）。以前、我々はSnail1はすでにBMP4-暴露8の数時間後にアップ.......
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開示事項
著者らは、競合する金銭的利益はないと宣言している。
謝辞
研究は、MHSとAG（SNF IZLIZ3_157230）への助成金によってバーゼル科学財団の大学、スイス国立科学財団によってサポートされていました。私たちは感謝：博士タニアリナルディBurkatを寛大にインフラを提供するため。議論やコメントのBettlerグループのすべてのメンバー。我々は、フルHD MC170ビデオカメラ（ライカマイクロシステムズ、スイス）の専門的かつ有能なインストールのためのゲルハルトDorne（ライカマイクロシステムズ、スイス）をお願いいたします。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| BMP4, rhBMP4 | RnDシステム | 314-BP-01M | |
| ウシ膵臓インスリン | Sigma | I1882 | |
| ボイデンチャンバー、CytoSelect 細胞浸潤アッセイ | Cell Biolabs | CBA-110 | 24 ウェルプレートシステム |
| グリッド付き細胞培養ディッシュ | イビディ 500 mm ディッシュ、35 mm | 80156 | |
| CellMask Orange | Life Technologies | C10045 | 原形質膜染料、1:1,000 で使用。 |
| DAPI | LifeTechnologies | D1306 | 5 mg/mlで保存 1:10,000で使用。癌性。適切な保護具(手袋、コート、ゴーグル)が必要です。 |
| DMEM/F12 1:1 中瓶 | Gibco Invitrogen | 21331-020 | |
| FGF2, rhFGF2 | RnD Systems | 233-FB-01M | |
| フィブロネクチン、ウシ | Sigma | F4759 | |
| グルタマックスサプリメント | Gibco Invitrogen | 35050-061 | |
| ピクセル測定機能を備えたグラフィックソフトウェア | フィジー | fiji.sc/Fiji | バージョン2.0.0-rc-30 / 1.49s |
| HBSSメディア | シグマ | H9394 | |
| ヒト apo-Transferrin | Sigma | T1147 | 肺刺激性の可能性があります。吸入を避けてください。適切な保護を使用してください。 |
| L-グルタミン | Gibco Invitrogen | 25030-024 | |
| ネスチン、マウス抗ネスチン抗体 | Genetex | GTX26142 | 1:100、4% PFA 固定、Triton X100 0.1% |
| Olig2、ウサギ 抗 Olig2 抗体 | Hirohide 竹林 | 個人株 | 1:2,000、4% PFA 固定、Triton X100 0.1% |
| ペニシリン/ストレプトマイシン/ファンジゾン | Gibco Invitrogen | 15240-062 | |
| ポドプラニン、マウス抗ポドプラニン抗体 | アクリス | DM3614P | 1:250、4% PFA 固定で使用し、Triton X100 |
| Poly-L-ornithine | Sigma | P3655 | |
| プトレシン | シグマ | P5780 | 皮膚と目を刺激します。適切な保護が必要です。 |
| 亜セレン酸ナトリウム | シグマ | S5261 | |
| Sox10、ウサギの抗Sox10抗体 | Millipore Chemicon | AB5774 | 使用、1:200、4%PFA固定、0.1% |
| TGFb1、rhTGFb1 | RnDシステム | 240-B-010 | |
| コーティングされていないペトリ皿 | Falcon Corning | 351029 |
参考文献
- Nieto, M. A. Epithelial-Mesenchymal Transitions in development and disease: old views and new perspectives. Int J Dev Biol. 53, 1541-1547 (2009).
- Sauka-Spengler, T., Bronner-Fraser, M. A gene regulatory network orchestrates neural crest formation.
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再版と許可
