腫瘍微小環境におけるリアルタイム多細胞ダイナミクスの拡張タイムラプス生体内イメージング

サマリー

このプロトコルは、単一細胞の解像度で、生体内で 、リアルタイムで多細胞相互作用の延長タイムラプスイメージングを実行するための多光子顕微鏡の使用を記載しています。

要約

腫瘍微小環境では、宿主間質細胞が腫瘍細胞と相互作用して、腫瘍の進行、血管新生、腫瘍細胞の播種、転移を促進します。腫瘍微小環境における多細胞相互作用は、指向性腫瘍細胞の運動性や血管透過性などの一過性の事象を引き起こす可能性があります。 腫瘍の血管透過性の定量化では、血管色素の血管外漏出を測定するためにエンドポイント実験が頻繁に使用されてきました。しかし、多細胞相互作用と血管透過性の一時的な性質のため、これらの動的事象の速度論は識別できません。細胞や血管系を注射用色素や蛍光タンパク質で標識することにより、高解像度のタイムラプス生体内顕微鏡法により、腫瘍微小環境における一過性の事象を直接、リアルタイムで可視化することが可能になりました。 ここでは、多光子顕微鏡を使用して、腫瘍微小環境の多細胞動態を直接視覚化するために、生きたマウスで拡張生体内イメージングを行う方法について説明します。 この方法では、細胞標識戦略、乳房皮膚フラップの外科的調製、尾静脈カテーテルによる注射用色素またはタンパク質の投与、およびタイムラプス画像の取得について詳しく説明します。この方法から得られるタイムラプス配列は、腫瘍微小環境における運動性および血管透過性の細胞イベントの動態の可視化および定量化を容易にする。

概要

プライマリ乳腺腫瘍からの腫瘍細胞の播種は、マクロファージおよび内皮細胞を含む間質細胞だけでなく、腫瘍細胞を含むが、ホストすることが示されています。さらに、腫瘍血管系は、透過性の増大¹で異常です。したがって、腫瘍細胞、マクロファージ及び内皮細胞が原発腫瘍微小環境における血管透過性と腫瘍細胞の血管内を媒介することがどのように相互作用するかを決定することは理解転移のために重要です。血管透過性の動態を理解すること、腫瘍微小環境における腫瘍細胞の血管内および多細胞相互作用の根底にあるシグナル伝達機構は、抗癌治療の開発および管理に重要な情報を提供することができます。

インビボでの腫瘍血管透過性を研究するための主要な手段は、エバンスブルー^2、高分子量デキストラン（155 kDaの）などの血管外色素の測定されています色素の注入後の一定の時点での³およびフルオロフォアまたは（アルブミンを含む）放射性トレーサー共役タンパク質^4。顕微鏡の進歩は、動物モデルおよび蛍光色素は生体顕微鏡⁵を介して細胞プロセスと生きた動物における血管透過性の可視化を有効にしています。

いくつかの時点にわたる静止画像の取得、または短い時間経過配列とライブ動物イメージングは、腫瘍微小環境^6,7の動的なイベントを完全に理解....

プロトコル

記載されているすべての手順は、医療制度動物実験委員会のアルバート・アインシュタイン大学の事前承認を含む、脊椎動物の使用のためのガイドラインと規則に従って行われなければなりません。

1.生成蛍光標識腫瘍および腫瘍関連マクロファージ

1. マウス乳腺腫瘍ウイルスの長い末端反復は、蛍光レポーターでトランスジェニックマウスを用いてポリオーマミドルT抗原（MMTV-PyMT）を駆動する自発的な、土着、遺伝子操作されたマウス乳腺癌モデル[ すなわち、強化緑色蛍光を交配することによって蛍光標識された腫瘍細胞を生成しますタンパク質（EGFP）、強化シアン蛍光タンパク質（ECFP）またはDendra2] ^8,9。
2. 骨髄性細胞とマクロファージ特異的蛍光の記者と遺伝子操作されたマウスモデルを交配することにより、蛍光標識された腫瘍細胞とPyMT動物における蛍光ラベルマクロファージ[ すなわち、MacGrEEN ¹⁵またはMacBlueマウスCSF1R -GAL4VP16 / UAS-ECFP ^16]。
3. あるいは、蛍光標識されたPyMT腫瘍細胞（同系）、ヒト乳癌細胞株または初代ヒト患者由来の腫瘍（異種移植片^）11,17の同所移植を介して蛍光標識された腫瘍を発生させます。
   1. インプラント蛍光蛍光標識された腫瘍細胞および骨髄細胞^13<....

結果

拡張タイムラプス生体顕微鏡は、腫瘍の微小環境における多細胞プロセスの単一細胞分解能イメージングを可能にします。蛍光標識腫瘍細胞、マクロファージ、血管領域、及び第二高調波発生信号を使用してコラーゲン繊維ネットワークを可視化することにより、腫瘍微小環境内の複数の区画を同時に撮像中に追跡されます。 Dendra2（ 図1A）で標識された乳腺腫瘍細胞を、MMTV-PyMT-Dendra2マウスにおいて行われたような蛍光タンパク質で標識された腫瘍細胞は、トランスジェニックマウスで生成することができます。 ECFPで標識されたマクロファージを持ってCSF1R -GAL4VP16 / UAS-ECFPのマウスを用いたこれらのトランスジェニックマウスを、交雑することによって、腫瘍細胞とマクロファージの両方がMMTV-PyMTマウスでラベル付けされています。腫瘍細胞およびマクロファージの二重標識方式で2つのセルタイプの直接的な相互作用をリアルタイムで可視化することができる（ 図1A）。また、GFPを形質導.......

ディスカッション

腫瘍微小環境で自然に発生する細胞間相互作用は、腫瘍細胞の運動性と血管内に変化をもたらすことができます。生きた腫瘍組織の高解像度の生体内イメージングは、非常に過渡^10,13,24であることができる多細胞ダイナミクスの可視化を可能にします。離散時間点で取得ビボアッセイまたはタイムラプス画像内のエンドポイントは、腫瘍微小環境内のプロセスの分子メカニズムに関する重要な情報を提供することができます。生体内イメージング研究は、血管新生、腫瘍細胞の遊走および薬物治療^25-30に対する応答に新たな洞察を生成し、数日間にわたって生じる腫瘍微小環境内のプロセスを研究するために使用されています。しかし、これらのアッセイは^、7,31を研究されているプロセスの時間スケールによる腫瘍微小環境における過渡事象の動態をキャプチャしない場合があります。一定のプロセスから複数の過渡事象を区別することは重要な広告です生体顕微鏡の見晴らしの良いです。

このプロトコルに記載生体イメージング技術は、複数の細胞系統および構造の.......

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
155 kDa デキストラン-テトラメチルローダミン イソチオシアネート	Sigma Aldrich	T1287	1x PBS で 20 mg/ml で再構成
70 kDa デキストラン-Texas Red	Life Technologies	D-1830	1x PBS で 10 mg/ml で再構成
10 kDa デキストラン-フルオレセインイソチオシアネート	Sigma Aldrich	FD10S 1x	PBS で 20 mg/ml で再構成
Qdot 705 ITK アミノ (PEG) 量子ドット	ライフ		Dilute 25 μ Q21561MP技術175 μのl。注射用1x PBSのl
MMTV-PyMTマウス	ジャクソン研究所	2374
Csf1r-ECFPマウス (Csf1r-Gal4/VP16,UAS-ECFP)	ジャクソン研究所	26051
Csf1r-EGFPマウス	ジャクソン研究所	18549
1x PBS	Life Technologies
Isoethesia (イソフルラン)	Henry Schein Animal Health	50033	250 ml
Oxygen	AirTech
1 ml シリンジ、ツベルクリン スリップ チップ	BD	309659
30 G x 1 (0.3 mm x 25  mm) ニードル	BD	305128
ポリエチレンマイクロ医療用チューブ	サイエンティフィック・コモディティーズ社	BB31695-PE/1	0.28 mm I.D. x 0.64 mm O.D.
顕微鏡カバーガラス	コーニング	2980-225	厚さ1.5、22 x 50 mm
PhysioSuite MouseSTAT パルスオキシメータ、ソフトウェア、センサー	ケント科学
研究所 テープ	フィッシャーサイエンティフィック	159015R
軟質ゴムパッド	マクマスターカー	8514K62	超軟質ポリウレタンフィルム、3/16インチ厚さ、12 "x 12"、40 OOデュロメータ、プレーンバック
硬質ゴムパッド	McMaster-Carr	8568K615	ネオプレンゴムシート1/4 "厚さ、12 "x 12"、50 デュロメータ
顕微鏡	オリンパス		顕微鏡は、オリンパスIX-71スタンドをベースに、20X 1.05NAの対物レンズを使用したカスタムメイドの2レーザー多光子顕微鏡です。
7パンチセット	McMaster-Carr	3429A12	1/4 "から1"穴径、ハンマー駆動穴パンチ用

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