私たちは、細胞および薬物送達のためのデバイスとしてRGD官能化ハイドロゲルを合成するためのプロトコールを提示します。この手順には、アルキン修飾ポリアクリル酸(PAA)とRGD-アジド誘導体との間の銅触媒アルキン-アジド環化付加(CuAAC)が含まれます。ハイドロゲルは、マイクロ波支援重縮合を使用して形成され、それらの物理化学的特性が調査されます。
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この記事について
サマリー
要約
生体材料としてのポリマーの使用は、治療用途において大きな利点を提供してきました。特に、生体適合性、機械的特性、または細胞生存率を向上させることができる化合物でポリマー鎖を修飾および官能基化する可能性により、生物医学分野における新たな課題に対応するための新しい材料の設計が可能になります。ポリマー官能基化戦略により、クリックケミストリーは、ポリマーデバイスの細胞適合性と薬物送達特性を改善するための強力なツールです。同様に、生物医学では、毒性や生物学的環境の汚染などの潜在的な悪影響を避けるために無菌ツールを使用するという基本的なニーズがあるため、マイクロ波支援戦略への関心が高まっています。
クリックケミストリーとマイクロ波支援法の組み合わせは、生物医学用途で望ましい機能と改善された性能を持つ生体適合性のハイドロゲルを生成するのに適しています。この研究は、RGD官能化ハイドロゲルの合成を目的としています。RGD(アルギニルグリシルアスパラギン酸)は、細胞接着タンパク質を模倣して細胞表面受容体に結合するトリペプチドであり、ハイドロゲルの3Dポリマーネットワーク内の細胞にとって快適な微小環境を作り出します。RGD官能基化は、Huisgen 1,3-双極子環化付加によって行われます。一部のPAAカルボキシル基はアルキン部分で修飾されていますが、RGDはペプチド配列の末端残基としてアジド酸で官能基化されています。最後に、両方の生成物を銅触媒クリック反応で使用して、ペプチドをPAAに永久的に結合します。この変性ポリマーは、カルボマー、アガロース、ポリエチレングリコール(PEG)とともに使用され、ヒドロゲルマトリックスを合成します。この3D構造は、PAA由来のカルボキシル基とアガロースおよびPEG由来のカルボマー基およびヒドロキシル基がマイクロ波支援重縮合によりエステル化反応を起こすことで形成されます。ゲル化メカニズムの効率性により、高度なRGD機能化が保証されます。さらに、この官能基化されたネットワーク内に治療用化合物または生物学的ツールをロードする手順は非常に簡単で再現性があります。
概要
ヒドロゲルは天然または合成された親水性架橋ポリマーで形成された三次元ネットワークであり、独特の三次元構造によって特徴付けられます。これらのデバイスは、薬物送達、組織工学、遺伝子キャリアとスマート・センサ1,2の生物医学分野でますます魅力的です。実際、その高い水含有量、ならびにそれらのレオロジーおよび機械的性質は、それらの適切な候補が軟組織微小環境を模倣し、水溶性のサイトカインまたは増殖因子の送達のためにそれらの効果的なツールにするために行います。最も有望な使用の一つは、細胞および生物活性化合物を運ぶ注射用生体材料としてです。 インビトロおよびインビボ実験3,4で観察されたようなヒドロゲルは、保持して正確な生理学的関連性の様式で幹細胞の調節シグナルを送達することによって、細胞の生存および制御幹細胞の運命を改善することができます。このの主要な利点は、可能性であります体の上にすべてを移行し、目標の目標5を失って 、循環急流にエリアとextravasatesを離れる細胞の量を最小限に抑え、（ その場で ）接種のゾーン内注入した細胞を維持します。三次元ハイドロゲルネットワークの安定性は、ポリマー鎖の6間の共有結合または凝集力によって形成され、その架橋部位です。
このフレームワークでは、直交選択的化学は、ポリマー鎖に適用される....
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プロトコル
注：受信のような化学物質が使用されています。線形RGDを購入し、それは標準的なFmoc固相ペプチド合成16,19によって調製することができます。溶媒は分析グレードのものです。透析はカットオフに等しい3500にダワット Mを有する膜を使用する必要があります。合成された化合物は、溶媒、化学シフトとしてクロロホルム（CDCl 3中）または重水（D 2 O）を使用して400 MHzの分光計で記録された1 H NMRスペクトルにより特徴づけられる百万分率でδ値として報告されます。さらに、ヒドロゲルは、KBrペレット技術を使用してFT-IR分析に供し、その物理的特徴付けは、37℃で反転試験管を用いて評価し、ゲル化の研究を含むています。
4-Azidobutanoyl塩化物1の1の合成
- ジクロロメタン10ml及びジメチルホルムアミド0.5ml中の4- azidobutanoic酸（3.90ミリモル）の500ミリグラムを溶解します。
- 0°Cで溶液を冷却氷浴を使用して。
- 攪拌しながら、反応系に滴下して加えるゆっくりジクロロメタン5mlに塩化オキサリル（5.85ミリモル）の505μLを加え、。
- 氷浴を用いて0℃で1時間後、室温に戻します。
- ロータリーエバポレーターを用いて減圧下で溶媒を除去します....
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結果
nは、カルボキシル基のアミンと反応するモノマーラベル図1に示したようにPAAのアルキン誘導体を効率的に、ポリアクリル酸、およびプロパルギルアミンから合成されます。生成物の同定は、1 H-NMR分光法によって確認される。 図5は、三重結合で変性されたPAAの1 H-NMRスペクトルを示す図 。
図5：PAA の 1 H-NMRスペクトルは、アルキン部分に関連する信号が強調表示されているアルキンを変更しま.......
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ディスカッション
アルキン部分によるPAA後重合修飾とアジド基によるRGD官能基化により、ポリマーとペプチド間の安定した結合の形成が保証されます。実際、トリアゾールは炭素原子間の剛性結合単位として機能し、1,2,3-トリアゾール環の1,4位に結合し、加水分解またはその他の方法で切断することはできません。さらに、トリアゾールは、ベンゼノイドや関連する芳香族複素環24などの他の環状構造とは異なり、酸化および還元することが極めて困難である。このように、PAA-RGD生成物の化学的不安定性は、ヒドロゲル合成の実験条件下ではほとんど存在しません。ペプチドは、その化学結合の性質により3Dポリマーネットワークにグラフト化され、物理的に閉じ込められません(したがって、システムから離れる可能性があります)。
アルキンPAAは、EDCおよびHOBtの存在下で水溶液中でプロパルギルアミンを用いて調製し、アミン誘導体を得る。実験結果は、PAAに結合する三重結合の割合が使用されるアミンの量に比例することを示しています。NMR分析を参照すると、試薬PAAとプロパルギルアミンのモル比が1:1の場合、ポリマー.......
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開示事項
著者は利益相反を述べておらず、この原稿の準備のために支払いを受け取っていません。
謝辞
著者は、言語の編集のために実りある議論のための教授マウリツィオ瑪斯とミスキアラAllegrettiに感謝したいと思います。本研究は、坂東GIOVANI Ricercatori 2010（MinisteroデッラサルーテGR-2010- 2312573）によってサポートされています。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| ポリ(アクリル酸)溶液平均 Mw ~100,000, H2O | Sigma Aldrich | 523925 | CAS 9003-01-4 |
| ポリ(エチレングリコール) 2,000 | Sigma Aldrich | 84797 | CAS 25322-68-3 |
| Carbomeer 974P | Fagron | 1387083 | |
| Agarose | インビトジェン株式会社 | 16500-500 | UltraPure Agarose |
| RGD peptide | abcam ab142698 | ||
| 4-アジドブタン酸 | Aurum Pharmatech | Z-2421 | CAS 54447-68-6 |
| 塩化オキサリル | Sigma Aldrich | O8801 | CAS 79-37-8 |
| 塩酸プロパルギラミン 95% | Sigma Aldrich | P50919 | CAS 15430-52-1 |
| ヨウ化銅(I) Sigma | Aldrich | 3140 | CAS 7681-65-4 |
| アスコルビン酸ナトリウム | Sigma Aldrich | Y0000039 | CAS 134-03-2 |
| リン酸緩衝生理食塩水 | Sigma Aldrich | P4417 | |
| 透析膜 | スペクトラム研究所 | 132725 | Spectra/Por 3透析膜 標準RCチューブ MWCO:3.5 kD |
参考文献
- Slaughter, B. V., Khurshid, S. S., Fisher, O. Z., Khademhosseini, A., Peppas, N. A. Hydrogels in Regenerative Medicine. Adv. Mater. 21 (32-33), 3307-3329 (2009).
- Rossi, F., Perale, G., Papa, S., Forloni, G., Veglianese, P. Current options for drug delivery to the spinal cord. Expert Opin. Drug Deliv.
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