方法論記事

全血からの超高感度のタンパク質検出のための全自動遠心マイクロ流体デバイス

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DOI：

10.3791/54143

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2016年4月16日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, School of Life Sciences, Ulsan National Institute of Science and Technology (UNIST), UNIST-gil 50, Ulsan, Republic of Korea, 2Agency for Defense Development (ADD), Daejeon, Republic of Korea, 3KOGAS (Korea Gas Corporation) Research Institute, 4Center for Soft and Living Matter, Institute for Basic Science (IBS)

この記事について

サマリー

このプロトコルは、全血10μL中のタンパク質のフェムトモル検出感度を30分以内に達成する方法を示しています。これは、ラボ・オン・ア・ディスクに統合されたエレクトロスピニング・ナノファイバー・マットを使用することで達成でき、高い表面積と効果的な混合・洗浄によりS/N比が向上します。

要約

Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)は、生体サンプル中の少量のタンパク質を検出するための有望な方法です。サンプル量とアッセイ時間を削減し、完全自動化を実現するためのプラットフォームを提供するデバイスは、ポイントオブケア診断での潜在的な使用に必要です。最近では、TiO2ナノファイバー(NF)マットで構成されたラボ・オン・ア・ディスクを用いて、血清タンパク質、C反応性タンパク質(CRP)、心筋トロポニンI(cTnI)の超高感度検出を実証しました。これは、フェムトモル(fM)検出感度で、30分間で少量の全血から広いダイナミックレンジを示しました。この装置は、血液の分離、計量、混合、洗浄のためのいくつかのコンポーネントで構成されており、少量のサンプルからの感度を向上させるために自動化されています。ここでは、ビデオデモンストレーションでは、NFとディスクの製造、それらの統合、および操作のための実験プロトコルとノウハウを次の順序で示します。TiO2 NFマットのディスクへの転写印刷。免疫反応、ディスクの組み立ておよび操作のための表面改質。イムノアッセイのディスク上での検出と代表的な結果。この装置を使用することで、サンプルや試薬の消費を最小限に抑えたマルチプレックス分析が可能になります。これらの利点を考えると、このデバイスはさまざまなアプリケーションで使用され、存在量が少ないタンパク質の分析を容易にするのに有益であることが証明されるはずです。

概要

疾患の診断のためのいくつかのプラットフォームでは、このようなナノワイヤー、3ナノ粒子、4ナノチューブ、5及びナノファイバー（NFS）6-8のようなナノスケール物質1,2に基づいて開発されてきました。これらのナノ材料は、その独特の物理化学的特性のために高感度のバイオアッセイのための新技術の設計で優れた展望を提供しています。例えば、メソ多孔性酸化亜鉛ナノファイバーは、乳癌バイオマーカーのフェムトモル感度検出のために使用されている。 図9は、最近、二酸化チタン（TiO 2）に基づくナノ材料は、その化学的安定性を考慮すると生体分析アプリケーション10のために検討されている、11無視できるタンパク質の変性、12および生体適合性。13また、TiO 2の表面上のヒドロキシル基が化学修飾および生体分子の共有結合を促進する。14,15柄のTiO 2 THInはフィルム16またはTiO2ナノチューブ17は、表面積を増大させることにより標的タンパク質の検出感度を向上させるために利用されています。しかし、製造工程はかなり複雑であり、高価な装置を必要とします。一方、エレクトロスピニングされたNFSが簡単かつ低コストの製造工程だけでなく、その高い表面積の注目を集めている; 18,19は、まだ、エレクトロスピニングされたTiO 2のNFマットの壊れやすいまたは緩い特性が処理することが困難になり、マイクロ流体デバイスと統合。6,20したがって、TiO 2のNFマットはほとんど生物分析アプリケーション、過酷な洗浄条件を必要特にで利用されませんでした。

この研究では、これらの制限を克服するために、我々は、薄いポリジメチルシロキサン（PDMS）、接着剤層を利用して任意の被処理基板の表面にNFがマット電界紡糸を転送するための新しい技術を開発しました。 Furthermore、我々は成功したTiO 2 NFは、ポリカーボネート（PC）製の遠心マイクロ流体デバイス上にマットエレクトロスピニングの統合を示しています。 C反応性蛋白（CRP）と同様に心筋トロポニンI（のcTnI）の完全に自動化され、敏感な高、および統合された検出は、全血のわずか10μLから30分以内に達成された、このデバイスを使用する。21により組み合わせにNFSおよび遠心プラットフォームの特性の利点は、アッセイは、検出下限で100 ng / mlで（〜0.8 PM）に1 pg / mlで（〜8 FM）から6桁の広いダイナミックレンジを示しCRPおよび37 pg / mlで（〜1.5 PM）の検出限界は100 ng / mlで（〜4 nm）に10 pg / mlで（〜0.4 PM）からダイナミックレンジの0.8 pg / mlで（〜6 FM）のcTnIのため。これらの検出限界は、対応する従来のELISAの結果と比較して〜300〜20倍低いです。この技術は、適切な抗体を用いて、任意の標的タンパク質を検出するために適用することができます。全体的に、このデバイスの共同例えば 、全血を10μl、それは生物学的試料の非常に少量からでも素晴らしい感度で標的タンパク質のまれな量を検出することができるので、ULDは、体外診断薬および生化学的ア ​​ッセイに大きく貢献します。我々は唯一の本研究でELISAを用いた血清タンパク質の検出を示しているが、マイクロ流体デバイスとエレクトロNFSプロトコルの転送と統合技術は、より広く、高い検出感度のための大きな表面積を必要とする他の生化学的反応に適用することができます。

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プロトコル

注：血液は健康な個体から採取し、採血管に採取しました。書面によるインフォームドコンセントは、すべてのボランティアから得ました。

TiO 2のNFマットの1製作

  1. 前駆体溶液 22 の調製
    1. 1.5エタノールの混合物中のチタンテトライソプロポキシド（TTIP）のグラム（99.9％、3mL）および氷酢酸（3ml）に溶解し、マグネチックスターラーで30分間、室温（25℃）で溶液を混合します。
    2. エタノール（99.9％）3.64gのポリビニルピロリドン（PVP）の11重量％を溶解し、ホットプレートマグネチックスターラーを用いて1時間、65℃で溶液を攪拌します。
    3. 組み合わせると、ホットプレートマグネチックスターラーで4時間、65℃で2溶液をかき混ぜます。
  2. エレクトロスピニング
    1. 200μmの内側ディアメのステンレス鋼針に接続されたシリンジに調製した溶液を読み込みター。プランジ​​ャーを除去した後、シリンジに直接ソリューションを注ぎます。
    2. 高いDC電圧（15キロボルト）に接地された基板上に配置されたSiウェハ上に10分間0.3ミリリットル/ hrの流速（2 cmの×2センチ）で一定溶液を導入します。エレクトロスピニングの間、針10センチ接地された基板との間の距離を設定します。
  3. NFマットの焼成
    1. 炉内でNFマットを置き、高真空状態（5×10 -5トール）下で3℃/分の傾斜速度で500℃まで温度を上昇させます。
    2. 3時間500℃に温度を維持します。炉内のRT（25℃）に、サンプルの温度をクールダウン。

遠心マイクロ流体ディスクへのTiO 2の統合2 NFマット

  1. ディスクの作製
    1. 3D設計ソフトウェア（ 例えば 、ソルを使用しますチャンバー、チャネル、またはディスクの各層のバルブを描写するidWorksまたは類似）。デザインファイルは、コード生成ソフトウェア（ 例えば 、EdgeCAMのまたは類似）を使用してコンピュータ数値制御（CNC）コードに変換します。指示に従ってソフトウェアを使用して手動23,24注：このデバイスで使用される典型的なチャネル寸法は、x 0.3ミリメートル（幅×奥行）1.0ミリメートルです。
    2. CNCフライス盤のオペレーティングソフトウェアを開きます（ 例えば 、 DeskCNCまたは類似の）およびオペレーティング・ソフトウェアにCNCコードをロードし、順番に以下をクリックしてください： "AUTO" - > "GコードOPENを" - >生成されたCNCコードを選択します。
    3. CNCフライス盤にPC板を取り付け：トップ層とディスク層のためのPC板5ミリメートルのために1ミリメートルのPC板を使用しています。 「START」ボタンをクリックすることで、ディスクの各層を切断するためにCNCフライス盤を実行します。
  2. ディスクへ のTiO 2 NFマット の転送
    1. 30分間真空下で真空チャンバー内-1-トリクロロシランシリコン基板と（トリデカフルオロ-1,1,2,2-テトラヒドロオクチル）の40μLを含む小さなペトリ皿に置きます。フルオロシランは、気化し、基板上に塗布されます。
    2. 真空チャンバ1の比率とドガ：10で硬化剤とポリジメチルシロキサン（PDMS）プレポリマーを混合します。スピンコート60秒間650 rpmでシリコン基板上にPDMS。
    3. 付着状態を達成するために10分間65℃のオーブン中でシリコン基板上に塗布されたPDMSを硬化します。
      注：硬化時間は、環境条件に応じて変えることができ、接着力は、レオメーターを用いてタック試験によって試験することができます。
    4. ピンセットを使用して、PDMS被覆シリコン上にエレクトロスピニングし、焼成することにより調製TiO 2のNFマットを転送します。その後、手動でフラットなオブジェクト（ 例えば 、ガラススライド）に移したTiO 2 NFのマットの上にコンフォーマルな圧力を適用し、オブジェクトを削除します。置きます4時間、65℃または1時間80℃のオーブン中でこのサンプルは、完全にPDMS層を硬化させました。
    5. 20μlのPDMS /硬化剤混合物と、ディスク内のコート結合反応室（10：1）、接着層として機能するディスク上にTiO 2のNFマットを接続します。
    6. PDMS層上のTiO 2 NFのマットの上にエタノール（99.9％）の50μLを分注し、直径6mmのパンチ穴とNFマットを切断し、20μlのでコーティングされた結合反応室にTiO 2のNFマットをカットを転送前のステップでPDMSの。
      注：このステップでは、エタノールはSi基板からカットTiO 2のNFマットを取り外すために役立つであろう。
    7. 完全にPDMSを硬化させる1時間4時間、または80℃で65℃のオーブン中のTiO 2 NFマット統合ディスクをインキュベートします。
  3. ディスク上 のTiO 2 NFマット の表面改質
    1. Pエタノール中の（3-グリシドキシプロピル）メチルジエトキシシラン（GPDES）（99.9％）のrepare 1％（v / v）の溶液。
    2. 140 W、180秒間50sccmの酸素流量で酸素プラズマでディスクを統合したTiO 2 NFマットを扱います。各ナノ繊維マットの上GPDES溶液100μlを分注し、2時間室温（25℃）でインキュベートします。
    3. 洗浄瓶を使用して、エタノール（99.9％）を分配することによって基板を簡単に洗浄し、その後、ディスクを反転し、クリーンワイプに対してそれをブロッティングによりエタノールを完全に除去します。 1時間80℃で硬化します。上記のように物理的に吸着し、未結合GPDES分子を除去するために、同様にエタノール（99.9％）で2回洗浄します。
    4. ドライ真空下、窒素気流で乾燥ブロー。
      注：ディスクは使用するまで室温（25℃）で密閉容器に保存することができます。
  4. 表面上の抗体の固定化
    1. 捕捉抗体の200μg/ mlの溶液を作製（モノクローナルマウス抗ヒトのhsCRPまたはリン酸緩衝生理食塩水（PBS）緩衝液（pH7.4）で抗体を希釈したモノクローナルマウス抗のcTnI）。マイクロピペットを用いて、ディスク内の各NFマット上に溶液5μLを分注します。抗体の詳細については、材料のリストを参照してください。
    2. 加湿チャンバー内のディスクを保持し、4時間37℃でインキュベートします。 0.1％BSA-PBS緩衝液でNFマットコーティングされた抗体を洗ってください。マイクロピペットを用いて洗浄バッファー100μlでチャンバーを埋める、吸引またはデカンテーションによってバッファを削除します。最後に、ディスクを反転し、クリーンワイプに対してそれをブロットして、[ディスクを組み立てます。
  5. ディスクアセンブリ
    1. CADプログラム（ 例えば 、AutoCADのまたは類似）を使用した両面粘着テープ上のディスクのデザインを描画します。カッティングプロッタへのCAD設計をロードします。
    2. カッティングプロッタを使用して、両面粘着テープをカットします。両面接着テープの1の保護層をはがし、私を添付ディスク層の上にトン。他の保護層をはがし、ディスク層の上にトップ層を添付してください。
    3. プレス機であらかじめ組み立てられたディスクをロードし、正確に各バルブ、チャネル、およびチャンバを接続するために各層に整列マークを使用して、トップ/接着剤/ディスク層を合わせます。プレス機を使用してコンフォーマルな圧力を適用します。

3.イムノアッセイ

  1. マイクロピペットを用いて、1％BSA-PBS緩衝液でチャンバーを記入し、37℃で1時間ディスクをインキュベートします。マイクロピペットを用いて吸引によりバッファを削除してください。未反応部位をブロックするために、ディスク内のタンパク質の非特異的吸着を低減するために、この手順を実行します。
  2. マイクロピペットを用いて、チャンバーを充填し、吸引することにより、0.1％BSA-PBSで2回洗浄します。
    注：この段階でディスクを使用するまで4℃で保存することができます。
  3. 負荷micropipettを使用してディスク上のCRP検出のための抗原スパイク全血またはCRP無血清10μlの電子。較正グラフを作成するための、100 ng / mlで、1 pg / mlでのCRPの濃度を使用します。そして、のcTnI 10 pg / mlでの100 ng / mlで。
    注：μMの範囲である全血におけるCRPの高いレベルに起因して、CRP無血清は、デバイスの低検出限界を示すために使用されました。
  4. 赤血球を分離するために60秒間3600回転（391 XG）でディスクをスピン。
  5. 3秒間2,400 rpmでディスクを回転させることにより、HRPと結合した検出抗体の8μLを含むチャンバーにレーザー照射によるバルブ＃1、上清の血漿の転送4μlを開きます。
    注：ディスク操作の弁作動および可視化のための一般的なプロセスは、以前の報告書に詳細に記載されている21。
  6. タンパク質および検出抗体の結合のために5秒間混合モード（15 Hzの秒-1、15°）を適用します。
  7. オープンバルブ＃2、および結合反応室にステップ6で調製した混合物を転送（2,400 rpmで、3秒）。その後、混合物とTiO 2のNF上の結合抗体間の免疫反応を達成するために20分間混合モード（60 Hzの秒-1、2°）を適用します。反応後、開弁＃3と廃棄室（2400 rpmで、10秒）に残留混合物を移します。
  8. バルブ＃4を開いて、ディスク（2400 rpmで、4秒）を回転させることにより結合反応室に洗浄緩衝液（600μl）を転送します。その後、チャンバー内でのTiO 2のNFを洗浄するために120秒間混合モード（30 Hzの秒-1、30°）を適用します。
  9. ステップ3.8の同じ条件に従うことによって、二回以上のTiO 2のNFを洗浄し、20秒間2,400 rpmでディスクを回転させることによって、完全に残留洗浄バッファーを削除します。そして、バルブ＃5を閉じます。
  10. 化学発光反応のために、弁＃6及び紡糸を開くことによって、結合反応チャンバーに化学発光基質溶液を移送した後、1分間混合モード（30ヘルツ秒-1、2°）を適用その後10秒間、2400 rpmでディスク。
  11. バルブ＃7を開き、10秒間2,400 rpmでディスクを回転させることにより検出チャンバに反応した基質溶液を移します。
  12. 光電子増倍管（PMT）モジュール装備検出システムを使用して、反応基質溶液からの化学発光シグナルを測定します。
    注：ステップモータ、光学機械部品、並進ステージ、および市販のPMT：検出システムは、次の部品を使用して、カスタムビルドマシンです。光学機械部品やステップモータ装置を保持するように組み立てられ、モータは、ディスクを回転させることができます。検出は光学機械部品に固定されたPMTによって実行され、それは、デバイスの検出チャンバの上方に配置されています。ステップモータを操作することによって、検出チャンバは、右のPMTの検出ゾーンの下に並んでいます。

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結果

高感度で全血から、このプロトコルは、タンパク質の検出のための完全に自動化された遠心マイクロ流体デバイスを使用することで調製しました。 TiO 2のNFマットは、エレクトロスピニング及び焼成の方法により調製しました。所望の直径、形態、及び厚さのNFSを製造するために、そのような流量、電圧、紡糸時のような電界紡糸条件を最適化しました。条件が最適化されていなかった場合には、形成されたのNFの品質が劣っていました。具体的には、NFSが低電圧（5キロボルト）でポリマー溶液から紡糸されなかった、電圧が高い場合（> 20キロボルト）を破壊しました。同様に、回転時間が適切な密度、あまりにも疎ではない（1分）または密度が高すぎる（30分）でのNFの製造に重要でした。また、高流量に起因するビーズの形成を回避するために、流量を操作しました。そのように、15 kVでの印加電圧、10分の時間および0.3 mlの時の流量をエレクトロスピニング -1形態および結果として得られるのNFの厚み（ 図1）に基づいて、NF製造のため...

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ディスカッション

TiO 2のNF統合ディスク上のアッセイは、血液の非常に低い量で存在する低豊富なタンパク質の超高感度検出のための、迅速、安価で便利な技術です。この技術は、少量の試料（10μL）を使用することの利点を有しており、同時に複数のサンプルの分析に適しています。これは、多重免疫測定装置として大きな可能性を提供します。デバイスは、従来のELISAに必要とされる血漿分離のような試料前処理工程を必要としないというさらなる利点を有します。また、デバイスが原因で事前に設計されたチャンバ、チャネル、およびバルブの全体イムノアッセイ手順（ 例えば 、混合、洗浄、結合など）を自動的に実行することができます。また、接着剤を使用して代わりに粉砕し、手動アセンブリの市販のディスク製造方法（ 例えば 、射出成形、UV /音波/熱接着）を用いて、分析装置製造の全体の手順とすることができます自動化されました。

また、ここで提示転写印刷法は、薄い接着PDMS層を利用して基板を対象とするドナーからのエレクトロNFの簡便な移動を示しています。一般的に、焼成工程後に得...

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開示事項

著者らは開示するものは何もない。

謝辞

この作品は、韓国国立研究財団（NRF）の助成金（2013R1A2A2A05004314、2012R1A1A2043747）、韓国の医療技術のR＆Dプロジェクト、保健福祉省（A121994）と韓国政府が資金を提供し、IBS-R020-D1からの助成金によってサポートされていました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
SiウェーハLG SILTRONポリッシュウェーハ、テストグレード直径(mm)= 150、向き= <100>、ドーパント=ホウ素、RES(Ω・cm)= 1 - 30、厚さ(μm) = 650 - 700
ポリカーボネート (PC) 大同プラスチックPCS#6900厚さ(mm)= 1および5 
テトライソプロポキシドチタン、98%、Sigma-Aldrich205273
ポリビニルピロリドン、Mw = 1,300,000Sigma-Aldrich437190
酢酸Sigma-Aldrich320099
無水エタノールSigma-Aldrich459836
トリデカフルオロ-1,1,2,2-テトラヒドロオクチル)-1-トリクロロシランSigma-Aldrich448931
PDMSと硬化剤ダウ・コーニングSYLGARD 184
GPDESGelest IncSIG5832.0 
エタノールJ T Baker
FE-SEMFEINova NanoSEM
X線光電子分光ThermoFisherK-alpha
3DモデリングマシンM&I CNC Lab, KoreaCNC milling machine
ワックスディスペンシングマシンHanra Precision Eng. Co. Ltd., Koreaカスタマイズ
両面粘着テープFLEXcon, USADFM 200 clear 150 POLY H-9 V-95
カッティングプロッター(株) グラフテック (株グラフテック CE3000-60 MK2
スピンコーターMIDASSPIN-3000D
炉(焼成)R. D. WEBB COMPANYWEBB 99
Rheometer (Tack test)Thermo ScientificHaake MARS III - ORM パッケージ
酸素プラズマシステムFEMTOCUTE
モノクローナルマウス anti-human hsCRPHytest Ltd., Finland4C28(clone # C5)
Monoclonal mouse anti-cTnIHytest Ltd., Finland4T21(clone # 19C7)
HRP conjugated goat polyclonal anti-hsCRPAbcam plc., MAab19175
HRP標識マウスモノクローナル抗cTnIAbcam plc., MAab24460(クローン#16A11)
hsCRPAbcam plc., MAab111647
cTnIFitzgerald, MA30-AT43
ウシアルブミンSigma-AldrichA7906
PBSAmresco IncE404
採血チューブBDバキュテナー367844K2 EDTA 7.2 mg plus blood
collection tubes
SuperSignal ELISA femtoInvitrogen37074
モジュール式マルチラベルプレートリーダーPerkin ElmerEnvision 2104
ディスク操作機Hanra Precision Eng. Co. Ltd., Koreaカスタマイズ
光電子増倍管(PMT)浜松ホトニクスH1189-210
AutoCADAutoDeskバージョン2012設計ソフト
SolidWorks 3D CADソフト SOLIDWORKS株式会社バージョン20133D設計ソフトウェア、
EdgecamVeroソフトウェアバージョン2009.01.06928コード生成ソフトウェア
DeskCNCCarken Co.バージョン2.0.2.18CNCフライス盤ソフトウェア
)

参考文献

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