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方法論記事

連続IV注入は、脳卒中誘発脳浮腫を研究するためにマウスにおけるアルギニンバソプレシン受容体拮抗コニバプタンのための選択の治療のルートであります

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DOI:

10.3791/54170

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2016年9月1日

 ,  , 
1Neurotrauma Research, Swedish Medical Center, 2Neurosurgery, Colorado Brain and Spine Institute

この記事について

サマリー

私たちの研究は、コニバプタンの有益な効果がマウスの実験的な脳卒中後の送達方法に依存することを明らかにしました。私たちは、マウスの脳卒中誘発性脳浮腫形成に対するIVカテーテルを介した受容体遮断薬の送達のための研究プロトコルを開発しました。

要約

脳卒中は世界中で罹患率および死亡率の主要な原因の一つです。脳卒中は、脳浮腫およびその他の病態生理学的事象によって複雑になります。脳卒中誘発脳浮腫の開発と進化の中で最も重要な選手の中でホルモンのアルギニンバソプレシンおよびその受容体、のV1a及びV2があります。最近、のV1a及びV2受容体ブロッカーコニバプタンは、脳卒中後の脳浮腫を減少させるための潜在的薬物として注目されています。しかし、脳卒中研究におけるコニバプタンアプリケーションを含む動物モデルは、投与の実現可能な経路に基づいて変更される必要があります。ここでは48時間の連続静脈内（IV）の成果は、マウスにおける実験的脳卒中後の腹腔内（IP）コニバプタン治療と比較されます。我々は、中大脳動脈閉塞がコニバプタン（0.2 mg）を、または車両のIV治療のための頸静脈にカテーテルのインストールと組み合わせされたプロトコルを開発しました。動物の異なる集団は0.2で処理しました毎日コニバプタンまたは車両IP mgのボーラス。実験的脳卒中誘発脳浮腫は、連続IVおよびIP処置後のマウスにおいて評価しました。結果の比較はコニバプタンの連続IV投与がコニバプタンのIP投与とは異なり、マウスにおける虚血後脳浮腫を軽減することを明らかにしました。我々は、我々のモデルは、脳卒中や脳浮腫の文脈でコニバプタンアプリケーションの将来の研究のために使用することができると結論します。

概要

脳卒中は、患者と臨床医にとって大きな負担であり続けています。動物の脳卒中モデルは、ほぼ20年間、実験室で使用されてきました。1 それにもかかわらず、動物で機能する実験的治療は、人間ではしばしば失敗します。2 この治療成績の不一致は、動物実験で使用される薬剤の投与経路、薬物代謝や排泄率など、さまざまな要因によるものと考えられます。脳卒中の主な合併症の1つである脳浮腫は、神経科学における現在の研究の焦点です。脳浮腫形成のメカニズムには、虚血性脳損傷に対するアルギニン-バソプレシン(AVP)応答によって引き起こされる水と電解質のバランスの乱れが含まれます。3 したがって、AVP とその受容体 (V1a および V2) は、虚血後脳浮腫形成の調査研究の主要な焦点です。3

私たちは、マウスの虚血後脳浮腫に対する混合アルギニン-バソプレシン(V1aおよびV2)受容体遮断薬コニバプタンの効果を研究する方法論を開発しました。4 コニバプタン5の分子標的は、脳浮腫の緩和におけるその特性の探索に適した候補となります。さらに、コニバプタンは、脳卒中の病態生理学的事象の文脈で研究する必要があります。6 この研究をデザインするにあたり、コニバプタンの2つの異なる投与経路、すなわち静脈内(IV)4と腹腔内(IP)を用いた治療結果の比較を検討した。7 脳卒中誘発性脳浮腫に対する治療の効果を評価した。ここでは、中大脳動脈閉塞術 (MCAO) による実験的脳卒中の外科的導入と、頸静脈 IV カテーテルの設置を使用した継続的なコニバプタン治療の詳細なプロトコルについて説明します。脳卒中の誘発後、動物は無作為に次のグループに割り当てられました:ビヒクルまたはコニバプタン(0.2 mg /日)でIVまたはIPを治療しました。

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プロトコル

実験は、研究における動物の管理と使用のための国立衛生研究所のガイドラインに従って実施したとスウェーデンの医療センター動物実験委員会によって承認されました。すべての手順は、適切な無菌技術を用いて実施しました。研究のために利用した実験動物は、25から27グラムに体重を持つ野生型C57マウス、3ヶ月齢、男性でした。

インビボストローク誘導1.

  1. 手術前に歯科用レジンとのプレコートフィラメント。
    1. 7-0ナイロン縫合糸からのフィラメントの12ミリメートル長い部分をカットします。硬化剤の1部を樹脂2部を混合し、その後すぐに、約1/3全長のをカバーするために混合物中にフィラメントの先端を浸し。すぐにそれを削除し、それは歯科用レジンの滑らかな表面のコートで覆われていることを確認します。
    2. 空気は使用前に2時間フィラメントを乾燥します。
  2. 上にマウスを置きますnは麻酔導入室（2 L容量）、及びチャンバに入る2リットル/分で25％の酸素富化室内空気中1.5％イソフルランの流れを設定します。
  3. 尾のピンチへの応答の欠如によって決定されるように、完全に、8を麻酔まで、マウスは、誘導チャンバ内に残ることを許可します。
  4. 加熱パッドで手術台の上にマウスを置き、ノーズ​​コーンを介して自然に配信麻酔の維持のために1％のイソフルラン濃度を設定します。
  5. フロントや首の後ろで髪をクリップし、消毒用アルコールで首をスプレー。両眼に獣医の眼軟膏を適用します。
  6. 継続的に体温を監視するには、手術中にデジタルディスプレイに接続直腸温度プローブを使用します。
  7. 仰臥位でマウスを置き、消毒用ポビドンヨード10％スクラブ溶液を塗布、滅菌ドレープで覆い、その後、サイズ10手術用メスの刃で首に沿って正中切開を行います。
    8. <李>は一時的に6.0絹縫合糸で左総頸動脈（CCA）を連結します。
  8. 左外頸動脈（ECA）上の別のネクタイを置きます。
  9. 内頸動脈（ICA）上の微小血管クリップを配置します。
  10. 微小血管はさみで外頸動脈に小さな穴をカット。 ECAの開口部に歯科用レジンで被覆した7-0ナイロン縫合糸から作られたフィラメントを挿入し、クリップを除去しながら抵抗（CCAの分岐点から約5〜7 mm）の感じられるまで、cephalicallyそれを進めます。
  11. 位置にフィラメントを確保するために内頸動脈上に一時的なネクタイを置きます。図、 図1（a）を参照してください。絹縫合糸で皮膚を閉じて、ステップ2.6のように、0.5％ブピバカイン0.2ミリリットルと首の前面に傷を浸透させます。
  12. マウスは麻酔から目覚め、60分間回収室で意識を取り戻すことを可能にします。それは取り戻したまで無人の動物を放置しないでください胸骨横臥を維持するのに十分な意識。
  13. 0 =正常な運動機能を3 =対側に傾いて、2 =安静時、反対側が、通常の姿勢に旋回、テールリフトの胴体のと反対側の前肢の1 =屈曲、次のように神経学的欠損スコアリング（NDS）のためのマウスをテストします残り4時側=なし自発運動。4,9
    1. NDSのテストのための観察のための平らな面に尾と場所によって、リフトマウス（2-3分）。また、回収室でマウスを観察します。 MCAの不十分な閉塞に実験から2よりも低いNDSを示すマウスを除外します。
      注：レーザードップラー流量測定技術は、MCA閉塞を確認するために使用することができる9-11。
  14. 上記のように誘導室に回復の60分後に動物を麻酔-再、10％ポビドンヨードスクラブ溶液で前の皮膚切開を再滅菌し、上の手術創を再開絹縫合糸を切断して除去することにより、首の前面。
  15. ECAからフィラメントを削除するには、次の手順を実行します。
    1. ICA上の微小血管クリップを配置します。 ICAに縫合糸をほどくとオープンクリップを保持しながら、フィラメントを引き出します。
    2. クリップを閉じて、近位にカットにECAにネクタイを配置します。
    3. クリップを削除し、脳への血流を回復するためにCCAから合字を削除します。図、 図1Bを参照してください。

連続48時間の治療のための頸静脈に静脈カテーテルの2.インストール

注：マウスの​​覚醒せずにすぐにステップ1.16.3後、カテーテルのインストールに進んでください。

  1. フレキシブルチューブの2つの異なるサイズを使用します（外径0.94ミリメートル、注入される薬剤を含むように）インナーチューブを挿入し、外チューブ（外径3.18ミリメートル、インナーチューブの保護のため）に。
  2. P、腹臥位でマウスをレース消毒に10％のポビドンヨードスクラブソリューションを適用し、サイズ10手術用メスの刃で首の後ろに1cmの切開を行います。仰臥位にマウスを回し、10％ポビドンヨードスクラブ溶液と首の前面を再滅菌し、首の前面に外科創傷を再開。首の前面に背面の切開から皮膚の下のトンネルチューブを、と開いた傷口1センチメートルからそれを体外に出します。
  3. 正中線から横方向に約1cm首の前面の左側から皮下脂肪組織を削除します。 、左頸静脈を見つけて5ミリメートル離れた静脈に沿って2絆を置き、わずかに静脈を伸ばします。微小血管はさみで2絆間の頚静脈に小さな穴を開けます。 （心臓に向かって）インナーチューブ5ミリメートル、深尾側の先端を挿入します。
  4. 頚静脈の両方にタイでチューブを固定します。と首の前面に皮膚を閉じます3-0絹縫合糸。図、 図1Cを参照してください。
  5. 縫合糸で首の後ろに皮膚にチューブを固定して、スイベルを介してマイクロインフュージョンのIVポンプにチューブを接続します。スイベルは、食料や水へのフルアクセス権を持つケージの中にマウスの自由な移動を可能にします。
  6. 術後の痛みを防ぐために、0.5％ブピバカイン0.2ミリリットルと前面の皮膚切開と首の後ろを潜入。
    注：機関特定の動物のプロトコルに応じて、動物は、オピオイド、NSAID類、または抗生物質前および術後で処理することができます。しかし、上記の治療は、虚血性脳卒中のアウトカムの結果を変更することができます （ ディスカッションセクションを参照してください）。11月14日
  7. 動物は、実験の終了点まで別々のケージに動物を回復室で目覚め、その後収容することができます。それは胸骨を維持するのに十分な意識を取り戻したまで無人の動物を放置しないでください横臥。
  8. 1.5ミリリットル/ kg /時間、4で連続48時間のIVコニバプタンの治療（5％デキストロースで0.14 mg / mlで）または車両の注入速度を設定し、注入を開始します。
    注：IV注入コニバプタンの総量は1.44ミリリットルの全容量で約0.2ミリグラム/マウス/日であるべきです。
    注：5％デキストロースの1.44ミリリットル中0.2ミリグラムの合計量1日2回コニバプタンの腹腔内（IP）注射を行います。 IP注射は、先に説明した実装します。15は、本体とテールの後面の皮を把持して、マウスを抑えます。 26 G / 1/2インチ針を使用して、左下腹部にコニバプタンまたは車両を注入する。15
  9. 実験（48時間）の全期間1日2回、動物を観察します。動物が食料や水へのフルアクセスを許可。動物が苦痛または呼吸困難の兆候を示す場合獣医師に相談してください。安楽死は、重度のdistに動物のために必要な場合RESSは、以下のステップ3.1を参照してください、そして研究から動物を除外します。

エンドポイントでの脳卒中誘発脳浮腫の3評価

  1. 5％イソフルランでオーバー麻酔によりマウスを生け贄に捧げます。
  2. 正中線に沿って頭蓋骨の上に皮膚切開を行い、脳の上に全体の頭蓋骨を露出させ、皮膚を撤回するためにメスを使用してください。大後頭孔で始まり、それぞれの側の脳の周囲に沿って横方向に頭蓋骨を切断し、その下に脳に触れることなく慎重に持ち上げます。脊柱から脳と頭蓋骨のベースに取り付けられた神経を切断します。
  3. 前述したように、脳を取り外し嗅球および小脳から分離し、虚血性および非虚血性大脳半球に半球間裂に沿って大脳を分析。9
  4. 以前に4,9記載されているように、ウェット-乾燥比（WDR）を比較することによって、脳浮腫を評価します。組織の重量を測定前とオーブンで100℃で3日間乾燥させた後。 ％のH 2 O =として脳含水量（BWC）を計算（1乾燥重量/湿潤重量）×100％。

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結果

動物の体温が生理的範囲内であったとストローク誘導の外科的手順を通じて安定。 MCAOは、研究から除外した直後に2よりも低いNDSを示した2匹のマウス。

マウスにおけるMCAOは、48時間で同側半球で梗塞容積を生成します。 TTC染色した切片の評価は、脳虚血性脳卒中の発症が深刻な原因となる2009年10 Zeynalov、E.およびドレ、S.、によって発行された半球の約50％は、MCAO（ 図1D）後の梗塞の影響を受けていることを示しています酸素や栄養素が脳組織の剥奪。この局所脳組織の低酸素症の結果として、ニューロンおよびグリア細胞は、脳の梗塞部分を形成する、死ぬ。 図1Dは、MCAO誘発性梗塞により影響を受ける代表的なマウスの脳切片を示しており、傷害の大きさの推定値を与えます。 10

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ディスカッション

この研究は、前臨床脳卒中研究のための重要な値を有します。この研究では、マウスにおける実験的脳卒中後のコニバプタン（0.2 mg /日）の連続IV注入を効率的に処理の48時間後に脳浮腫を減少させることが明らかになりました。脳浮腫のコニバプタンの同じ用量の腹腔内注射の効果も調べました。で示されるようにIVおよびIPルートの両方によるコニバプタン処理は、マウスで自由水利尿を生成します。少し生理的レベル以上の血漿浸透圧の1）の増加。及び2）による腎臓における水の再吸収の閉塞に尿浸透圧の減少。従って、処理結果に基づいて、我々は、IV送達方法は、脳卒中誘発浮腫形成の追加の重要な有益な効果を有することを報告しています。

当社の主要な発見は、IV治療はコニバプタンのIPルートよりも脳浮腫の軽減に優れた効果を生じたということです。臨床用途はCORするコニバプタンは、利用可能な組み合わせのV1a及びV2受容体拮抗薬でありますRECT低ナトリウム血症、血液量及び重量オスモル濃度16コニバプタンは、様々な条件を有する患者における低ナトリウム血症を修正することが示されている。コニバプタ...

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開示事項

著者らは、開示することは何もありません。

謝辞

私たちは、資金調達と設備を提供するためのスウェーデンの医療センターに感謝します。また、研究スペースの寛大な使用のためのクレイグ病院に感謝します。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
加熱パッドK&H Manufacturing Inc1060
温度モニター、直腸プローブ付き Physitemp7029
シルク縫合糸、6-0Surgical Specialties CorporationSP114
絹縫合糸、3-0Ethicon1684G
ナイロン縫合糸、7-0Ethicon1696G
歯科用樹脂ポリシロキサン、硬化剤HeraeusKulzer65817930
Microinfusion IV PumpKent ScietificGT0897
Swivel 22GAInstech375/22PS
Laboratory Tubing, 0.94 mm x 0.51 mmDow Corning508-002
Laboratory Tubing, 3.18 mm x 1.98 mmDow Corning508-009

参考文献

  1. Gueniau, C., Oberlander, C. The kappa opioid agonist niravoline decreases brain edema in the mouse middle cerebral artery occlusion model of stroke. J Pharmacol Exp Ther. 282, 1-6 (1997).
  2. Krafft, P. R., et al. Etiology of stroke and choice of models. Int J Stroke. 7, 398-406 (2012).
  3. Vakili, A., Kataoka, H., Plesnila, N. Role of arginine vasopressin V1 and V2 receptors for brain damage after transient focal cerebral ischemia. J Cereb Blood Flow Metab. 25, 1012-1019 (2005).
  4. Zeynalov, E., Jones, S. M., Seo, J. W., Snell, L. D., Elliott, J. P. Arginine-Vasopressin Receptor Blocker Conivaptan Reduces Brain Edema and Blood-Brain Barrier Disruption after Experimental Stroke in Mice. PloS one. 10, e0136121(2015).
  5. Med Lett Drugs Ther.. Conivaptan (Vaprisol) for hyponatremia. The Medical letter on drugs and therapeutics. 48, 51-52 (2006).
  6. Zhao, X. Y., et al. Effect of arginine vasopressin on the cortex edema in the ischemic stroke of Mongolian gerbils. Neuropeptides. 51, 55-62 (2015).
  7. Manaenko, A., Chen, H., Kammer, J., Zhang, J. H., Tang, J. Comparison Evans Blue injection routes: Intravenous versus intraperitoneal, for measurement of blood-brain barrier in a mice hemorrhage model. J Neurosci Methods. 195, 206-210 (2011).
  8. Adams, S., Pacharinsak, C. Mouse anesthesia and analgesia. Curr Protoc Mouse Biol. 5, 51-63 (2015).
  9. Zeynalov, E., et al. The perivascular pool of aquaporin-4 mediates the effect of osmotherapy in postischemic cerebral edema. Crit Care Med. 36, 2634-2640 (2008).
  10. Zeynalov, E., Dore, S. Low doses of carbon monoxide protect against experimental focal brain ischemia. Neurotox Res. 15, 133-137 (2009).
  11. Zeynalov, E., Nemoto, M., Hurn, P. D., Koehler, R. C., Bhardwaj, A. Neuroprotective effect of selective kappa opioid receptor agonist is gender specific and linked to reduced neuronal nitric oxide. J Cereb Blood Flow Metab. 26, 414-420 (2006).
  12. Ma, M. C., Qian, H., Ghassemi, F., Zhao, P., Xia, Y. Oxygen-sensitive {delta}-opioid receptor-regulated survival and death signals: novel insights into neuronal preconditioning and protection. J Biol Chem. 280, 16208-16218 (2005).
  13. Ahmad, M., Zhang, Y., Liu, H., Rose, M. E., Graham, S. H. Prolonged opportunity for neuroprotection in experimental stroke with selective blockade of cyclooxygenase-2 activity. Brain Res. 1279, 168-173 (2009).
  14. Meisel, C., et al. Preventive antibacterial treatment improves the general medical and neurological outcome in a mouse model of stroke. Stroke. 35, 2-6 (2004).
  15. Miner, N. A., Koehler, J., Greenaway, L. Intraperitoneal injection of mice. Appl Microbiol. 17, 250-251 (1969).
  16. Adis International Limited. Conivaptan: YM 087. Drugs in R&D. 5, 94-97 (2004).
  17. Murphy, T., Dhar, R., Diringer, M. Conivaptan bolus dosing for the correction of hyponatremia in the neurointensive care unit. Neurocrit Care. 11, 14-19 (2009).
  18. Liu, X., Nakayama, S., Amiry-Moghaddam, M., Ottersen, O. P., Bhardwaj, A. Arginine-vasopressin V1 but not V2 receptor antagonism modulates infarct volume, brain water content, and aquaporin-4 expression following experimental stroke. Neurocrit Care. 12, 124-131 (2010).
  19. Wallace, B. K., Jelks, K. A., O'Donnell, M. E. Ischemia-induced stimulation of cerebral microvascular endothelial cell Na-K-Cl cotransport involves p38 and JNK MAP kinases. Am J Physiol Cell Physiol. 302, C505-C517 (2012).
  20. O'Donnell, M. E., et al. Intravenous HOE-642 reduces brain edema and Na uptake in the rat permanent middle cerebral artery occlusion model of stroke: evidence for participation of the blood-brain barrier Na/H exchanger. J Cereb Blood Flow Metab. 33, 225-234 (2013).
  21. Walcott, B. P., Kahle, K. T., Simard, J. M. Novel treatment targets for cerebral edema. Neurotherapeutics. 9, 65-72 (2012).
  22. Shen, Z., et al. Inhibition of G protein-coupled receptor 81 (GPR81) protects against ischemic brain injury. CNS Neurosci Ther. 21, 271-279 (2015).

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