方法論記事

分化運命の空間組織を探るためのヒト多能性幹細胞のステンシルマイクロパターニング

DOI：

10.3791/54097

⸱

2016年6月17日

 ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, National University of Singapore, 2Singapore Institute of Neurotechnology (SINAPSE), National University of Singapore

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ヒト多能性幹細胞（hPSCs）は差別化した別個の組織パターンに自己組織化するための固有の能力を持っています。これは、空間的な環境勾配の提示を必要とするが。我々はHPSC分化パターンを制御するための生化学的および機械的な勾配を生成するためのシンプルかつ堅牢な方法としてステンシル微細を提示します。

要約

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ヒト多能性幹細胞(hPSC)は、胚性幹細胞と人工多能性幹細胞を含み、3つの胚葉すべてに分化する固有の能力を持っています。これにより、再生医療や正常器官形成と疾患器官形成の実験的モデリングに魅力的な細胞源となっています。しかし、in vitroでのhPSCの分化は不均一であり、空間的に無秩序です。細胞マイクロパターニング技術は、幹細胞の微小環境を空間的に制御し、結果として生じる分化運命を組織化する手段を提供する可能性があります。hPSCのマイクロパターニングには、hPSCの生存と維持に関する厳しい要件を考慮する必要があります。ここでは、ステンシルマイクロパターニングをhPSCと高い親和性を持つ方法として説明します。hPSCマイクロパターンは、細胞ステンシルスルーホールの形状によって指定され、hPSCが下にある細胞外マトリックスコーティング基板にアクセスして付着できる場所を物理的に閉じ込めます。この動作モードにより、他の細胞マイクロパターニング法と比較して、hPSCを適切にサポートできる基質を使用する柔軟性が高くなります。また、hPSCマイクロパターンの生成を成功させるための重要なステップについても説明します。一例として、hPSCのステンシルマイクロパターニングを使用して、細胞-細胞および細胞-マトリックス接着の空間分極を調節し、それが中内胚葉の分化パターンを決定することができることを示します。このシンプルで堅牢な方法でhPSCをマイクロパターン化すると、初期胚発生における組織組織化とパターン形成を研究するための実験モデルを確立する可能性が広がります。

概要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

胚性幹細胞（hESC）と人工多能性幹細胞（hiPSCs）を含む、ヒト多能性幹細胞（hPSCs）は、広くすべての細胞系譜に、それらの分化能の正常および罹患器官の実験モデルならびに再生医療に利用されます三胚葉1,2。 hPSCsの分化運命は、物理的な手がかり3-5によって媒介される1と同様にメカノプロセスをシグナリングオートクリンまたはパラクリンを調節することができる地域の環境要因に対して非常に敏感です。セルの微細化は、空間的に、このような細胞-細胞相互作用6及び細胞-マトリックス相互作用を3として、局所的な細胞の微小環境を制御するための手段として、細胞集団の幾何学的形状と位置を整理するために開発された技術の集合を含みます。 hPSCsの文脈では、細胞は、微細ニッチ依存する方法に重要な洞察を得るために使用されていますENT自己分泌シグナル伝達は、初期胚の分化パターン6へのhESC多能性分化の決定7および組織を調節します。 2Dおよび3D微細hPSCsは、順番に3種の胚層8,9への分化決定に影響を与え、多パターンのコロニーの大きさを制御するために使用されています。我々は、インテグリンEカドヘリンクロストークは、細胞運命の異質10を生じさせることができるか調べるためにHPSCコロニー内の細胞-細胞および細胞-マトリックス相互作用の程度を調節するために多HPSCの微細パターンを採用しています。上記レポート発達疾患11のための薬物毒性スクリーニングのための実験モデルとしてhPSCsの多微細パターンの適用に向けたオープンな新しい道からデモンストレーション、組織または器官、開発中の成長因子およびホルモンの効果を研究するために、との形成を解明します組織パターン。

セルmicropatterの無数Falconnet らによって見直さとしてニング技術が開発されています。アル。12しかし、そのようなマイクロコンタクトは7,8,13印刷などのほんの一握りは、マイクロウェル文化14,15、光パターンは6とmicrostencils 16が正常に hPSCsで実装されています。微細hPSCsでのチャレンジは、その脆弱性と細胞の付着と生存のための特定の細胞外マトリックス（ECM）と成長条件の厳しい要件です。 2D HPSCパターンについて、マイクロコンタクト印刷は、組織培養、ガラス基板13上にHPSCの微細パターンを生成するための最も一般的な方法の一つです。方法は、マトリゲルなどラミニンおよび基底膜マトリックス、を含むHPSC文化、で使用されるパターンの共通ECMに使用することができます。しかし、それは、典型的には、ポリ-D-リジンにより支援二段階コーティングプロセスを必要とし、hPSCsは6,13に付着するための安定したECMの微細パターンを作製するために、特定の不活性大気の湿度条件を必要とします。各微細法の最も重要な考慮事項は、周辺地域への非特異的な細胞の付着を最小限に抑えながら、表面改質政権が希望の幾何学的な解像度でHPSC接着ECMパターンを生成することができるかどうかです。

ここでは、前に取り付けるためのhPSCs用接着ECMパターンの生成に追加の表面改質工程なしHPSCの微細パターンを生成するための簡単​​な方法として、ステンシル微細の使用を報告しています。細胞ステンシルは、スルーホール物理的にECMコーティングし、その後播種hPSCsを格納するための細胞培養基板上にシールサイズをミリメートルミクロンで、薄い膜、 例えば、ポリジメチルシロキサン（PDMS）シートで構成されています。ステンシルパターニングは物理的にHPSCにアクセスし、基礎となるECMコーティングされた基板に直接接続することができる場所を抑制することによって動作したように、この方法は、HPSC培養をサポートすることができる様々な基板と互換性があります。のみrequirementは、ステンシル材料の選択は、基板と可逆的シールを形成することができるということです。これらの基板は、従来の組織培養ポリスチレン（TCPS）17、リガンド共役基材18と同様に、調整可能な剛性を有するエラストマー材が挙げられる（ 例えば 、PDMS）19。この方法はまた、適切な取り付けとhPSCsの分化を可能にするために、このようなビトロネクチン（またはVTNタンパク質）、ラミニンおよび基底膜マトリックス（ 例えば 、マトリゲルとGeltrax）として異なるECMのコーティングを可能にします。したがって、我々は最適な細胞 - マトリックス接着、生存および分化のためのステンシル微細に特定のHPSCラインのための最適化されたECM-基板の構成を転送することができます。最近、同様の方法はまた、ポリ（メチルメタクリレート）（PMMA）マイクロステンシルアレイ16を使用してヒトES細胞を微細によって肝臓分化を導くことが報告されています。

細胞ステンシルが満たさ含む、異なる材料から製造することができますALS 20,21、ポリ（p-キシリレン）ポリマー22,23、PMMA 16、最も一般的には、PDMS 24-28。シリコン及びポリ（p-キシリレン）は、ステンシルは、貫通孔生物ユーザーへのアクセス可能性を制限する特殊な装置20-23との直接エッチングを必要とするポリマーです。 PDMSステンシルは、典型的には3ミクロンから2,000ミクロン11,26-29の範囲で必要な特徴の大きさに応じて異なる方法で製造することができます。小さ ​​な特徴が所望される場合には、薄いステンシルシートは、微細パターン28のレリーフを含む微細加工シリコンテンプレート上にプレス成形PDMSプレポリマーによって製造することができます。機能>千μmのために、CO 2レーザーカッターは、直接ステンシル製作中プレキャストPDMSシート上のパターンをカットするための簡単かつ低コストの方法を提供します。 PDMSステンシルのリサイクルにも十分な一貫性のある一連の実験を実施するためにそれら費用対効果になります。

ここでは、レーザー切断とのhESCの微細パターンの生成による千μmの機能を備えたPDMSステンシルを製造するための詳細な方法論を提示します。これらのhESCの微細パターンは、細胞接着の偏光は、細胞の運命異質10をもたらした方法空間を調査するために、凝集のhESCコロニー内のインテグリンの程度およびE-カドヘリン媒介性接着を調節するために使用しました。

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プロトコル

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注：このプロトコルは、PDMSステンシルを使用してのhESCラインのレーザー切断および微細、H9によって千μmのパターンとPDMSステンシルの製造を説明しています。

1.設計とマイクロパターニングのためのPDMSステンシルの作製

  1. 所望の形状や大きさ（ 例えば 、1000μmで丸）およびコンピュータ支援設計ソフトウェア10を使用して、ステンシルガスケットの貫通穴を有するステンシルシートを設計します。
  2. レーザーカット、それぞれ120から150μmの厚さ2mmのポリジメチルシロキサン（PDMS）シート上にステンシルシートとガスケットをCO 2レーザーカッター10を使用して。
  3. 微細用PDMSステンシルを得るために3-4時間、60℃で液状の未硬化PDMSとベークを使用して、PDMSステンシルシートでPDMSガスケットを接着。
  4. 使用前にオーブンで30分間、乾燥、120℃でオートクレーブ処理することによりPDMSステンシルを滅菌します。

2.ヒトES細胞の主ナンス

  1. 培養1×のhESC修飾基底膜マトリックス上で無フィーダー維持培地中でhESC株は、37℃で細胞培養プレートをコーティングし、5％CO 2。
  2. パッセージヒトES細胞を、彼らはディスパーゼ処理した37℃で3分間のインキュベーションにより約70％のコンフルエントであり、機械的に100から200μmの塊にhESCコロニーを解離。 6分割比：1での基底膜マトリックスでコーティングした組織培養ポリスチレン上で増殖エリア9.6 1cm 2当たり30〜50塊の密度でヒトES細胞の塊をプレート。

ヒト胚性幹細胞の3ステンシルマイクロパターニング

  1. 前の細胞パターニングへの準備
    1. ペトリ皿に超純水で700μlの70％の分析グレードのエタノールを分配し、上部にステンシルを配置し、60 mmのペトリ皿上にPDMSステンシルを密封します。
    2. トン一晩せるためにバイオセーフティキャビネット内のペトリ皿を置きます彼は乾燥エタノール。
    3. 全く気泡がステンシルは、ペトリ皿との良好なシールを形成することを確実にするために、ステンシルの下に存在していないか確認してください。これは、ECMコーティング液の漏れを防止します。それは細胞播種のための準備ができるまで、無菌条件下でのペトリ皿や店舗を封印。
    4. 分析証明書に従ってhESCの修飾基底膜マトリックスのアリコートを準備します。ダルベッコ改変イーグル培地25mlに希釈した場合、各アリコート利回り1×hESCの修飾基底膜マトリックス溶液いることを確認してください：栄養混合物F-12（DMEM / F12）メーカーの製品シートによると。
    5. 1.5×のhESC修飾基底膜マトリックス溶液を作るためにDMEM / F12 16.7 mlのへのhESC修飾基底膜マトリックスの1つのアリコートを添加することにより、ECMの塗布液を調製。ゲル化を防止するために氷の上のすべてのECMコーティング液を保管してください。
    6. 10μMのROCK阻害剤（Y27632）でのhESCの維持培地を補います。
  2. ステンシル基板上のECMコーティング
    1. 90秒間100 2 WOプラズマでペトリ皿を扱います。無菌性を確保するために、唯一の前のプラズマ処理をプラズマ室内ペトリ皿のカバーを開いて、すぐに処理が完了した後、ペトリ皿をバックカバー。これは、表面の濡れを促進し、ECMコーティング溶液の添加の間に貫通孔微細に気泡の形成を防止します。
    2. 全体のステンシルをカバーする1.5倍のhESC修飾基底膜マトリックス溶液の450μlのを追加します。乾燥から溶液を防止し、使用前に37℃で5時間インキュベートし、例えば、パラフィルムのように、自己密封可能なフィルムをペトリ皿を密封します。
  3. ステンシル基板上にヒトES細胞を播種
    1. 丸みを帯びた、しっかりpackeの典型的なヒトES細胞の形態の損失を示す分化した細胞領域を識別するために、6ウェルプレート中でhESCコロニーを調べ（ 例えば、損失D上皮形態、顕著な核小体を有する高核/細胞質比）。真空吸引器を使用して差別化領域を削除します。
    2. ウェル当たり2ミリリットルのDMEM / F12で二回洗浄します。
    3. 6ウェルプレートのウェルあたり、などのAccutaseなどの消化酵素の1ミリリットルを加え、8分間37℃でインキュベートします。基板から全てのコロニーを分離するために静かにプレートをタップします。
    4. 消化酵素の1ミリリットル当たりDMEM / F12の少なくとも4ミリリットルで各ウェルを洗浄し、15ミリリットルコニカルチューブに細胞懸濁液を収集します。
    5. 室温で3分間、200×gで細胞懸濁液を遠心します。
    6. 吸引して上清を除去し、細胞を再懸濁するためにROCK阻害剤（ROCKI）を補充したhESC維持培地400μlのを追加します。単一細胞に塊を壊すために静かに上下に3回細胞懸濁液をピペットで。
    7. 単一細胞懸濁液をよく混合し、DMEM / F12（1：20希釈）190μlの中に細胞サンプルを10μlを希釈。 hemocytomeを使用してくださいターストック細胞懸濁液中の細胞密度を決定します。
    8. 与えられたステンシルのために必要な細胞播種密度を計算します。
      注：例では、実験的に、単一の細胞のコンフルエントな単層を得るために、細胞播種密度が約4,444細胞/ mm 2で決定しました。したがって、450ミリメートル2の面積と400μlと播種量とのステンシルは2百万個の細胞/400μlの濃度になるように細胞懸濁液が必要になります。
    9. ROCKIを補充したhESC培養培地で（ステップ3.3.8を参照してください。注）必要な播種密度に株式細胞懸濁液を希釈します。
    10. 各ステンシルへの細胞の必要な数を含有する細胞懸濁液の指定されたボリュームを追加し、ペトリ皿を残す細胞が沈降することを可能にするために室温で5分間フード内で平静。
    11. インキュベーターにペトリ皿を移し、細胞付着を可能にするために1時間インキュベートします。中にペトリ皿のレベルを維持するために注意してください細胞はステンシルで単層として残るように処理を移します。
  4. パターン化されていない基板のステンシルの除去とパッシベーション
    1. 細胞が適切に下にある基板上に付着しているかどうかを確認するために顕微鏡下でペトリ皿を調べます。
    2. ステンシルから細胞懸濁液を離れて吸引します。
    3. ステンシルの周囲にDMEM / F12中の0.5％の細胞培養適合性の非イオン性界面活性剤を2ml /ディッシュを加えます。
    4. 静かにステンシルを剥離し、オートクレーブ処理ピンセットを使用してください。ステンシルは、乾燥から細胞を防ぐために剥離される非イオン性界面活性剤溶液を周囲に渦。視覚的にペトリ皿にマイクロパターン細胞を観察します。
    5. 37℃で10分間、0.5％の非イオン性界面活性剤、DMEM / F12溶液中の微細細胞をインキュベートします。
    6. 吸引離れて非イオン性界面活性剤、DMEM / F12溶液。 2ミリリットル/ DMEM / F12の皿で3回洗浄します。
    7. ヒトES細胞の2ミリリットル/皿を追加します。維持培地は、ROCKIを補充し、37℃で一晩インキュベートします。
    8. 一晩インキュベートした後、吸引のhESCの維持培地は、ROCKIを補充したDMEM / F12で一回洗浄し、100ng / mlのアクチビン、25 ngの/ mlのBMP4及び10ng / mLのFGF2で補充した分化培地2ml /ディッシュを添加することによりmesoendoderm分化を誘導します。
    9. 位相コントラストイメージングを用いて微細パターンを評価し、以前に8説明したように、各パターンの平均短尾（T）の強度プロファイルを計算します。

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結果

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本稿では、1000μmでの特徴を生成するために、レーザーカッターを使用することにより、細胞ステンシルの製作を説明します。貫​​通孔微細パターンを含む薄いステンシルシート（厚さ約100〜200ミクロン）、およびECMコーティング溶液又は細胞懸濁液を含有するPDMSガスケット：ステンシルは2部品で構成しました。ここでは、127ミクロン及び厚さ2mmの市販のPDMSシートは、それぞれ、ステンシルシートおよびガスケットとして使用しました。スピンコーティングのような制御可能な厚さのPDMSシートを製造するための他の方法は、また、部品を製造するために使用することができます。二つの成分は、接着剤やプラズマ結合のような液体未硬化のPDMSプレポリマー架橋剤の混合物を使用して互いに結合し、3~4時間、60°C（ 図1）で焼成しました。

ステンシルシートの材料は、細胞培養物の選択に基づいて選択しました。ubstrate。培養基質のような従...

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ディスカッション

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微細ステンシルの作製

ステンシル微細ニッチ媒介分化のパターニングを調査するためのHPSCの微細パターンを生成するための理想的な方法を提供します。このようなマイクロコンタクト印刷及び光パターンのような他の微細技術上のステンシルパターン形成の重要な利点は、それが表面改質を必要とせず、従来のTCPS基板上に実装することができることです。したがって、異なるHPSCラインの最適化培養培地およびECMコーティングは容易にステンシル微細に転送することができます。

良い微細パターンの生成に寄与する細胞ステンシルの製造中の重要なステップの数があります。 HPSCの微細パターンで設計された形状を再現の忠実度は、ステンシルシートの貫通穴加工の品質と一貫性に依存します。多micropatを含む研究のため>1000μmでのアジサシ、貫通孔を直接プリキャストPDMSシートのレーザ切断によって作製することができます。レーザー切断の解像度は、レーザビームのスポットサイズ及びレーザービームの経路を制御...

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開示事項

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著者には、競合する金融利害関係を持っていません。

謝辞

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

この作品は、付与（R-397-000-192-133）を起動し、ETPLギャップ・ファンド（R-397-000-198-592）NUSによってサポートされています。 GSはNUSの研究学者です。著者らは、細胞の微細化の彼女の技術サポートのために博士Jiangwa興に感謝したいと思います。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
 厚さ2mmのPDMSシートSpecialty Silicone Products Inc.、米国SSPM823-.005ステンシル
120-150 μm 厚いPDMSシートSpecialty Silicone Products Inc., USASSPM823-.040ステンシルの形成に使用 
60 mm ペトリ皿Nunc Nunclon Delta150326
AccutaseAccutase, Merck Millipore, SingaporeSCR005H9 細胞を単一細胞に分解する酵素
Activin  R&D Systems、シンガポール338-AC-010H9 分化
BMP4 の成長要因 R&D Systems, Singapore338-BP-010H9分化プラズマシステムの成長因子
 Femto Science、韓国CUTE-MPステンシル
DispaseStemCell&tradeのプラズマ酸化用;Technologies, Singapore7923Enzyme used to weaken the cell-ECM adhesion during passaging
DMEM/F12GIBCO, USA11330032H9細胞用基礎培地
FGF2R&D Systems、シンガポール233–FB–025H9分化のための成長因子
H9細胞株WiCell Research Institute, Inc., USAWA09ヒト胚性幹細胞
hESC認定基底膜マトリックスMatrigel, BD Biosciences, Singapore354277H9細胞の増殖をサポートする細胞外マトリックスコーティング
倒立顕微鏡Leica Microsystems, SingaporeDMi1明視野捕捉用画像
レーザーカッターEpilog Helix 24 レーザーシステムPDMSシート
mTeSR&tradeのスルーホールを生成するために使用されます。1 中盤 ステムセル&トレード;Technologies, Singapore5850H9細胞PDMS用メンテナンス培地
 SYLGARD® 184, Dow Corning Co., USA3097358-1004PDMSステンシルとリサービオールの貼り付けに使用
ROCKi Y27632Calbiochem, Merck Millipore, Singapore688000H9細胞を単一細胞として維持します 
STEMdiff™ APEL™ 中 ステムセル&トレード;テクノロジーズ、シンガポール5210H9細胞用分化培地
ポリエチレンテレフタレートフィルムSureMarkシンガポールSQ-6633ステンシルの形成に使用 
細胞培養適合非イオン性界面活性剤プルロン酸F-127、シグマ、シンガポールP2443非マイクロパターン基質における細胞接着をはじく不動態化試薬

参考文献

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