体細胞の再プログラミングの反応速度測定とリアルタイムの可視化

サマリー

この研究で提示されたプロトコルは、フローサイトメトリー分析を使用して、正および負の多能性幹細胞マーカーの動的測定によって再プログラミングの進行をリアルタイムでモニタリングするための方法を記載しています。プロトコルは、IPSCの生成時形態、およびマーカーまたはレポーター発現のイメージングに基づく評価を含みます。

要約

体細胞のリプログラミングは、多様な遺伝的背景と疾患の表現型から成体細胞を人工多能性幹細胞(iPSC)に変換することを可能にしました。最近の進歩により、リプログラミング因子の導入のためのより効率的で安全な方法が特定されました。ただし、再プログラミングの進行状況を監視および追跡するツールはほとんどありません。現在のリプログラミングのモニタリング方法は、形態の定性検査や幹細胞特異的色素や抗体による染色に依存しています。iPS細胞の作製進行を解剖するツールは、さまざまな細胞源からさまざまな条件下でのプロセスをよりよく理解するのに役立ちます。

この研究は、フローサイトメトリーを使用したリプログラミング進行の速度論的測定と、イメージングによるリアルタイムモニタリングのための主要なアプローチを提示します。リプログラミングの動力学を測定するために、陽性および陰性の多能性幹細胞マーカーに対する抗体を使用して、離散的な時点でフロー分析を行いました。リアルタイムの可視化とフロー解析の組み合わせにより、さまざまな段階でのリプログラミングの定量的研究が可能になり、さまざまなシステムやメソッドをより正確に比較できます。リアルタイムの画像ベースの分析は、フィーダーフリー培地システムで再プログラムされる線維芽細胞の連続モニタリングに使用されました。コロニー形成の動態は、生アルカリホスファターゼ色素またはSSEA4またはTRA-1-60に対する抗体で染色した後の位相差または蛍光チャネルのコンフルエンスに基づいて測定されました。その結果、コンフルエンスの測定は、リプログラミングの進行を監視するための半定量的な指標を提供することが示されました。

概要

患者由来の人工多能性幹細胞（iPS細胞）を細胞療法及び薬物スクリーニングのための有望なツールです。彼らは、治療のための細胞の自家源を提供します。さらに、それらは、胚性幹細胞（ESC）の行ができるようになり、現在のものを超えて遺伝病の詳細なインビトロ分析を可能にする、遺伝的背景の非常に広いセットを包含する。最近の進歩は、センダイウイルス、エピソームプラスミドまたはmRNAを^1,2と再プログラミングを含む、iPS細胞を生成するためのいくつかの方法の開発につながっています。特に、別の再プログラミング方法は、効率性と安全性のレベルを変化させることに関連しており、様々な用途のためのそれらの適切性に影響を与える他の方法で異なる可能性が高いされています。再プログラミング技術の種々の利用可能性によれば​​、再プログラミングプロセスを評価するための方法を開発することが重要になってきています。ほとんどの既存の方法は、形態または染色の定性的な検査に依存します幹細胞特異的色素と抗体を用いました。一つの最近開発された方法は、PSC-特異的miRNAまたは分化細胞特異的なmRNA ³に敏感であるレンチウイルスの蛍光レポーターを利用します。このような監視方法は、さまざまな状況のための技術を再プログラミングの選択および最適化を容易にします。例えば、CDy1は再プログラミング変調器⁴をスクリーニングするために、初期のiPS細胞用の蛍光プローブとして使用されています。異なる再プログラミング実験を観察し、比較する能力はまた、プロセス自体のより良い理解を得るために重要です。例えば、現在、いくつかの体細胞タイプは他の⁵よりも再プログラムが容易であることが知られており、細胞を^6-8再プログラミングの間の中間状態を通過すること。残念ながら、再プログラミングプロセスの基礎となるメカニズムはまだ完全には理解されておらず、その結果、再プログラミングの方法との間の正確な違いはまた、dをされずに残っていますefined。このように、監視のための方法、評価、および再プログラミングイベントを比較するには、幹細胞分野のために重要であり続けます。

このプロトコールに記載された方法は、監視を可能にし、再プログラミングプロセスを評価し、これらの技術は、再プログラミング試薬の異なるセットを比較するために使用することができる方法を示します。第1のアプローチは、フローサイトメトリーを含む正および負の多能性幹細胞（PSC）のマーカーに対する抗体の組合せを使用して分析します。第二のアプローチカップルリアルタイムイメージング及び合計コンフルエンス（細胞によって覆われたパーセント面積）を測定し、マーカ信号の合流（蛍光シグナルによって覆わパーセント面積）。

プロトコル

1.Solutionとミディアムの準備

1. 基底膜マトリックス（Engelbreth-Holm-Swarm腫瘍から精製されました）
   1. ゆっくりと4℃で一晩氷上で基底膜マトリックス（5ミリリットル）を解凍。
   2. 滅菌、あらかじめ冷却し15ミリリットルコニカルチューブ内の氷冷5ミリリットルと1、無菌DMEM / F-12培地：原液1を希釈します。予め冷却し、1.5ミリリットルの滅菌マイクロ遠心管にアリコートを分配し、直ちに-20℃で保存します。
   3. 4℃で一晩1基底膜マトリックスの分量：使用する前に、凍結された1を解凍。 1アリコート氷冷、1の最終希釈に滅菌DMEM / F-12培地を用いて別の50倍：100使用時に、さらに1希釈します。
   4. 適切な組織培養（TC）血管に100希釈した基底膜マトリックス溶液と1時間37℃でインキュベートする：1を適量加えます。典型的には、コートTC皿Oに希釈された基底膜マトリックス溶液3mlを使用20センチメートル²表面積F、コートTC皿/プレートの他のすべてのタイプの表面積1cm ²当たり希釈行列の0.15ミリリットルの割合で。前の任意の培地および細胞の添加に残った溶液を吸引します。
2. 線維芽細胞ミディアム
   1. 4℃で一晩ES認定ウシ胎児血清（ES-FBS）の100ミリリットルボトルを解凍します。
   2. DMEM培地の445ミリリットルに解凍したES-FBSおよびMEM非必須アミノ酸溶液（1倍）の5ミリリットルの50ミリリットルを追加します。 0.22μmフィルターを通して組み合わせの成分を滅菌し、4週間まで4℃でメディアを保存します。
3. iMEFミディアム
   1. 4℃で一晩ES-FBSの100ミリリットルボトルを解凍します。
   2. DMEM培地の445ミリリットルにMEM非必須アミノ酸溶液（1×）、及び2-メルカプトエタノールを500μlの解凍FBSの50ミリリットル、5ミリリットルを追加します。
   3. 0.22μmフィルターを通して組み合わせ部品を殺菌し、私を保存します4週間まで4℃でdium。
4. 塩基性線維芽細胞成長因子溶液（B-FGF）
   1. D-PBSの990μlに血清代替の10μlを添加して、徹底的にピペッティングにより混合します。
   2. 10μgの凍結乾燥B-FGFの1バイアルに1％（v / v）の血清代替ソリューションの1ミリリットルを追加します。徹底的に優しくピペッティングにより混合します。
   3. 4週間までに必要とされるまで-20℃でマイクロ遠心チューブとストア内の200μlのアリコートに10 / mlのbの-FGFソリューションを等分。
5. ヒト多能性幹細胞（HPSC）ミディアム
   1. 4℃で一晩血清代替の100ミリリットルボトルを解凍します。
   2. DMEM / F-12培地の395ミリリットルにMEM非必須アミノ酸溶液（1×）、及び2-メルカプトエタノールを500μlの解凍血清代替の100ミリリットル、5ミリリットルを追加します。
   3. 0.22μmフィルターを通して組み合わせ部品を殺菌し、で培地を保存します最大4週間4℃。
   4. 使用時には、37℃にHPSC媒体を事前に暖め、bFGFの4 ngの/ mlを補足します。
6. iMEFミディアム（CM）馴化
   1. T-175培養フラスコに0.1％ゼラチン18 mlを加え、1時間37℃でインキュベートします。
   2. インキュベーションの1時間後、0.1％ゼラチン溶液を除去します。 iMEF培地45ミリリットルに9.1×10 ⁶有糸分裂不活性化マウス胚線維芽細胞（iMEF）を追加し、一晩37℃のインキュベーターでインキュベートします。
   3. 一晩のインキュベーションの後、古いiMEF培地を除去し、室温で5分間D-PBS 25mlで1回洗浄。
   4. D-PBSを吸引除去は洗って予熱したHPSC培地の90ミリリットルを追加し、bFGFの4 ngの/ mlのを補充しました。正確に24時間37℃のインキュベーターでインキュベートします。
   5. インキュベーションの24時間後、無菌的にiMEFフラスコからHPSC培地を除去し、0.22μmのフィルターを通して滅菌します。 5へのアリコート0ミリリットルコニカルチューブ、必要になるまで-20℃で凍結します。 iMEF CMを-20℃で6ヶ月まで保存することができます。
   6. iMEFフラスコへのbFGFの4 ng / mlでで補充予め温めHPSC媒体の別の90ミリリットルを追加します。正確に24時間37℃のインキュベーターでインキュベートします。最大7日間のCMの収穫を繰り返します。
   7. 使用時には、37℃にiMEF-CMを事前に暖め、bFGFの4 ng / mlでで補います。
7. E8ミディアム
   1. 一晩4℃で10ミリリットルE8サプリメントを解凍します。
   2. E8基礎培地の10ミリリットルを削除し、無菌的に残りの基礎培地に解凍E8サプリメントの内容を追加します。徹底的に混合し、0.22μmのフィルターを通して滅菌します。 2週間まで4℃で完全培地に保管してください。
   3. 使用時に、培地のアリコートを室温に使用する前温め。これは、37°C​​に予備暖かいE8中にはお勧めしません。
8. セルだからrtingバッファ
   1. 右のセルは、EDTA溶液（1mMの最終濃度）を添加することによって選別する前に新たなソート・バッファを準備し、HEPES緩衝液（25mMの最終濃度）ペニシリン/ストレプトマイシン溶液（100単位/ mlの最終濃度）およびウシ血清アルブミン（最終濃度1％）ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水（カルシウムとマグネシウムを含みません）。
   2. 使用する前に、0.22μmのフィルターを通してバッファーを滅菌します。
9. セルソーティング回復中
   1. ペニシリン/ストレプトマイシン（100単位/ mlの最終濃度）を添加することにより、線維芽細胞中の50ミリリットルを変更し、ロック阻害剤Y-27632（最終濃度10μM）。選別された細胞を播種する前に、37℃に事前に暖かいこの培地。

ヒト線維芽細胞の2仙台媒介リプログラミング

1. 、センダイウイルスで形質導入2×10 ^5℃の密度で繊維芽細胞に接種する24時間前6ウェルTCプレートの所望のウェルにウェル当たりells。
2. 次のように0日目に形質導入​​を行います。
   1. 37℃の水浴中で線維芽細胞中のプレ暖かい2 mlです。 -80℃の貯蔵からセンダイウイルス管の一組を削除し、第5のために37℃の水浴中にチューブの底に浸漬することによって一度に各チューブ一つ解凍 - 10秒、その後水からチューブを取り外しますバス、それは室温で解凍することができます。解凍したら、簡単にチューブを遠心分離し、直ちに氷上に置きます。
   2. 予め温めておいた線維芽細胞培地1mlに感染以下の多重度（MOI）を達成するために、管の各々について（COAに従って）適切な量を添加することによって、商業的に第二世代センダイウイルスを使用して、ウェル当たり従うように形質導入​​されます：KOS = 5×10 ⁶ CIU、HC-Mycを= 5×10 ⁶ CIU、hKlf4 = 3×10 ⁶ CIU。
   3. 徹底的に優しく上下混合物をピペットでウイルス液を混ぜます。 Comple5分以内に次のステップをTE。
   4. 再プログラムされる線維芽細胞の井戸から線維芽細胞中を吸引除去し、各ウェルにウイルス液の1ミリリットルを追加します。 37°C、5％CO ₂インキュベーターで細胞を置き、一晩インキュベートします。
3. 一晩のインキュベーションに続いて、伝達媒体を吸引すると、古い培地を適切に（30分間、10％の漂白剤溶液）を処分。形質導入した細胞を予め温めておいた線維芽細胞培地2mlと交換し、培養を継続します。
4. 6日以上培養細胞を、一日おきに新鮮な線維芽細胞中で古い培地を交換します。
   注：7日の形質導入後までではなかっ通路再プログラムされた細胞の操作を行います。
5. 6日目：IPSC世代のための準備料理
   1. フィーダ依存性IPSCを生成するために、6ウェル組織培養（TC）皿の各ウェルに0.1％ゼラチン溶液1.5mlを添加し、1時間37℃でインキュベートします。
   2. そのように、0.1％のゼラチンを削除しますインキュベーションの1時間後リューション。ウェル当たりiMEF培地2mlで3×10 ⁵有糸分裂不活性化マウス胚線維芽細胞（iMEF）を追加し、一晩37℃のインキュベーターでインキュベートします。
   3. 6ウェル組織培養（TC）皿の各ウェルに、（100希釈1）、1時間37℃でインキュベートフィーダー非依存性IPSCを生成するために、希釈された基底膜マトリックス1.5mlのを加えます。
6. 七日形質導入後IPSCコロニー生成のためにあらかじめ用意された培養皿にそれらを、形質導入された線維芽細胞を収穫し、再プレート。
   1. 線維芽細胞からの通常の培養培地を吸引除去し、D-PBS 2mlで細胞を1回洗浄します。
   2. D-PBSを吸引除去は洗って予め温め0.05％トリプシン/ EDTAの0.5ミリリットルを追加します。 37℃で5分間 - 3用の細胞をインキュベートします。
   3. 細胞が切り上げたら、トリプシン処理を停止するために各ウェルに予め温めておいた線維芽細胞中の2ミリリットルを追加します。優しくトンをピペットでウェルからの細胞を取り除きます彼の媒体皿の表面を横切ります。 15mlのコニカル遠心チューブ中の細胞懸濁液を収集します。
   4. 2分間200×gで細胞を遠心。上清を吸引し、新鮮な、予め温めておいた線維芽細胞培地2 ml中に細胞を再懸濁します。
   5. 希望の方法（血球計または自動セルカウンター）を用いて細胞をカウントし、6ウェルあたり、フィーダ依存条件のための5×10 ⁴細胞とフィーダーの独立した条件のための1×10 ⁵細胞で事前に準備された培養皿に播種型ウェルディッシュ、一晩37℃、5％CO ₂インキュベーターでインキュベートします。
   6. 一晩のインキュベーションに続いて、アプリケーションに応じて、HPSC媒体、E8媒体またはiMEF馴化培地に培地を変更します。日常その後、新鮮な培地と古い培地を交換してください。

BGO1v hOct4-GFPレポーターヒト胚性幹細胞の3仙台リプログラミング（hESCの）由来の二次線維芽細胞

1. デア以前に^9を説明した手順に従って、BG01V hOct4-GFPレポーターのhESCラインからアイブ二次ヒト線維芽細胞。
2. 二日形質導入する前に、線維芽細胞培地を用いて、ウェル当たり2×10 ⁵細胞で6ウェルプレートの2ウェルにBGO1v / HOG導出線維芽細胞をプレート。
   1. 37°Cまでの線維芽細胞中の形質導入の日に、事前に暖かい2ミリリットル。
   2. -80°Cストレージから仙台管の1セットを削除してください。袋からバイアルを取り外し、最初の5のために37℃の水浴中で管の底部を浸漬することにより、一度に各チューブ1を解凍 - 、10秒た後、チューブを室温で解凍することができます。解凍したら、簡単にチューブを遠心分離し、直ちに氷上に置きます。
   3. 、線維芽細胞中の2ミリリットルに（適切なボリュームのCoAを参照）3仙台管のそれぞれの示されたボリュームを追加し、37℃に予熱した、徹底的に上下にピペッティングすることによりウイルス液を混ぜます。次のSTEを完了5分以内のp。
      注記：この実験では、5のMOI：5：6を使用しました。
   4. 形質導入する線維芽細胞のウェルからの線維芽細胞中を吸引。形質導入される2つのウェルのそれぞれにウイルス懸濁液の1ミリリットルを追加します。 37°C、5％CO ₂インキュベーターで細胞を置き、一晩インキュベートします。
   5. 一晩のインキュベーションに続いて、伝達媒体を除去し、適切な方法で（30分間、10％の漂白剤溶液）を処分します。形質導入した細胞を予め温めておいた線維芽細胞中の2mlで各ウェルを交換し、培養を継続します。
3. 6日以上培養細胞を、一日おきに新鮮な線維芽細胞中で古い培地を変えます。
   1. 七日には、形質導入された線維芽細胞を収穫し、IPSCコロニー生成のための既製の培養皿にそれらを再プレート、伝達を投稿してください。
   2. 線維芽細胞からの通常の培養培地を吸引除去し、D-PBS 2mlで細胞を1回洗浄します。
   3. DPを吸引除去BS洗浄と予め温め0.05％トリプシン/ EDTAの0.5ミリリットルを追加します。 37℃で5分間 - 3用の細胞をインキュベートします。
   4. 細胞が切り上げたら、トリプシン処理を停止するために各ウェルに予め温めておいた線維芽細胞中の2ミリリットルを追加します。静かに皿の表面全体に培地をピペットでウェルからの細胞を取り除きます。 15mlのコニカル遠心チューブ中の細胞懸濁液を収集します。
   5. 200×で細胞を遠心 2分間グラム。上清を吸引し、新鮮な、予め温めておいた線維芽細胞中の適切な量の再懸濁細胞。
   6. 希望の方法（血球計または自動セルカウンター）を用いて細胞を数えます。
   7. 基底膜マトリックスのウェルあたり1×10 ⁵細胞の密度で形質導入した細胞を播種を6ウェルプレートにコーティングを採用し、一晩、37℃、5％CO ₂インキュベーター内でインキュベートします。
4. 一晩のインキュベーション後、10 ngの/メートルを補充し、馴化培地をiMEFする培地を変更B-FGFのリットル。その後、新鮮なiMEF CMの日常と古い培地を交換してください。
5. 三週間は、機械的に解剖し、クローン増殖のための所望のコロニーを転送したり、分析に使用、伝達を投稿してください。

線維芽細胞の再プログラミングの4ライブセルイメージング

1. リアルタイムモニタリング
   1. 7日には仙台の再プログラミングキットで形質導入を投稿し、先に述べたように、所望の媒体とマトリックスシステムを6ウェル皿に細胞の所望の量をシード。 37℃に設定した加湿インキュベーターに位置イメージャ、内部のシードの皿を置き、5％CO _2。
   2. 製造業者のプロトコルに従って、次の14日間取り込む連続画像の - （8時間ごとに6）設定された間隔で各個々のウェルの全ウェル画像をキャプチャするイメージングソフトウェアを設定します。
      注：位相コントラスト画像の設定は、コロニーの進行を評価するための通常の再プログラミングのために選択されます。その場合BG01V / HOG由来の線維芽細胞の再プログラミングするのではなく、再活性化内因性OCT4-GFPの記者が再プログラミングプロセス全体にわたって追跡することができるように、位相コントラストおよび緑色蛍光チャンネルの画像をキャプチャするのが最善です。
   3. 毎日培地を変更して、以前に8日から21形質導入後に説明するように、それは、実験に応じて、HPSC媒体、E8媒体、またはiMEF-CMことができます。ウェルはさらに、間接免疫蛍光法を用いたコロニー形成について分析することができます。
   4. 21日目19日の実験終了時に、線維芽細胞のための抗体でプローブするために、各ウェルから培地を除去し、選択肢の幹細胞マーカー。
   5. 予め温めておいたDMEM / F-12培地2mlで一回各ウェルを洗浄します。
   6. 次のようにDMEM / F-12培地の1ミリリットル中の各正/負の一次抗体のペアのアリコートを準備します。抗マウスSSEA4（1：200）および抗ラットCD44（1時50分）、抗マウスTRA -1-抗ラットCD44（1時50分）、およびアルカリホスファターゼのLi：60（200 1）ステイン（1時50分）および抗ラットCD44（1:50）VEの。それぞれが対応するウェルに1ミリリットルの一次抗体溶液を追加します。 45分間37℃でインキュベートします。
   7. 一次抗体溶液を吸引除去し、予め温めておいたDMEM / F-12培地で2回洗浄します。
   8. で赤色蛍光のため：（500 1）緑色蛍光およびヤギ抗ラットのAlexaフルーア594結合二次のために：（500 1）ヤギ抗マウスアレクサフルオロ488標識二次を使用して（各ウェルについて1ミリリットル）を二次抗体溶液を準備しますDMEM / F-12培地。最終洗浄後に各ウェルに加えます。 37℃で30分間、二次抗体をインキュベートします。
      注：によりアルカリホスファターゼライブステインの（APLS）過渡信号には、抗CD44一次インキュベーションは、最初に自身が実行されるべきであり、APLSは、二次抗体とのインキュベーション時に添加されるべきです
   9. 二次抗体のインキュベーション後、ソリューションをオフに吸引し、DMEM / F-12培地で2回洗浄します。新鮮予め温めておいたDMEM / F-12を追加します。最終的な画像キャプチャの各ウェルに培地。
   10. 位相コントラスト、緑色蛍光および赤色蛍光：よくすべての3つのスキャンパラメータを使用して、各全体のウェルの画像を取得する撮像装置のソフトウェアを設定します。様々な倍率で画像を作成し、成長とマーカー発現を監視するためのソフトウェアとタイムラプスムービーを作成。製造業者のプロトコルを使用してください。
   11. 解析ソフトウェアを利用して、BG01V / HOGの再プログラミングのための位相コントラストおよび緑色蛍光単位で時間をかけて十分の合流点を評価。
2. 細胞表面マーカーを使用してリプログラミング中間体の監視
   1. 再プログラミングのプロセスを監視するために、異なる幹細胞陽性/陰性マーカーに対する抗体を用いて様々な時点で再プログラミング皿をプロービングすることによって異なる時点で再プログラミングイベントを監視します。複製の可用性に応じて2〜3日ごとに文化を探ります。再プログラミングDISを探ります染色パターンに基づいて完全に再プログラミングされたIPSCコロニーと部分的に再プログラムコロニーを同定するための二重染色の戦略を使用して、21日19時hesの。
   2. 所望の時点で、各ウェルから通常の増殖培地を吸引除去は、選択したマーカーの抗体でプローブします。
   3. 予め温めておいたDMEM / F-12培地2mlで一回各ウェルを洗浄します。
   4. 緑色蛍光フルオロフォアにコンジュゲートSSEA4（1：200）、TRA-1-60緑色蛍光フルオロフォアにコンジュゲート（1：次のようにDMEM / F-12培地1ml中の各正/負の一次抗体ペアのアリコートを調製50）、アルカリライブステイン（1：500）は、CD24は、緑色蛍光フォア（1時50分）緑色蛍光フォア（1時50分）、のEpCAMは緑色蛍光フォアにコンジュゲートに結合させ、B2M（1時50分）にコンジュゲート、マウスCD73でプロービングされ、ラットCD44（1:50）：緑色蛍光フォア（500 1）に結合した抗マウス二次抗体でプローブした（1 100）抗ラット二次抗体は、赤色蛍光フルオロフォア（1：500）にコンジュゲート。それぞれが対応するウェルに1ミリリットルの一次抗体溶液を追加します。 45分間37℃でインキュベートします。
   5. 吸引し、一次抗体溶液を切り、予め温めておいたDMEM / F12培地で2回洗浄します。
   6. 非コンジュゲート抗体を、適切な二次抗体溶液を調製し、37℃で30分間インキュベートすることにより2段階法を使用することに進みます。二次抗体は、一次ホストにあり、交差反応しないことを確認してください。前述したように、追加の洗浄ステップを実行します。
   7. すべての適切な洗浄の後、最終的な画像取り込みに各ウェルに新鮮予め温めておいたDMEM / F-12培地を追加します。
   8. 蛍光顕微鏡を用いて100倍の倍率で、適切なフィルタの下で蛍光画像をキャプチャし、利用可能な解析ソフトを用いて画像を解析します。

フローCを使用した5書き換え速度論の測定ytometry

1. 細胞表面の抗体を使用して再プログラミングの定量キネティック測定
   1. 再プログラミングの前に、各時点で再プログラミング実験の適切な数を設定します。再プログラミングの最初の7日間、再プログラミングの反応速度を測定するために、個々の形質導入は、所望の各時点のために実行されます。 7日目の後の時点では、再プログラミングイベントを測定するために継続するのに十分なフィーダー独立した時間点をシード。 6ウェルプレートの単一のウェルはフローサイトメトリー分析を実施するために細胞の十分な量が得られます。
   2. これは、エンドポイントアッセイであるとして、個々のウェルから全ての所望の再プログラミングの時点を測定します。線維芽細胞培地は、所望のウェルから吸引します。 D-PBSで一度洗浄します。
   3. D-PBS洗浄を吸引除去。ウェルを、0.05％トリプシン-EDTA溶液1mlを加えるが試験されます。 5分間、室温でインキュベートします。
   4. インキュベーション後、dissociウェルの表面に対して1ミリリットルの細胞懸濁液をフラッシュすることによって単一細胞に細胞を食べ、15ミリリットルコニカルチューブにサスペンションを移します。ウェルからの任意の残りの細胞を洗い流すと円錐15ミリリットルに追加するD-PBSの3ミリリットルを使用してください。さらに円錐管中の細胞液を希釈するために、追加のD-PBSの10ミリリットルを使用してください。
   5. 2分間200×gで細胞を遠心。上清を吸引し、DMEM / F-12培地の1ミリリットル中にペレットを再懸濁。以下、1×10 ⁶細胞/ mlで標準細胞懸濁液を作成するために必要な細胞数を実行します。
   6. SSEA4緑色蛍光フルオロフォア（1：200）にコンジュゲート：で以下の組み合わせを使用して、以下、1×10 ⁶細胞/ mlのためにDMEM / F-12培地1mlに選択の正/負の直接標識抗体の各アリコートを調製CD44は、遠赤蛍光を発する蛍光色素分子に結合させた緑色蛍光の蛍光体およびSSEA4にコンジュゲート、またはCD44-Cy5のをPEにコンジュゲート。インキュベート室温で45分間、細胞懸濁液を有する抗体。
   7. 一次抗体溶液を吸引し、予め温めておいたDMEM / F-12培地で2回洗浄します。
   8. 最終洗浄を吸引し、D-PBS 1ml中で細胞ペレットを再懸濁。ピペット個々のFACSチューブ内の各サスペンションの内容。
   9. 適切なネガティブコントロール（未染色およびアイソタイプコントロール）を使用して、サイ​​トメーター上の適切な前方および側方散乱プロファイルと電圧を確認します。 、初期の単一染色パラメータに応じて、対応するフルオロフォアのための電圧を設定遠赤色蛍光を発する蛍光体およびPE-Cy5の蛍光色素は赤色レーザーによって活性化される一方で、緑色の蛍光団は、BL1チャネルで取得した青色レーザーとシグナルによって活性化されるようにし、 RL1チャンネルで取得した信号。各時点での二重染色した人口を取得します。
   10. 適切な解析ソフトウェアを使用して、各時点でFCSファイルを分析し、ARRAにエディタを使用NGEデータは、時間の経過とともに人口式シフトを観察しました。
   11. 細胞選別は異なる時点で希望される場合は、5.1.6にステップ5.1.1に従ってください。使用するセルソーターのレーザー構成に応じて、適切な蛍光団の組み合わせを使用してください。
   12. 最終洗浄後、細胞ソーティング緩衝液1mlで細胞ペレットを再懸濁します。染色していない制御を使用して、適切な前方および側方散乱設定にセルソーターを設定します。各蛍光団のための適切な設定を設定するには、単一の染色されたコントロールを使用します。
   13. 二重染色細胞懸濁液の少量のサンプルを使用します。ソートする2集団を選択し、選別された細胞の適切な回収を確実にするために、それぞれの電荷を割り当てます。
   14. ソートされた細胞懸濁液は、クッション性とソート時に保護されることを保証するために、コレクションチューブに細胞回復培地200μlを追加します。細胞の欲望の数を収穫し、新鮮含む新しいiMEF皿に移しますLYリカバリー・メディアを作成しました。
   15. リカバリー・メディアとの一晩のインキュベーション後の培地を変更します。培養物は、その後供給され、日常的にペニシリン/ストレプトマイシン（100単位/ mlの最終濃度）を含むHPSC培地を用いて継代しなければなりません。

6.エンドポイント解析

1. 端末アルカリホスファターゼ（AP）染色
   1. 最終的な再プログラミング効率で観察された運動と形態学的イベントを相関させるために、端末発色性AP染色を使用してください。
   2. 再プログラミングの21日に続いて、端末AP染色で染色し、200 mMのTris-HCl（pH 8.0）で1回洗浄する井戸から培地を除去します。
   3. 200 mMトリスHCl中、製造元のマニュアルの指示通りに染色溶液の適切な量を準備します。
   4. 洗浄液を吸引除去し、各ウェルに調製した染色溶液の2ミリリットルを追加します。室温で20〜30分間インキュベートし、離れ番目から電子光。
   5. 染色溶液を吸引し、200mMのトリスHClで1回洗浄。洗浄を削除し、前の可視化に蒸留水を追加します。
   6. 通常撮影のカメラを使用して比色信号をキャプチャします。手で陽性に染色されたコロニーの数を数えます。染色はまた、本質的に蛍光性であるように、トリット-Cチャネルで蛍光分析を用いて染色を可視化し、全ウェルの撮影を行い、全ウェルイメージャーを用いて分析しました。製造業者のプロトコルを使用してください。

結果

フローサイトメトリーを使用したリプログラミング速度論を監視

SSEA4はPSCマーカー^6,10であるが、CD44は、線維芽細胞のマーカーです。この発現パターンから予想されるように、BJ線維芽細胞のフローサイトメトリーSSEA4を示している^-非染色サンプルと組み合わせて象限ゲートの作成 ​​を容易にCD44 ^+集団 。 SSEA4はゆっくりと表現している間にセンダイウイルスのDF1線維芽細胞の再プログラミング時には、CD44が徐々に失われます。 CD44 ⁺細胞および7日目（ 図1）で、より明確なになるSSEA4 ⁺ CD44 ⁺細胞の小集団^-仙台ウイルスによる形質導入後3日目では、SSEA4の大集団が存在します。状態^- 13...

ディスカッション

この研究は、フローサイトメトリーとリアルタイムイメージングベースの分析を使用して、再プログラミングプロセスを監視および追跡するための戦略を提供します。プロトコルの重要なステップは、再プログラミングの開始、マーカー発現に基づく再プログラミングの進行の測定、および再プログラミングのリアルタイムモニタリングです。任意のリプログラミング方法を使用できますが、ここでは仙台ベースのヒト線維芽細胞のリプログラミングに焦点を当てます。この方法の利点は、使いやすさと再プログラミングの一貫した高効率です。

再プログラミングの進行を評価するために、細胞は再プログラミングの個別の段階で回収され、エンドポイントフローサイトメトリー分析にかけられます。陰性PSCマーカーCD44および陽性PSCマーカーSSEA4による再プログラミング培養物の二重染色により、再プログラミングの進行を評価^{できます6。}より具体的には、再プログラミングの個別の段階でどちらか一方、どちらでもない、または両方のマーカーを発現する細胞の分布により、異なる条件下での再プログラミング動態の定量的比較が可能になります。この...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
DMEM、高グルコース、GlutaMAXサプリメント、ピルビン酸	サーモフィッシャーサイエンティフィック	10569-010
ウシ胎児血清、胚性幹細胞認定、米国原産	サーモフィッシャーサイエンティフィック	16141-061
MEM 非必須アミノ酸溶液 (100x)	サーモフィッシャーサイエンティフィック	11140-050
トリプシン-EDTA (0.05%)、フェノールレッド	サーモフィッシャーサイエンティフィ	25300-054
マウス(ICR)不活化胚性線維芽細胞	サーモフィッシャーサイエンティフィック	A24903
付着因子タンパク質 (1x)	サーモフィッシャーサイエンティフィック	S-006-100
DMEM/F-12, GlutaMAX supplement	サーモフィッシャーサイエンティフィック	10565-018
ノックアウト血清補充	サーモフィッシャーサイエンティフィック
2-メルカプトエタノール (55 mM)	Thermo Fisher Scientific	21985-023
コラゲナーゼ、IV型、粉末	Thermo Fisher Scientific	17104-019
TrypLE Select Enzyme (1x)、フェノールレッドなし	サーモフィッシャーサイエンティフィック	12563-011
DPBS、カルシウム、マグネシウムなし	サーモフィッシャーサイエンティフィック	14190-144
Geltrex LDEV-Free, hESC-Qualified, Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix	サーモフィッシャーサイエンティフィック	A1413302
エッセンシャル 8 ミディアム	サーモフィッシャーサイエンティフィック	A1517001
FGF-ベーシック (AA 1-155) 組換えヒトタンパク質	サーモフィッシャーサイエンティフィック	サイエン
UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0	サーモフィッシャーサイエンティフィ	15575-020
ウシアルブミンフラクションV(7.5%溶液)	サーモフィッシャーサイエンティフィック	15260-037
HEPES(1 m)	サーモフィッシャーサイエンティフィ	15630-080
ペニシリン-ストレプトマイシン(10,000 U/ml)	サーモフィッシャーサイエンティフィック	15140-122
InSolution, Y-27632	EMD Millipore	688001
CytoTune-iPS仙台リプログラミングキット	サーモフィッシャーサイエンティフィック	A1378001
CytoTune-iPS2.0仙台リプログラミングキット	サーモフィッシャーサイエンティフィック	A16517
Countess II 自動セルカウンター	サーモフィッシャーサイエンティフィック	AMQAX1000
カウンテスセルカウンティングチャンバースライド	サーモフィッシャーサイエンティフィック	C10228
BJ ATCC ヒト包皮線維芽細胞、新生児	ATCC	CRL-2522
DF1 成人ヒト皮膚線維芽細胞	サーモフィッシャーサイエンティフィック	N/A
BG01V/hOG 細胞 バリアント hESC hOct4-GFP レポーター細胞	サーモフィッシャーサイエンティフィック	R7799-105
IncuCyte ZOOM	エッセンバイオサイエンス
SSEA-4 抗体、Alexa Fluor 647 コンジュゲート (MC813-70)	Thermo Fisher Scientific	SSEA421
SSEA-4 抗体、Alexa Fluor 488 conjugate (eBioMC-813-70 (MC-813-70))	Thermo Fisher Scientific	A14810
SSEA-4 抗体 (MC813-70)	Thermo Fisher Scientific	41-4000
TRA-1-60 抗体 (cl.A)	Thermo Fisher Scientific	41-1000
CD44 ラット抗ヒト/マウスモノクローナル抗体(クローンIM7)、PE-Cy5コンジュゲート	サーモフィッシャーサイエンティフィック	A27094
CD44 Alexa Fluor 488 ライブセルイメージング用コンジュゲートキット	サーモフィッシャーサイエンティフィック	A25528
CD44 ラット抗ヒト/マウスモノクローナル抗体(クローンIM7)	サーモフィッシャーサイエンティフィック	RM-5700(販売終了)
ヤギ抗マウスIgG(H + L)二次抗体、Alexa Fluor 488コンジュゲート	モフィッシャーサイエンティフィック	A-11029
ヤギ抗ラットIgG(H+L)二次抗体、Alexa Fluor 594標識	サーモフィッシャーサイエンティフィック	A-11007
アルカリホスファターゼ生塩	Thermo Fisher Scientific	A14353
TRA-1-60 Alexa Fluor 488 コンジュゲートキット ライブセルイメージング用	Thermo Fisher Scientific	A25618
CD24 マウス抗ヒト mAb (クローン SN3), FITC コンジュゲート	Thermo Fisher Scientific	MHCD2401
β-2 Microglobulin Antibody, FITC コンジュゲート (B2M-01)	サーモフィッシャーScientific	A15737
EpCAM / CD326 Antibody, FITC conjugate (VU-1D9)	Thermo Fisher Scientific	A15755
CD73 / NT5E 抗体 (7G2)	Thermo Fisher Scientific	41-0200
VECTOR Red Alkaline Phosphatase (AP) Substrate Kit	Vector Laboratories	SK-5100
Zeiss Axio Observer.Z1 顕微鏡	Carl Zeiss	491912-0003-000
FlowJo データ解析ソフトウェア	FLOJO, LLC	N/A
Attune Accoustic Focusing Cytometer, Blue/Red Laser	Thermo Fisher Scientific	Use Attune NXT
S3e\ セルソーター (488/561 nm)	BIO-RAD	1451006
Falcon 12 x 75 mm Cell Strainer Cap Corning		352235
Falcon 15 ml, high-clarity, dome-seal screw cap	Corning	352097
Falcon T-75 Flask	Corning	353136
Falcon T-175 Flask	Corning	353112
Falcon 6-well dish	Corning	353046
Heraeus Heracell CO2 ローリングインキュベーター	サーモフィッシャーサイエンティフィック	51013669
ノンスティック、RNaseフリー マイクロチューブ、1.5 ml		AM12450
HulaMixer サンプルミキサー		15920D