方法論記事

シングルまたは共存化学/電気/せん断応力刺激下で細胞応答を研究するためのマイクロ流体デバイスを設計

DOI：

10.3791/54397

⸱

2016年8月13日

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Agricultural Chemistry, National Taiwan University, 2Department of Physics, Fu-Jen Catholic University, 3Research Center for Applied Sciences, Academia Sinica

この記事について

サマリー

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流体成分と統合された微細加工デバイスは、in vivoの微小環境を模倣した細胞研究のためのin vitroプラットフォームを提供します。私たちは、単一または共存する化学的/電気的/せん断ストレス刺激下での細胞応答を研究するためのポリメチルメタクリレートベースのマイクロ流体チップを開発しました。

要約

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マイクロ流体デバイスは、pH、温度、塩濃度、および他の物理的又は化学的刺激の正確で制御可能な細胞の微小環境を作り出すことが可能です。彼らは一般的に、周囲のように生体内で提供することにより、in vitro細胞研究のために使用されています。これらの現象は、細胞の性質や機能を理解する上で重要であるため、特に、細胞は化学勾配、電界、およびせん断応力に応じどのように多くの関心を集めています。これらのマイクロ流体チップは、ガラス基板、シリコンウエハ、ポリジメチルシロキサン（PDMS）ポリマー、ポリメチルメタクリレート（PMMA）基板、またはポリエチレンテレフタレート（PET）基板を用いることができます。これらの材料のうち、PMMA基板は安価であり、容易にレーザーアブレーション及び書き込みを使用して処理することができます。いくつかのマイクロ流体デバイスは、化学的および電気的な刺激を共存、複数の生成のために設計され、製作されてきたが、それらのどれもが考慮されませんでしたスクリーニング目的のために特に、実験の繰り返しを低減するのに十分な効率的。本稿では、単一または共存化学/電気/せん断応力刺激の下で、活性酸素種の産生および遊走に、細胞応答を調査するための2つのPMMAベースのマイクロ流体チップの私達の設計および製造を説明します。最初のチップが一緒に、これらの各領域内部に発生するせん断応力勾配で、文化領域に0、1/8、1/2、7/8、および1の5相対濃度を生成します。第2のチップは、同じ相対濃度が生成されますが、各培養領域内に作成された五つの異なる電界強度を持ちます。これらのデバイスは、正確な、制御可能な微小環境で細胞を提供するだけでなく、非常に実験的なスループットを向上させるだけではなく。

概要

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インビボで細胞は細胞外マトリックス（ECM）、炭水化物、脂質、および他の細胞を含む生体分子の様々な囲まれています。彼らは、このような種々の成長因子の化学的勾配にECMとの相互作用および応答としてマイクロ環境刺激に応答することによって官能基化。伝統的には、 インビトロの細胞研究は、細胞および試薬の消費量が大きく、細胞は、静的（非循環）環境で増殖細胞培養皿で行われます。最近では、流体コンポーネントと統合微細加工デバイスは、より制御方法で細胞研究のための代替プラットフォームを提供してきました。このような装置は、細胞および試薬の消費を最小限に抑えながら、化学的および物理的刺激の正確な微小環境を作り出すことが可能です。これらのマイクロ流体チップは、ガラス基板、シリコンウエハ、ポリジメチルシロキサン（PDMS）ポリマー、ポリメチルメタクリレート（PMMA）基板、またはpolyethylenetereで作ることができますフタレート（PET）は、1-3基質。 PDMSベースのデバイスは、長期細胞培養および研究に適してい、透明な生体適合性、およびガスに対して透過性です。 PMMA及びPET基板が安いとレーザーアブレーションと書き込みを使用して処理することが容易です。

マイクロ流体デバイスは、細胞が異なる化学的および物理的な刺激を受けやすい安定して制御可能な微小環境で細胞を提供する必要があります。例えば、マイクロ流体チップは、細胞の走化性を研究するために使用されます。代わりに、Boydenチャンバー及びキャピラリー4,5を採用する伝統的な方法でこれらの小型化流体デバイスは、細胞の行動1,6,7を研究するための正確な化学的勾配を生成することができます。別の例は、電界（EFS）の下のセルの方向性のある移動、走電性という名前の現象を研究することです。細胞のElectrotactic行動は、神経再生8、胚発生9に関連していることが報告されましたそして、10,11創傷治癒。そして、多くの研究は、癌細胞12,13を含む様々な細胞型の走電性を調査するために行われた、14,15リンパ球、白血病細胞11、及びセル16を生じます。従来から、ペトリ皿とカバーガラスは、排出係数17を生成するためelectrotacticチャンバを構築するために使用されます。このような簡単なセットアップは、媒体の蒸発と不正確な排出係数の問題を提起するが、彼 ​​らは囲まれた、明確に定義された流体チャネル12,18,19のマイクロ流体デバイスによって克服することができます。

体系的に正確な、制御可能な化学的および電気刺激下で細胞応答を研究するために、同時に複数の刺激を細胞に提供することができるマイクロ流体デバイスを開発するために非常に有用であろう。例えば、リーら 。単一または共存する化学勾配とのEF 20を作成するための PDMSベースのマイクロ流体デバイスを報告しました。花王ら 。 devのEF 6により肺癌細胞の走化性を調節するための同様のマイクロ流体チップを駆け落ち。また、スループット、侯らを増加させます。設計及び（2 EF強×4化学物質濃度）であり、8つの異なる複合刺激を細胞に提供するために、PMMAベースのマルチチャネルデュアル電界チップを作製した21。さらに全体で増加し、せん断応力刺激を追加するために、我々は、単一または共存化学/電気/せん断ストレス刺激下で細胞応答を研究するための2つのPMMAベースのマイクロ流体デバイスを開発しました。

ローら 22,23により報告され、これらのデバイスは、インビボ循環系を模倣する連続的な流体流動を受ける5つの独立した細胞培養チャネルを含みます。第1チップ（化学せん断応力チップまたはCSSチップ）、5相対0の濃度は、1/8、1/2、7/8、および1培養領域において生成され、せん断応力勾配があるれていますprodu5文化領域のそれぞれの内部をced。第2のチップ（化学電界チップまたはCEFチップ）において、電極2シリンジポンプの単一のセットを使用して、5 EF強度は、これらの培養領域に5つの異なる化学物質の濃度に加えて生成されます。数値計算とシミュレーションは、より良好な設計を行い、これらのチップを動作し、これらのデバイスの内部に培養肺癌細胞は、活性酸素種（ROS）の産生に対するそれらの応答を観察するための移動速度単一または共存刺激の対象とされていますそして、移動方向。これらのチップは、時間を節約する細胞は、種々の微小環境刺激に応答する方法を調査するため、高スループットと信頼性の高いデバイスであることが実証されています。

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プロトコル

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1.チップ設計と製作

  1. 描画パターンは、市販のソフトウェア24を使用して、PMMA基板と両面テープに切除されます。
    1. 5培養領域（ 図1Aおよび1B）のそれぞれにおいて、その端部で変化する幅の「クリスマスツリー」パターンを描く、化学的濃度及びせん断応力の影響を研究するために。
    2. 化学的濃度及び電界の影響を研究するために、塩橋のための2つ以上の流体チャネルとの「クリスマスツリー」パターン（ 図2Aおよび2B）を描きます。
  2. スクライブPMMAシートまたはCO 2レーザースクライバーに対応するファイルをロードすることによって、両面テープ上の個々のパターン。
    1. レーザースクライバーをオンにして、コンピュータとの接続を確認してください。市販のソフトウェアを使用して切除されるべきパターンを開きます。
    2. PMMAシートや両面テープOを配置スクライバーのステージのn個のトップ。キャリブレーションバーと可視He-Neレーザーを使用して、必要な場合、CO 2レーザーの焦点を調整します。
    3. PMMAシートまたはテープ上のアブレーションのためスクライバーにパターンをロードします。
    4. 、パターン化されたシートまたはテープを拾う不要な部分を削除し、窒素ブローで表面をきれいにします。
      注：PMMAシートの厚さは1mmであり、両面テープの0.07 mm以上0.22 mmです。

2.チップ実装

  1. スーパー接着剤で、上部のねじ山と穴を整列させることにより、チップの最上層に（真ん中のねじ山付き長さ×幅×高さ= 10ミリメートル×10ミリメートル×5ミリメートル）アクリルアダプターを接続します - ほとんどの層。これらのアダプタは、入口/出口をと塩橋コネクタ媒体としての役割を果たす。
  2. 層流フード内部のマイクロ流体チップを組み立てます。
  3. 化学せん断応力マイクロ流体チップ（CSSチップ）を組み立てます。
    1. Attachスクライブ両面テープの2枚を使用してスクライブPMMAシートの3枚。 （ 図1Aおよび1B）。
    2. チップの底に0.07ミリメートルの厚さの両面テープの1以上の部分を追加し、直径10cmのペトリ皿にチップを取り付けます。
    3. 一晩のための真空チャンバー内のアセンブリのチップを置きます。
  4. 化学-電界チップ（CEFチップ）を構築するには、0.22ミリメートル（ 図2Aおよび図2B）=厚さの両面テープにPMMAシートを添付します。
    1. テープのこの同じ部分を使用して、直径10cmのペトリ皿にスクライブPMMAシートと両面テープを取り付けます。
  5. フードの内側に組み立てられたチップを残すと殺菌のために30分間UVにそれを公開します。
  6. プラスチックチューブと指締めナットを介して2つの3ミリリットル注射器への入口を接続します。プラスチックチューブと指締めナットを介して廃液チューブにコンセントを接続します。
    注：オートクレーブ使用前に15分間、121℃で全てのチューブとナット。
  7. ゆっくりPBSでプライム流体チャネルに注射器のプランジャーを押し下げます。気泡を除去するために、前後にシリンジを押してください。
  8. 5％CO 2下、37℃で一晩培養器の内部にチップを置きます。
    注：これらの2つのステップは、チップを洗浄し、チップ内の任意の残りの気泡を除去することを目的としています。
  9. インキュベーターからチップを取ります。
  10. CEFチップに電界を発生させるための寒天塩橋を準備します。
    1. マイクロ波を用いて1×リン酸緩衝生理食塩水（PBS）緩衝液中の3％低融点アガロースを溶解します。
    2. 塩橋チャンネルにアガロース溶液相化し注入し、その溶液が固化する前に電極を挿入します。
    3. 筒状のナットに銀/塩化銀電極を配置します。
  11. シリンジポンプにシリンジを接続し、連続的に培養液を流す（ダルベッコ変法EagleR17; PBSを交換する20μL/分の流速で10分間、流体チャネルへの培地、DMEM）。

3.細胞の調製と実験のセットアップ

注：前の暖かい1×PBS、培地（DMEMプラスFBS）、使用前に37℃の水浴中でトリプシン。

  1. プレート2×10 5肺癌CL1-5細胞をDMEM + 10％ウシ胎児血清（FBS）が供給さ10 cmのペトリ皿中25,26。 90％コンフルエンスになるまで37℃で5％CO 2下で培養器内部の細胞をインキュベートします。
  2. 培地を吸引し、予め温めておいた1×PBSで細胞を1回洗浄します。細胞に0.05％トリプシンバッファーの2ミリリットルを加え、細胞を剥離するために37℃で2〜3分間待ちます。
  3. 15ミリリットルの滅菌遠心チューブに細胞を移し、チューブに培養液の6ミリリットルを追加します。静かに混合するためにチューブを反転し、hemocytometeに細胞数をカウントするための細胞含有培地の5μLを取り出しますrを。
  4. 300 xでチューブを遠心 5分間G。培養液1ml中の10 6細胞を懸濁し、1 mlシリンジに細胞含有培地を配置します。
  5. コンセントからマイクロ流体チップに細胞含有培地を注入し、溶液を5培養領域を介してすべてを配布していることを確認してください。 2時間、37℃で5％CO 2下で培養器内部のチップをインキュベートします。

4.実験のセットアップ

  1. インキュベーターからチップを取り、透明なインジウムスズ酸化物（ITO）ガラスヒーターの上部に置き。
    注：ITOガラスは、熱カプラからのフィードバックを介して、37±0.5℃の温度を維持するために、比例積分微分（PID）コントローラに接続されているITOヒータとチップとの間でしっかりとクランプ。
  2. 細胞移動または固定のXYステージを追跡するための倒立顕微鏡の電動XYステージの上にチップヒータアセンブリを置きますROSの産生を測定するための倒立蛍光顕微鏡。
  3. （培地中に溶解した）相対濃度0および1の化学溶液5mlで2つのシリンジを充填する、異なる化学濃度を生成し、所望の流速でチップにそれらをポンピングする：CSSチップに0.3 mlと流速で1時間/分;最初の20分間、20μL/分の流速でCEFチップ、および他の120分間（合計時間= 2時間）20μL/ hrの流量です。
  4. 細胞移動を追跡するためのCEFチップ、プログラムでは、顕微鏡のXYステージは、2のための培養領域内のビュー（のFOV）の特定のフィールドの（DSLR）カメラ、デジタル一眼レフを経て、15分ごとに写真を撮って繰り返します時間。
  5. ROSの産生を測定するために、蛍光ベースインジケータ2'-7'- dichlorodihydrofluoresceジアセテート（2'-7'- DCFDA）を使用します。
    1. 分子生物学グレードジに10mMで2'-7'- DCFDAの株式を準備しますメチルスルホキシド（DMSO）。唯一の血清を含まないDMEM中DCFDA（DMEM中で5μM）を希釈します。潜在的な脱アセチル化酵素は、バックグラウンドシグナルを増加させ、細胞内シグナルを減少させる可能性があります。
    2. CSSチップ内またはCEFチップ内のEF刺激の2時間後のせん断応力刺激の1時間後、20μl/分の流速のためにチップに2'-7'- DCFDA（DMEM中で5μM）をポンプ最初の20分であり、さらに20分間、20μL/ hrの流速。洗浄のために、20分間、20μL/ hrの流速でチップにDMEMポンプ。
    3. 蛍光強度を分析するための培養領域内の特定のFOVと、電荷結合素子（CCD）カメラを介して、写真を撮ります。

化学濃度、せん断応力、および電場の5計算

  1. CSSチップとCEFチップの両方で、5培養領域において化学的な濃度を計算。例えば、concentrのH 2 O 2を注入しations 2つの入口から0と200μM、0の濃度が、25、100、175、および200μMが生成されます。
    注：すべての液体がフォークの周りに円滑かつ均等に流れを分割すると仮定することにより、5培養分野での相対濃度は、それぞれ、0、1/8、1/2、7/8、および1です。
  2. CSSチップにおいて、用いた培養の各領域内の剪断応力（τ）を計算します figure-protocol-1 Qは体積流量であり、27は 、ηは流体の粘度であり、Hは、チャネルの高さであり、Wはチャンネルの幅です。
    注：各入口（Q = 0.12 ml /分各培養領域）において、Q = 0.3 ml /分に設定することによりη= 0.0008ペンシルバニア・sの培地、H = 1 mmであり、w = 1~4 mmのためのせん断応力は、0.0048 PA（幅4mm領域）から0.0192 PA（幅1mmの領域）の範囲であると計算されます。
  3. にCEFチップ、Iは培地の導電率であるσ流体チャネルに流れる電流であるE = I /（σAのEFF）（オームの法則）を用いて培養の各領域内EF強度を計算し、そしてeffはチャネルの有効断面積です。
    注：σを使用して= 1.38Ω-1メートル-1培地とEFF = 0.22ミリメートル2（幅= 1ミリメートル、高さ= 0.22ミリメートル）のために、EF強度はE（MV / mm）となるように計算された= I（ A）3.3×10 6×。
    1. 図2Dに示すように、4つの（8 + 35 + 8）セグメントと一つ（5 + 35 + 5）セグメントと5のC部の回路と同等の回路を扱います。
      注：キルヒホッフの電圧法則とオームの法則に従って、この並列回路を分析することにより、5文化を横切って流れる電流があります私は下から上にI 1〜5は 、周りの0.49 I（エリア1）、0.25 I（エリア2）、0.13 I（エリア3）、0.08 I（エリア4）、および0.05 I（面積になるように計算されています5）、それぞれ、 どこ総直流（DC）です。 0.157ミリアンペア、254の排出係数、130、67、41、および26 MV / mmでの適用直流で5培養領域内で生成されます。
      注：マイクロ流体ネットワークの単純化された電気的分析のために、すべての流体セグメントは、それらの長さに比例した抵抗の抵抗として考えられています。

6.データ解析

注：データ解析は、ImageJソフトウェアを使用して行われます。

  1. ROSの産生を分析します。
    1. ImageJソフトウェアを実行します。蛍光画像をロードするために、「ファイル」→オープンに行くが分析されます。
    2. イムを変更するには、「イメージ」→「タイプ」→「16ビット」に移動しますグレースケールの年齢。
    3. セルを囲むポリゴンを描画します。細胞の平均蛍光強度を測定するために→「測定」を「分析」に進んでください。
    4. 3つの独立した実験の少なくとも50個の細胞からの強度を収集し、平均値の標準誤差（SEM）との平均強度を計算するために6.1.3を繰り返します。
    5. 各実験条件について6.1.1-6.1.4を繰り返します。
  2. 細胞移動を分析します。
    1. ImageJソフトウェアを実行します。時間= 0で撮影した画像をロードするために、「ファイル」→オープンに行くが分析されます。
    2. セルを囲むポリゴンを描画します。 （Y 1、×1）のような細胞の重心を測定するための「分析」→「測定」に移動します。
    3. 別の画像から（Y 2、X 2）と同じセルの重心を測定するために6.2.1- 6.2.2を繰り返し、時間= tに取ります。
    4. の（ミクロン/時間で）移動速度を計算しますこのセルとしてfigure-protocol-2 。
    5. 3つの独立した実験の少なくとも50個の細胞からの移行率を収集し、平均値の標準誤差（SEM）で、平均移動速度を計算するために6.2.1-6.2.4を繰り返します。
    6. 6.2.2と6.2.3から、コサインθとして、この細胞の遊走directednessを計算したり、 figure-protocol-3ここで、θは （正から負への）適用されたEFのベクトルと、開始からのセル（ 図2G）の終了位置へのベクトル間の角度です。
    7. 3つの独立した実験の少なくとも50個の細胞からの移行directednessを収集し、平均値の標準誤差（SEM）で平均移行directednessを計算するために6.2.6を繰り返します。
    8. SEMで平均移動速度と各実験条件についてSEMで平均移行directednessを計算します。
      注：directedness1のすべてのセルをカソードに向かって移動することを示し、-1の値は、すべてのセルは、陽極に向かって移動することを示しています。ランダムに移動する細胞群のdirectednessは0に近いです。
  3. セルの配置を分析します。
    1. ImageJソフトウェアを実行します。分析する画像をロードするために、「ファイル」→「開く」に移動します。
    2. 楕円のような細胞を治療し、細胞の長軸を示すために線を引きます。ラインと水平EF方向の間の角度βを測定するための「分析」→「測定」に移動します。
    3. 3つの独立した実験の少なくとも50個の細胞からβを収集し 、平均値の標準誤差（SEM）で平均余弦βを計算するために6.3.2を繰り返します。
    4. 各実験条件について6.3.1-6.3.3を繰り返します。
      注：1のβのcos Aは、すべての細胞が適用されたEFに平行に整列することを示し、0の値は、すべての細胞がperpendicularlを揃えることを示しています適用されたEFへのy。

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結果

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化学せん断応力（CSS）チップ

CSSチップは、二つの両面テープを介して貼り合わせ3 PMMAシート、厚さ1mmのそれぞれ、厚さ0.07ミリ（ 図1Aおよび1B）のそれぞれで構成されています。 「クリスマスツリー」構造は、5つの培養領域に0、1/8、1/2、7/8、および1の5相対濃度を生成します。体積流量、流体の粘度、および流体チャネルの寸法を関連する大きさで、三角形、せん断応力勾配として培養面積を設計することにより、各領域内で作成されます。このチップは、その後、CL1-5細胞およびROSの産生が異なる化学濃度および剪断応力に応答して観察された肺癌を培養するためのペトリ皿に、別の0.07 mm厚両面テープを介して取り付けられています。肺癌細胞におけるROSの産生を強くLUに関連していますngの癌転移および開発、ならびに特定の化学物質及びせん断応力がROS生成23...

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ディスカッション

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PMMAベースのチップは、より複雑なソフトリソグラフィを必要とするPDMSベースのチップに比べて安価かつ容易な方法であるレーザーアブレーションと書き込みを使用して製造されます。マイクロ流体チップを設計した後、製造および組立はわずか5分以内に行うことができます。注意が実験を行う際にに支払われるべきであることを、いくつかの重要なステップがあります。最初は「組み立て」の問題です。アダプタは、チップの最上層に適切に接着されるべきです。あまりに多くが適用される場合、接着剤が流体チャネルに漏れる可能性があり、あまりにも少ない接着剤が使用される場合、液体は、チップの外に漏れる可能性があります。また、PMMA基板と両面テープを組み立てるには、任意の液漏れを防止するためにしっかりとチップ全体を押圧する圧力を適用することが重要です。第二は、「バブル」の問題です。気泡を除去するために、1×PBSを連続的に20μL/分の流速で1または2分間流路に流入し、次いで、チップをP37℃で一晩、5％CO 2下で培養器の内部に混入されました。流路内に残留する気泡がある場合は、フローは、不均一な化学物質濃度とEF分布を引き起こし、不均一になります。第...

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開示事項

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著者らは開示するものは何もない。

謝辞

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この作業は、契約番号に基づいて台湾の科学技術部によって財政的に支援されました。MOST 104-2311-B-002-026(KYロー)、いいえ。MOST 104-2112-M-030-002 (Y. S. Sun)、およびNational Taiwan University Career Development Project (103R7888) (K. Y. Lo).また、著者らは、細胞培養室の使用について、国立台湾大学新興材料先端デバイスセンターに感謝します。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
ダルベッコの改変イーグル培地(DMEM)Gibco11965-092培養培地
トリプシンGibco25300-054から細胞を切り離
シ胎児血清(FBS)Gibco10082147細胞培養培地
10cm細胞培養シャーレNunc150350細胞培養
Bright-Line 血球計算盤シグマZ359629細胞計数装置
PMMAカスタマイズカスタマイズマイクロ流体チップ
アダプターカスタマイズマイクロ流体チップ
0.07/0.22 mm 両面テープ 3M8018/9088マイクロ流体チップ
低融点アガロースシグマA9414トブリッジ
2'-7'-ジクロロジヒドロフルオレッセスジアセテートシグマD6883内ROS測定
酸化インジウムスズ(ITO)ガラスク300739ヒーター
-積分-微分コントローラー JETECエレクトロニクス(株)TTM-J4-R-AB温度調節器
熱カプラーTECPELTPK-02A温度調節器
CO2 レーザースクライバーレーザーツール &テクニクス株式会社ILS2マイクロ流体チップ製造
シリンジポンプNew EraNE-300チップへの媒体と薬品のポンピング
電源メジャーサイエンス MP-300V直流電流供給
倒立顕微鏡オリンパスCKX41細胞移動モニタリング
倒立蛍光顕微鏡ニコンTS-100細胞移動・蛍光信号モニタリング
デジタル一眼レフカメラCanon60D明視野画像の記録 
CCDカメラニコンDS-Qi1蛍光画像の記録 
瞬間接着剤3M Scotch7004PMMA基板へのアダプターの取り付け
AutoCADAutodesk Inc.マイクロ流体チップの設計
DMSOSigmaD8418溶解 DCFDA
ImageJ国立衛生蛍光強度と細胞遊走の定量化
細胞皿す ウソル細胞メル比例研究所

参考文献

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