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方法論記事

創薬に適していEMT調査のための酵素および無血清神経幹細胞培養モデル

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DOI:

10.3791/54018

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2016年8月23日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Dept. of Biomedicine, Pharmacenter, University of Basel, 2Molecular Signalling and Gene Therapy, Narayana Nethralaya Foundation, Narayana Health City, 3Brain Ischemia and Regeneration, Department of Biomedicine, University Hospital Basel, 4Department of Neurosurgery, Klinikum Idar-Oberstein, 5Department of Neurosurgery and Institute for Stem Cell Biology and Regenerative Medicine, Stanford University, 6Department of Neurology, Laboratory of Molecular Neuro Oncology, University Hospital of Zurich

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

上皮から間葉への移行(EMT)は、癌が浸潤性になることを可能にします。EMTを調査するために、血清と酵素を欠いた神経幹細胞(NSC)ベースのinvitroモデルが記載されています。この標準化されたシステムにより、細胞遊走、遺伝子およびタンパク質発現の定量的および定性的な評価が可能になります。創薬に適したモデルです。

要約

間葉移行（EMT）に上皮は、上皮が間葉への分化転換のプロセスについて説明します。 EMTはまた、一般的に最も頻度の高い悪性脳腫瘍、神経膠芽腫で発生胚発生時の基本的な過程です。 EMTは、乳癌、肺癌、大腸癌、胃癌などの脳外の複数の癌において観察されています。 EMTは中心部に移動、浸潤や転移形成を促進することにより、悪性腫瘍にリンクされています。 EMT誘導のメカニズムは完全には理解されていません。ここでは、皮質の神経幹細胞（NSC）の標準化された単離およびその後のEMT誘導のためのin vitroの系を記述しています。このシステムは、単一細胞または移植片培養のいずれかを使用するための柔軟性を提供します。このシステムでは、ラットまたはマウス胚前脳NSCは、定義された培地で培養し、血清酵素を欠いています。 NSCはOLIG2及びSOX10、oligodendrocで観察された2つの転写因子を発現しましたYTE前駆細胞（OPCの）。このシステムを使用して、ZEB1、ZEB2、およびTwist2を含むFGF-、BMP-とTGFβシグナル伝達の間の相互作用は相乗BMP-/TGFβ-相互作用を示唆し、TGFβ活性化大幅に強化された細胞遊走を観察しました。結果は、FGF-、BMP-のネットワークを指し、EMTの誘導および維持に関与することがTGFβシグナリング。このモデル系は、in vitroで EMTを調査するために適切です。これは、コスト効率で、高い再現性を示しています。また、それらの移動応答（定量的な距離測定）に対する異なる化合物の比較を可能にし、EMTを阻害または増強する化合物のハイスループットスクリーニング（定性的測定）。モデルは、したがって、EMTに影響を与える物質の薬物ライブラリをテストするのに適しています。

概要

胚発生のいくつかの段階では、上皮細胞は互いに（ 例えば、タイトジャンクション）への強い接着性を失い、間葉移行（EMT）に上皮と呼ばれるプロセスで渡り鳥の表現型を獲得する1。 EMTは、間葉系、神経堤細胞のような追加の細胞型、神経上皮2から分離する集団の形成に必要とされます。 EMTは、胚の段階ではないだけに不可欠であるだけでなく、創傷治癒3および中枢神経系（CNS）病変4脱髄における再生などの成体生物における生理学的プロセスを、維持するために、成人期の後の段階で必要。

上皮性腫瘍は、最終的に癌の進行1,3につながる、移動、浸潤や転移の開始段階として、EMTを再活性化することが知られています。 EMTは確かに集中強いマイグレーション1,3にリンクされています。 Cのセルラーステップonditioning、開始受けるとEMTを維持することは十分に理解し、さらなる調査を必要としていません。

ここでは、定義された成長因子とメディア（無血清および無酵素の使用量）とのNSCに基づいて標準化されたin vitroで EMTモデル系は、提示されています。このモデル系は、EMTの作業科学者のための関連性です。カタツムリ、ゼブとツイストのタンパク質ファミリーは、両方の開発や病気1におけるEMTのために重要であることが示されています。カタツムリ、ゼブとツイスト家族も提示システムに関与しています。システムは、通常、EMTは、EMT誘導中の初期の事象の研究のために特別な利点を提供受けない前脳の特定の領域に基づいています。

このようなカタツムリ、ゼブとツイストタンパク質などのキーEMT誘導剤は、また、CNS外の組織・システムにおけるEMT中に発見されているので、モデルシステムは、潜在的に、CNS外の上皮にEMTを研究するために適用することができます。このモデルのystemは、一般、特にEMTにおける幹細胞の機能を研究するために開発皮質からNSCの標準化された単離を可能にします。このシステムを使用して、我々は、NSCを単離し、誘導されるEMTとFGF2及びBMP4の影響下で、その後の移行を検討しました。そこで我々は、モデル系の検証、FGF-およびBMPシグナリングは、細胞遊走を促進するTGFβシグナル伝達と相互作用することを観察しました。

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プロトコル

すべての動物の手順は、「実験動物の管理と使用に関する指針」（NIH出版、 第 8版、2011年）に続き、バーゼルの動物福祉委員会（動物の管理と使用に関するスイスのガイドライン）によって承認されました。このガイドラインによって、動物プロトコルは「最低動物の重症度グレード」を考えられています。

拡大培地の調製

注：組織培養のための標準として、無菌状態での作業。

  1. 2 15ミリリットルのチューブに乗り、およびL-グルタミンを含まないDMEM / F12の5ミリリットルを追加（1：1）500ミリリットル中瓶から2 15ミリリットルのチューブのそれぞれに。最初の15 mlチューブに、50mgのヒトアポトランスフェリン、プトレシン1 Mストック（0.1mMの最終濃度）の50μlのナトリウムセレン、500μMストック（最終濃度30 nM）を30μlのを追加します。
    1. 元のDMEM / F12瓶に0.2μmのシリンジフィルターを通して濾過。
  2. 第15ミリリットルチューブに、12.5 mgのインスリンを追加します。加えます6から1 M NaOHを9滴。渦は、完全にインスリンを溶解します。元のDMEM / F12瓶に0.2μmのシリンジフィルターを通して濾過。
    注：NaOHが有毒で腐食性です。保護手袋、コート、および安全ゴーグルを使用してください。
  3. DMEM / F12培地ボトルに5ミリリットルのペニシリン（10,000単位/ ml）/ストレプトマイシン（万/ mlの）/アンホテリシンB（25μg/ ml）を追加します。
  4. 200 mMのL-グルタミン解凍したての株式またはDMEM / F12培地ボトルにグルタミン（200mMのL-アラニル-L-グルタミンジペプチド）を含むオリゴペプチドの5ミリリットルを追加します。
  5. よくまぜろ。 50ミリリットルのアリコートを準備します。
    注：増殖培地は4℃​​で少なくとも2週間保存することができます。等分し、チューブは500ミリリットル瓶に保管媒体に比べて少ないのpH変化を示します。

継代培地の調製

  1. 1 LのCa 2 +へ-およびMg 2+を含まないHBSSメディア、990.85 mgのグルコース（5mMの最終濃度）と840.10ミリグラムのNaHCO 3を追加（10mMの最終濃度）。塩酸（1 Mストック）でpHを7.3に調整します。フィルタは、0.2μmのフィルターで滅菌し、50ミリリットルのアリコートを作ります。
    注：継代培地を、4℃で少なくとも4週間保存することができます。

成長因子の調製

  1. 単独の1％BSA（PBS-BSA）または4 mMの（PBS-BSA-塩酸）での塩酸（HCl）で滅菌1×PBSを準備します。
    注意：HClは腐食性や毒性があり、特別な安全対策（コート、ゴーグル、手袋、フード）が必要です。
  2. ディゾルブPBS-​​BSA最終ミリリットル（10 ngの/でPBS-BSA（最終濃度10ng / ml）、10 / mlの組換えヒト骨形成タンパク質4（rhBMP4）中10μg/ mlの組換えヒト線維芽細胞増殖因子2（rhFGF2） PBS-BSA-HCl中1（rhTGFβ1をβ濃度）、および20μg/ mlの組換えヒトトランスフォーミング成長因子）（40 ngの/ mlの最終濃度）。
    1. 滅菌フィルターをかけません。アリコートを準備します。
      注：成長因子のアリコートで保存することができます-20°Cのために少なくとも2年。

細胞培養皿の4コーティング

  1. 250X PLOの株式を準備するために1875 mgのポリ-L-オルニチン500ミリリットル中（PLO）蒸留H 2 Oに溶解します。フィルタは、0.2μmシリンジフィルターを用いて滅菌し、2ミリリットルのアリコートを作ります。
    注：これらのアリコートは、少​​なくとも2年間、-20℃で保存することができます。
  2. 1,000倍フィブロネクチンの株式を準備するために1ミリリットルの滅菌蒸留H 2 O中に1mgのウシフィブロネクチンを溶解させます。これは粘着性のタンパク質を凝固することができるようにボルテックスしないでください。 10分間手で優しく振ります。
    1. 時々振盪しながら室温で1時間インキュベートします。完全な溶解を確認してください。フィブロネクチンの完全な溶解のため37℃未満への解決策を温めます。フィルターに滅菌しないでください。
      注：溶液を6ヶ月まで4℃で保存してもよいです。
  3. 必要なプラズマ前処理プラスチック細胞培養皿（100mm以下、他のサイズを使用します実験）。移行を評価するために、500ミクロンのグリッドに35mm皿を使用しています。 5％CO 2組織培養インキュベーター中で37℃で12時間、2ミリリットルの1x PLOで一晩皿をインキュベートします。 2ミリリットル1×PBSで2回洗浄します。
  4. 2ミリリットルの1xフィブロネクチン（1 / mlの最終濃度）を加え、5％CO 2インキュベーター内で37℃で12時間の最小値のために料理をインキュベートします。ちょうど細胞をプレーティングする前に、フィブロネクチンを削除してください。
    注：フィブロネクチンでコーティングされた皿を37℃で少なくとも2週間保存することができます。

5.標準化解剖と皮質脳室下帯の調製（SVZ）

  1. ラット胎生14.5（E14.5、スプラーグ - ドーリー）およびマウスE13.5（C57BL / 6）時限交配することにより胚を得ます。 8時00翌朝まで18時00分から動物をメイト。交尾の翌日正午はE0.5と考えられています。
  2. 5％イソフルランおよび0.8リットル/分の酸素流量で妊娠動物を麻酔。シャープディスと足の圧縮による応答を確認してくださいection鉗子。動物を首を切ります。 CO 2としてCO 2窒息を避ける細胞の回復を幹に影響します。
  3. 帝王切開により胚を取得します。
    1. 仰臥位で動物を置き、70％エタノールで毛皮を消毒します。子宮上記の下腹部に約8cmのV字状の皮膚切​​開を作るために手術用鉗子とハサミを使用してください。無傷の筋肉の壁を維持したまま毛皮を持つ唯一の皮膚を切開。
    2. 腹膜を入力して筋肉や腹部の筋肉壁を切開するために、新鮮な鉗子やハサミを使用してください。
    3. 下後方腹膜に子宮を識別します。周囲の組織からの鋭い分離により子宮を削除します。
    4. 氷冷1×PBS中の滅菌1×PBSで胚および場所で子宮を洗ってください。
    5. （3X倍率、 図1B）解剖顕微鏡下で胚によって胚を解放するために子宮壁を開くために、先の細いハサミを使用してください。 （胚性外皮を除去するために、ピンセットを使用してください図1B）。氷上で拡大培地中で胚を保管してください。
    6. 開発ラット神経系5のアトラスによって正しい発達段階を確認します。適切な胚のサイズは、 図1Bに示されています。
    7. 図1（a）に示すように 、ラットの前肢（FL）で桁の形成を開始するの存在によって、さらに正確な年齢を確認してください。
      注：後肢（HL）はまだ桁の分離（ 図1B）を表示しません。
  4. 解剖のために、氷冷1×PBSで満たされたコーティングされていないペトリ皿に胚を移します。オートクレーブ処理細かい鉗子を使用して（20X倍率3X）ステレオ解剖顕微鏡下で解剖を行います。
    注：ペトリ皿は、プラズマコーティングされた細胞培養皿で起こり得るように食器表面への組織の付着を防止します。先鋭化タングステン線の針または類似のも解剖の特定のステップのために有用です。
  5. INTEから始まる頭皮と頭蓋骨を削除します開発神経管（ 図1C）へのアクセスを獲得するために、2つの鉗子で前方と後方に同時に引いて、開発終脳（TEL）と間脳（DI）（ 図1B）のrsection。
  6. 菱脳から中脳（MES）を分離、中脳後脳境界（MHB、 図1B-Dの黒矢じり）を特定します。ちょうどMHB（ 図1D、三角矢印）で、以下に菱脳をカット。
    注：MHBでの追加の皮下スペースが神経管を傷つけることなく皮膚の除去を容易にします。
  7. 顔面骨格（ 図1E）と頭蓋底で終脳/間脳の間の接続を切断。これは、終脳、間脳と中脳（TEL-DI-MES）（ 図1F-H）を含むブロックになります。
  8. 氷の上で増殖培地にTEL-DI-MESブロックを転送します。 completそれを保ちますエリーコーティングされていないペトリ皿に増殖培地でカバー。 NSCを持つ皮質SVZが含まれている終脳に触れないようにピンセットで脳のブロックを保持します。
  9. 繰り返して、すべての胚（ 図1F-H）で5.5 5.8にステップ。
  10. 1 TEL-DI-MESを移し、新鮮な氷のように冷たい1×PBSにブロックします。 図1Iに示すように、間脳から脳を分離し、前脳（ 図1F-H）の点線に沿って切断。
  11. 図1Fの点線に沿って切断することにより、TELからDIを区切ります。 図1Jで孤立した終脳を参照してください。
  12. 図1Jの点線に沿って切断し、2終脳半球を分割します。 図1Kに示すように、これは、2つの別々の半球になります。
    注：左半球は、図1Lに拡大されます。
  13. 内側ギャングを特定将来の孔のinterventriculareを通して見えるlionic隆起（MGE、 図2（a）;; *）と横神経節隆起（+ LGE、 図2A）。
    1. 鉗子または針を使用して、MGE及びLGEと前部皮質（アリ-CTX、 図2B）との交差部分に直線に沿って詳細に分析。皮質、海馬（ヒップ）と脈絡叢（CP）を介して直線をカットします。これは、神経節隆起から嗅球（OB）を含む前部皮質分離（GEを、 図2（b）、C は 図 ）。
  14. 再び大脳皮質、海馬と脈絡叢を切断、尾側神経節隆起（CGE、 図2C、D）と後部皮質（ 図2C）の交差点で第2の直線をカットします。
  15. 終脳を平ら。完全に後極と嗅球（ 図2D）を削除。識別する以前に6,7定義されるように、海馬と脈絡叢（ 図2C）を含む皮質裾。
    注：海馬は大脳皮質よりも薄い神経上皮を持っています。 CPは赤い血管を含んでいます。
    1. 神経節隆起（ 図2D）の大きさと同じ皮質の大きさを残して、皮質から皮質裾を区切ります。これは、皮質（標的組織）および神経節隆起（GE、 図2D）のブロックになります。
  16. 皿表面に心室（内側）側で皮質-GEブロックを反転します。
    注：半球の外側表面は、実験者（ 図2E）が直面するだろう。外面に血管を含む髄膜（ 図2E）です。
    1. 左手で皿表面にGEをピンと右（支配的）手（ 図2Fにピンセットで髄膜をはがし）。
      注：髄膜が強く皮質に付着するので、これは技術的に最も要求の厳しいステップです。皮質からの髄膜の分離は、ステップ5.13.1および5.14で完全に直線（ギザギザではない）を切断することによって促進されます。
  17. 繰り返して、他の半球とすべての胚のために5.16に5.12を繰り返します。 LGE（ 図2G、2H）の半分主直径の距離でLGEに沿って皮質をカット。解剖皮質1.2ミリメートル×2.4ミリメートル（ 図2H）の領域にまたがり、NSCを持つSVZ /胚層を含みます。

体外培養物の6.準備

  1. 400μm未満の直径（ 図2I）の外植片に皮質をカット。参照（ 図2Hおよび2I）のための解剖ペトリ皿の下に配置さ400μmのグリッド（ 補足図1）を使用します。氷 - コ新鮮なペトリ皿にすべての外植片を移しLD増殖培地。
  2. 組織培養皿（ステップ4.4）からフィブロネクチンを削除します。それが乾燥することができます。 X 10ミリメートル10ミリメートル（ 図3）の格子寸法の35mm皿の中央にコールド拡大培地の1ミリリットルを追加します。媒体は球状のドロップ（ 図3）を形成することを可能にします。
  3. ドロップの中心に8外植まで挿入します。外植片は、理想的には、移行分析のために、互いの間に少なくとも3ミリメートルの距離（セクション8を参照）で、グリッド上に配置する必要があります。
  4. 外植片の付着のための細胞培養インキュベーター（37℃、21％O 2、5％CO 2）中で約1時間、皿をインキュベートします。外植片が沈降し、フィブロネクチンでコーティングされた表面に付着することを可能にします。外植片を切断し、最適なグリッド・センターの外に移動することができるので、料理を振らないでください。
  5. 1時間のインキュベーション後（37℃、21％O 2、5％CO 2）、2mLの膨張媒体の全体積プラス成長fに皿を埋めます俳優や興味のある物質がテストし、インキュベートします。
    注：どちらの酵素消化、また血清または遠心分離は、外植片の準備のために必要です。これは、細胞完全性のために最適です。

NSC単一細胞培養の7の準備

  1. 37℃での拡大と継代培地を温めます。
  2. 冷たい拡張媒体（チューブA）で15ミリリットルチューブに（ステップ5.17から）解剖皮質片を転送します。グラムのx 1200で5分間皮質片を遠心。上清を吸引除去します。皮質片を再懸濁するために、200μlの予め温めた増殖培地を追加します。
  3. P1,000チップ（チューブA）で15 mlチューブに予め温め継代培地700μlのを追加します。静かにペレットを再懸濁。 15ミリリットルチューブの底にチップを置きます。穏やかにゆっくりとP1,000チップで三回吸引することにより、組織片を解離します。
    注：培地を継代する細胞分離を促進し、酵素の使用を回避するために必要とされます。
  4. チューブが底に落ち着くまで大きい（重い）解離していない作品のために30〜60秒間静置します。シングル解離した細胞は、上清中に残ります。新鮮な15mlチューブ（チューブB）に上清の約700μLを移します。
  5. 繰り返しは、より大きな作品を解離するために7.3と7.4を繰り返します。
  6. 繰り返しは、7.3と7.4に、より大きな作品を解離するための第2の時間を繰り返します。新鮮な15mlチューブ（チューブB）にすべての上清を移します。
  7. 5ミリリットルの全体積に膨張媒体を追加します。血球計数器を用いて細胞を数えます。トリパンブルー染色により死細胞を評価します。
    注：小さなNSCは、より大きな細胞よりも7.2〜7.6、より良いステップに耐えます。 10胚から10％死んだ細胞で約4×10 6個の細胞を期待しています。
  8. NSCの拡張のために、8ミリリットルの増殖培地の体積で10センチ、フィブロネクチンでコーティングした組織培養皿あたり1.5×10 6細胞をプレー。標準的な拡張のために、1,000倍rhFGF2の株式の8μlを添加します。毎日8μlのrhFGF2を追加して、私を変更直径一日おきに。
    注：この発達段階での皮質は、NSCの大半と分化した細胞の少数のみが含まれています。分化した少数の細胞がrhFGF2、治療に反応し、増殖培養中に死ぬことはありません。
  9. 通路が60％コンフルエンスでのNSCを拡大しました。
    1. 通路のNSCに、拡大培地を除去します。 5ミリリットルの継代培地ですばやく3回細胞を洗浄。 4分 - 2を待ちます。 Ca 2+及びMg 2+細胞なしでゆっくり切り上げ、表面から切り離します。位相差顕微鏡下で細胞の脱離を確認してください。必要に応じて表面からの視覚的な剥離が観察されるまで、さらに数分待ちます。
      シングル細胞が完全に分離させますが、ほとんどの細胞がまだ皿表面に付着する：注意してください。剥離のために必要な期間は、フィブロネクチンコーティングの持続時間に依存しています。短いフィブロネクチンコーティング（12時間以下）がより速い細胞剥離をもたらします。長い実験のために（>; 1週間）以上24時間のフィブロネクチンコーティングが推奨されます。
  10. 軽く表面から細胞を分離するために10ミリリットルのピペットを使用してください。細胞と5ミリリットルの継代培地を収集し、新鮮な15mlチューブに移します。継代媒体の追加の5mlを繰り返します。
  11. チューブの底で10 mlのピ​​ペットを配置し、ピペッティングにより3回上下15mlチューブ中の細胞を解離します。室温で1200×gで15分間チューブをスピン。上清を除去し、2ミリリットルの増殖培地中でペレットを再懸濁します。血球計数器を用いて細胞を数えます。死細胞を評価するためにトリパンブルーを使用してください。
    注： -約10％で、死細胞数で5×10 6細胞の60％コンフルエンスに拡大した後、4を期待しています。
  12. プレートさらなる継代のため10cmディッシュあたり8×10 5個の細胞。

8.移行アセスメント

  1. 移行評価のために、外植片で第5シードに応じた外植片を分離35ミリメートルグリッド料理。一時間めっき後、FGF2（rhFGF2）を追加します。 2日間37℃のインキュベーターに皿を置きます。
    注：最適な植片の添付ファイルの場合は、お皿を移動せずに済みます。
  2. 千μlのヒントにメディアを削除します。千μlの先端内側の円で開始する（ 図3）により拡大培地の2ミリリットルを追加します。これは、外植片での表面張力を低下させます。
  3. 実験のために、必要に応じて、単独または組み合わせでの成長因子を加えます。陽性対照としてFGF2 / BMP4 /TGFβ1を使用してください。注：この実験では、35ミリメートル皿当たり2μlのFGF2、2μlのBMP4および4μlのTGFβ1は、単独および組み合わせ（ 図5）で追加されました。
    1. 追加の因子および/またはテスト可能な物質を追加します。 37℃で2日間再び手付かずの料理をしてください。
  4. 倒立顕微鏡で外植片の写真を撮ります。
    注意：リビング植片が固定された細胞よりも優れた位相コントラスト画像が得られます。両方を使用することができます。
  5. 移行のためのアセスメント、ピクセルの測定を可能にするグラフィックスソフトウェア（ 例えば 、フィジー8）を使用します。
  6. ピクセル単位で500μmの距離の皿のグリッドを測定し、内部基準として使用します。
  7. 移動開始点として植片の中心を定義します。外植片の中心部と10個の細胞の最も外側のグループ間の距離を測定します。
    注：すべての細胞は遠心離れて外植片から移行します。彼らは自発的に（ 図5）は、試験した状況下で周囲にシートを形成します。

9.侵攻評価

  1. 議定書の第4節に従って、フィブロネクチンでコーティングされた組織培養24ウェルプレートを準備します。
  2. 細胞浸潤チャンバーの上部ウェルに暖かい増殖培地を300μlを置きます。 37℃で30分間、チャンバーをインキュベートし、5％CO 2。
  3. トップウェルから増殖培地を取り出して、コーティングした24ウェルプレートにBoydenチャンバーを配置。
  4. 50を追加します。ウェル底に0.5 rhFGF2μlの0.5μlのrhBMP4と暖かい増殖培地の0μlの。
  5. 通路のNSC 1〜4項7に通路を説明したようにカウントが適しています。
  6. プレートrhFGF2の0.3μlのボイデンチャンバーの上部ウェル内rhBMP4の0.3μlの温かい拡大培地300μlの容量で、5×10 5個の細胞。
  7. 文化24時間播種したNSC。
  8. 別の48時間室や文化に細胞をさらなる因子および/またはテスト可能な物質を追加します。
    注：細胞は侵襲性である場合、それらは十分に下に基底膜層を通ってウェル上から通過します。侵襲性の細胞はBoydenチャンバーの底に固執します。
  9. 製造業者によって提供されたプロトコルに従ってください。二回洗浄することにより、上部ウェル中の非侵襲性細胞を除去するために（浸潤アッセイキットに含まれる）綿棒を使用してください。
  10. ウェルから培地を除去し、と500μlの増殖培地を追加生きている細胞について、ウェルに核色素DAPIで形質膜染色。
  11. 37℃で10分間、5％CO 2インキュベートします。
    注：染料は、最適な可視化の8のために、それぞれ、膜および浸潤細胞の核内に統合されます。オプション：多色免疫細胞化学が計画されている場合は、原形質膜色素を省略します。
  12. 染料でメディアを取り外し、拡張培地で2回洗浄します。以前に8示されているように倒立蛍光顕微鏡を用いて、侵襲性細胞を可視化し、カウントされます。
    注：一部の侵襲性の細胞は、チャンバの底部から剥離している可能性があり、それらがコーティングされた表面に付着する場所の下ウェル表面に落ちてきました。完全な分析のためにウェル表面で細胞が含まれます。
  13. 培地を除去し、10分間氷冷新鮮な4％PFAで細胞を固定。 1×PBSで洗浄3倍。以前8-10に記載されているように 、侵襲性細胞上の免疫組織化学を実行します。

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結果

このEMTモデル系は、単一の細胞として、または開発神経管の特定の領域、中央の皮質（ 図1および図 2）からの外植片の両方NSCの標準化された単離に基づいています。定量的評価のために、外植片を、500μmの格子培養皿（ 図3）の中央に右を播種しました。中央の皮質からの外植片は、第1の成長因子（ 表1）の異なる組合せでさらに2日間、続いて二日間FGF2に暴露しました。私たちは、発展途上の神経管の他の領域よりも大きい皮質から始まりました。我々は、BMP4で培養唯一の外植片が移動応答（ 表1と補足図2）を示したことを観察しました。

次ポドプラニン（PDPN）式が定義された条件の下で分析しました。 PDPNは貫通sであります複数...

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ディスカッション

この研究でのNSCを用いたEMTの分析のための標準化されたシステムは、（ 補足図3にまとめた）に記載されています。標準化は、再現性（ 表1および2）を保証します。 NSCを現像皮質、通常はEMTを受けない組織に由来します。これは、EMTにおける初期段階の分析のために有利です。 EMTにおける最初のステップは、十分に遺伝的変化を蓄積してきたし、既にEMTの機能を採用していることが、腫瘍細胞で研究することはできません。ほとんどの悪性腫瘍が異種の侵襲性および非侵襲性細胞の両方を含有しているので、一次腫瘍サンプルは、EMTを理解することが理想的ではありません。提示されたプロトコルは、EMT誘導の初期段階を研究するための新規モデルとEMTの研究者を提供します。ここでは、ゼブとツイスト・ファミリーのキーEMT誘導因子が順次活性化されていることを示しています。最初の段階の間にZEB1とZEB2がアップレギュレートされ、第二段階Twist2中に（FigurE 6）。以前、我々はSnail1はすでにBMP4-暴露8の数時間後にアップ...

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開示事項

著者らは、競合する金銭的利益はないと宣言している。

謝辞

研究は、MHSとAG（SNF IZLIZ3_157230）への助成金によってバーゼル科学財団の大学、スイス国立科学財団によってサポートされていました。私たちは感謝：博士タニアリナルディBurkatを寛大にインフラを提供するため。議論やコメントのBettlerグループのすべてのメンバー。我々は、フルHD MC170ビデオカメラ（ライカマイクロシステムズ、スイス）の専門的かつ有能なインストールのためのゲルハルトDorne（ライカマイクロシステムズ、スイス）をお願いいたします。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
BMP4, rhBMP4RnDシステム 314-BP-01M
ウシ膵臓インスリンSigma I1882
ボイデンチャンバー、CytoSelect 細胞浸潤アッセイCell BiolabsCBA-11024 ウェルプレートシステム
グリッド付き細胞培養ディッシュイビディ 500 mm ディッシュ、35 mm80156
CellMask OrangeLife TechnologiesC10045原形質膜染料、1:1,000 で使用。
DAPILifeTechnologiesD13065 mg/mlで保存 1:10,000で使用。癌性。適切な保護具(手袋、コート、ゴーグル)が必要です。
DMEM/F12 1:1 中瓶Gibco Invitrogen21331-020
FGF2, rhFGF2RnD Systems233-FB-01M
フィブロネクチン、ウシSigma F4759
グルタマックスサプリメント Gibco Invitrogen 35050-061
ピクセル測定機能を備えたグラフィックソフトウェアフィジーfiji.sc/Fijiバージョン2.0.0-rc-30 / 1.49s
HBSSメディアシグマ H9394
ヒト apo-TransferrinSigmaT1147肺刺激性の可能性があります。吸入を避けてください。適切な保護を使用してください。
L-グルタミンGibco Invitrogen 25030-024
ネスチン、マウス抗ネスチン抗体GenetexGTX261421:100、4% PFA 固定、Triton X100 0.1%
Olig2、ウサギ 抗 Olig2 抗体Hirohide 竹林個人株1:2,000、4% PFA 固定、Triton X100 0.1%
ペニシリン/ストレプトマイシン/ファンジゾンGibco Invitrogen 15240-062
ポドプラニン、マウス抗ポドプラニン抗体アクリスDM3614P1:250、4% PFA 固定で使用し、Triton X100
Poly-L-ornithineSigmaP3655
プトレシンシグマ P5780皮膚と目を刺激します。適切な保護が必要です。
亜セレン酸ナトリウムシグマ S5261
Sox10、ウサギの抗Sox10抗体Millipore ChemiconAB5774使用、1:200、4%PFA固定、0.1%
TGFb1、rhTGFb1RnDシステム240-B-010
コーティングされていないペトリ皿Falcon Corning351029
を避けてください。ででTriton X100

参考文献

  1. Nieto, M. A. Epithelial-Mesenchymal Transitions in development and disease: old views and new perspectives. Int J Dev Biol. 53, 1541-1547 (2009).
  2. Sauka-Spengler, T., Bronner-Fraser, M. A gene regulatory network orchestrates neural crest formation. Nat Rev Mol Cell Biol. 9, 557-568 (2008).
  3. Barriere, G., Fici, P., Gallerani, G., Rigaud, M. Mesenchymal Transition: a double-edged sword. Clin Transl Med. 4, 14(2015).
  4. Zawadzka, M., et al. CNS-resident glial progenitor/stem cells produce Schwann cells as well as oligodendrocytes during repair of CNS demyelination. Cell Stem Cell. 6, 578-590 (2010).
  5. Paxinos, G., Ashwell, K. W. S., Törk, I. Atlas of the developing rat nervous system. , 2nd edn, Academic Press. (1994).
  6. O'Leary, D. D., Chou, S. J., Sahara, S. Area patterning of the mammalian cortex. Neuron. 56, 252-269 (2007).
  7. O'Leary, D. D., Sahara, S. Genetic regulation of arealization of the neocortex. Curr Opin Neurobiol. 18, 90-100 (2008).
  8. Sailer, M. H., et al. Non-invasive neural stem cells become invasive in vitro by combined FGF2 and BMP4 signaling. J Cell Sci. 126, 3533-3540 (2013).
  9. Sailer, M. H., et al. BMP2 and FGF2 cooperate to induce neural-crest-like fates from fetal and adult CNS stem cells. J Cell Sci. 118, 5849-5860 (2005).
  10. Sailer, M., Oppitz, M., Drews, U. Induction of cellular contractions in the human melanoma cell line SK-mel 28 after muscarinic cholinergic stimulation. Anat Embryol (Berl). 201, 27-37 (2000).
  11. Wicki, A., Christofori, G. The potential role of podoplanin in tumour invasion. Br J Cancer. 96, 1-5 (2007).
  12. Wicki, A., et al. Tumor invasion in the absence of epithelial-mesenchymal transition: podoplanin-mediated remodeling of the actin cytoskeleton. Cancer Cell. 9, 261-272 (2006).
  13. Mishima, K., et al. Increased expression of podoplanin in malignant astrocytic tumors as a novel molecular marker of malignant progression. Acta Neuropathol. 111, 483-488 (2006).
  14. Motomura, K., et al. Immunohistochemical analysis-based proteomic subclassification of newly diagnosed glioblastomas. Cancer Science. 103, 1871-1879 (2012).
  15. Kono, T., et al. Immunohistochemical detection of the lymphatic marker podoplanin in diverse types of human cancer cells using a novel antibody. Int J Oncol. 31, 501-508 (2007).
  16. Raica, M., Cimpean, A. M., Ribatti, D. The role of podoplanin in tumor progression and metastasis. Anticancer Res. 28, 2997-3006 (2008).
  17. Panchision, D. M., McKay, R. D. The control of neural stem cells by morphogenic signals. Curr Opin Genet Dev. 12, 478-487 (2002).
  18. Lamouille, S., Xu, J., Derynck, R. Molecular mechanisms of epithelial-mesenchymal transition. Nat Rev Mol Cell Biol. 15, 178-196 (2014).
  19. Gonzalez-Perez, O., Alvarez-Buylla, A. Oligodendrogenesis in the subventricular zone and the role of epidermal growth factor. Brain Res Rev. 67, 147-156 (2011).
  20. Hu, J. G., et al. PDGF-AA mediates B104CM-induced oligodendrocyte precursor cell differentiation of embryonic neural stem cells through Erk, PI3K, and p38 signaling. J Mol Neurosci. 46, 644-653 (2012).
  21. Galvao, R. P., et al. Transformation of quiescent adult oligodendrocyte precursor cells into malignant glioma through a multistep reactivation process. Proc Natl Acad Sci U S A. 111, E4214-E4223 (2014).
  22. Liu, C., et al. Mosaic analysis with double markers reveals tumor cell of origin in glioma. Cell. 146, 209-221 (2011).
  23. Das, S., Srikanth, M., Kessler, J. A. Cancer stem cells and glioma. Nat Clin Pract Neurol. 4, 427-435 (2008).
  24. Modrek, A. S., Bayin, N. S., Placantonakis, D. G. Brain stem cells as the cell of origin in glioma. World J Stem Cells. 6, 43-52 (2014).
  25. Sampetrean, O., et al. Invasion precedes tumor mass formation in a malignant brain tumor model of genetically modified neural stem cells. Neoplasia. 13, 784-791 (2011).
  26. McNeill, R. S., et al. Modeling astrocytoma pathogenesis in vitro and in vivo using cortical astrocytes or neural stem cells from conditional, genetically engineered mice. JoVE. , e51763(2014).
  27. Lara-Padilla, E., Caceres-Cortes, J. R. On the nature of the tumor-initiating cell. Curr Stem Cell Res Ther. 7, 26-35 (2012).
  28. Busch, C., et al. BMP-2-dependent integration of adult mouse subventricular stem cells into the neural crest of chick and quail embryos. J Cell Sci. 119, 4467-4474 (2006).
  29. Thiery, J. P., Acloque, H., Huang, R. Y., Nieto, M. A. Epithelial-mesenchymal transitions in development and disease. Cell. 139, 871-890 (2009).
  30. McDonald, O. G., Wu, H., Timp, W., Doi, A., Feinberg, A. P. Genome-scale epigenetic reprogramming during epithelial-to-mesenchymal transition. Nat Struct Mol Biol. 18, 867-874 (2011).
  31. Rahimi, R. A., Leof, E. B. TGF-beta signaling: a tale of two responses. J Cell Biochem. 102, 593-608 (2007).
  32. Xu, J., Lamouille, S., Derynck, R. TGF-beta-induced epithelial to mesenchymal transition. Cell Res. 19, 156-172 (2009).
  33. Suva, M. L., Riggi, N., Bernstein, B. E. Epigenetic reprogramming in cancer. Science. 339, 1567-1570 (2013).
  34. Sullivan, R., et al. A possible new focus for stroke treatment - migrating stem cells. Expert Opin Biol Ther. , 1-10 (2015).

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