方法論記事

非コード小型RNA定量化のための高密度リポタンパク質の単離

DOI：

10.3791/54488

⸱

2016年11月28日

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Medicine, Vanderbilt University School of Medicine, 2Center for Quantitative Sciences, Vanderbilt University School of Medicine, 3Department of Cancer Biology, Vanderbilt University School of Medicine

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

このプロトコルは、高密度リポタンパク質の小さなRNAの単離と定量化を説明しています。

要約

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

小さな非コードRNA（のsRNA）の多様性は急速に拡大し、生物学的プロセスにおける役割、遺伝子調節を含む、浮上しているされています。最も興味深いことに、sRNAsはまた、細胞の外で発見されており、安定的にすべての生物学的流体中に存在しています。このように、細胞外sRNAsは、疾患バイオマーカーの新規なクラスを表し、おそらく、細胞シグナル伝達および細胞間通信ネットワークに関与しています。バイオマーカーとしての可能性を評価するために、sRNAsは血漿、尿、および他の体液中で定量することができます。それにもかかわらず、完全に内分泌信号のような細胞外sRNAsの影響を理解するために、キャリアが輸送と細胞や組織は、細胞外のsRNAプールに貢献する生物学的流体（ 例えば、血漿）、でそれらを保護し、細胞や組織ができるされているかを決定することが重要です外のsRNAを受け入れ、利用します。これらの目標を達成するために、細胞外のキャリアの非常に純粋な集団を単離することが重要ですsRNAプロファイリングおよび定量化のため。我々は以前に、リポタンパク質、特に、高密度リポタンパク質（HDL）、細胞およびHDL-miRNAの間の機能的マイクロRNA（miRNAの）の輸送を大幅疾患において変化していることを実証しました。ここでは、詳細高の両方を使用して、miRNAを含むすべてのsRNAs、下流のプロファイリングおよび定量化のための高純度のHDLを得るために、密度勾配超遠心分離（DGUC）と高速タンパク質液体クロマトグラフィー（FPLC）でタンデムHDL分離を利用した新しいプロトコルシーケンシングおよびリアルタイムPCRアプローチ-throughput。このプロトコルは、HDL上のsRNAsの調査のための貴重な情報源となります。

概要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

細胞外の非コード小型RNA（sRNAs）疾患のバイオマーカーおよび潜在的な治療標的の新しいクラスを表し、おそらく細胞間コミュニケーション1を容易にします 。 sRNAの最も広く研究されているタイプは、長さが約22 NTSであり、長い前駆体型および一次転写産物2から処理されるマイクロRNA（miRNAを）です。 miRNAは、転写後ためにタンパク質翻訳及びmRNA分解2の誘導の抑制を介して遺伝子発現を調節することが実証されています。それにもかかわらず、miRNAはsRNAsの多くの種類のひとつです。 sRNAsは、親のtRNA（tRNAの由来sRNAs、TDR）、小核のRNA（のsRNA由来sRNAs、sndRNA）、小核小体のRNA（のsnoRNA由来sRNAs、snRNAの）、リボソームRNA（rRNAの由来sRNAs、RDRから切断することができるように）、YのRNA（YDR）、およびその他のRNA 1。これらの新規sRNAsのいくつかの例は、miRNAと同様に機能することが報告されています。しかし、生物学的府遺伝子調節における役割は3-6可能性があるが、これらのsRNAsの多くのnctionsは、まだ決定されていません。最も興味深いことに、miRNAおよび他のsRNAsは、唾液、血漿、尿、及び胆汁を含む細胞外液、中に安定に存在しています。外sRNAsは、おそらく、細胞外小胞（EV）、リポタンパク....

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

プロトコル

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. HDL精製（〜5.5日）

  1. 密度勾配超遠心分離（DGUC、〜5日）
    1. 新鮮な静脈血から分離された血漿の9 mLに100倍の抗酸化剤の90μLを追加します。
    2. ステップ1.1.1（0.0278グラム/ mLの臭化カリウム血漿）からの血漿の9 mLに0.251グラムのKBrを追加することによって、1.025グラム/ mLに1.006グラム/ mLのKBrを持つプラズマ密度を調整します。すべての塩は室温で溶解し、チューブを超遠心し、すべての気泡がトップに上昇を確認するために転送されるまで、プラズマをロック。
    3. ベンド先端から90℃で1センチメートル18-G針の先端は、ベベル側が上を向きます。シリンジと18ゲージの針を使用して、慎重にプラズマ（ 表1）の上にオーバーレイ溶液＃1の3ミリリットルを配置します。
      注：曲がった針は、すべてのVLDL / IDL、LDLを確保し、HDLがオーバーレイと混合せずに削除されます。
    4. チューブの上部とcarefuにメニスカスから3ミリメートルのスペース - 2を残して、上部の気泡の大部分を削除しますLLY SW-40Tiバケットにチューブを配置します。
    5. バランスに（キャップ​​付き）各バケットを計量し、正反対のバケット（バケット+キャップ）とのバランス：第6位に＃1〜＃4、＃5から＃2、＃3。
      注：これらのバケットは、常にバランスと一致する....

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

結果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

このプロトコルは、ハイスループットシークエンシングまたはリアルタイムPCR（ 図1）により、高純度HDL上のsRNAsの定量化を可能にするために一緒にリンクされている確立された方法のシリーズです。このプロトコルの実現可能性と影響を実証するために、HDLは、タンデムDGUCおよびFPLCの方法によって、ヒト血漿から精製しました。 HDL（コレステロール分布による）に対応する収集FPLC画分を濃縮し、全RNAをHDL 1mgの（全タンパク質）から単離しました。 sRNAライブラリは、n = 4健康なヒト被験者から収集されたHDLで生成されました。全てのヒト血液/血漿サンプルは、アクティブな治験審査委員会プロトコル（＃070416）の下で収集した、医学のバンダービルト大学によって承認されたヒト被験者はインフォームドコンセントに登録しました。準備のsRNAライブラリは、高度なゲノム（VANTAGE）DNA配列決定センターとデータ分析を行ったためヴァンダービルト・テクノロジーズで配列決定しました社内のパイプラインを使用して。データの視覚化は、ソフト.......

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

ディスカッション

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

このプロトコルは、非常に純粋なHDLのハイスループットシークエンシングまたはリアルタイムPCRによりmiRNAおよび他のsRNAsを定量化するために設計されています。いずれのアプローチと同様に、特別な配慮を浄化HDLおよびRNAのプロセスの各ステップに与えられ、その後sRNAsを定量化する必要があります。このプロトコルは、プラズマの≥2 mLで始まるプロジェクトのために設計されています。それにもかかわらず、高品質のRNAの分析は、正常アフィニティークロマトグラフィーを使用して、ヒトまたはマウス血漿のわずか80μLから精製したHDLで完了することができます。しかし、より大きな出発プラズマボリュームがここに提示される方法を使用して、より良いデータを生成します。サンプル処理及び抽出方法が劇的なmiRNA /のsRNAの品質と歩留まりを変更することができます。抗凝固剤の使用は、血漿採取のために不可欠ながら、おそらく下流の抽出に影響を与えます。例えば、ヘパリンは、容易にRNA抽出14,15の間に除去されず、PCR 16-18において利用下流の酵素を阻害することができます。また、第EREは、クエン酸ナトリ.......

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

開示事項

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

著者らは開示するものは何もない。

謝辞

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

この作業は、国立衛生研究所、国立心肺血液研究所からK.C.V. HL128996、HL113039、およびHL116263に対する賞によって支援されました。この研究は、アメリカ心臓協会からK.C.V. CSA2066001、D.L.M POST26630003、およびRMA POST25710170への賞によっても支援されました。

....

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
超遠心分離機 ベックマン・コールターA99839オプティマ XPN-80
超遠心分離機ローターベックマン・コールター331362SW-41Ti
AKTA ピュア FPLC システムGE ヘルスケア29018224
3x FPLC スーパーデックス 200 増加カラム インラインGE ヘルスケア2899094410/300 gl
シナジーマックスバイオテック インスツルメンツ7191000
卓上遠心分離機Thermo Scientific75004525Sorvall ST40R
冷蔵遠心分離機Eppendorf226298675417R (USA Scientificから購入)
Microfuge USA Scientific2631-0006
PippenPrepSage SciencePIP0001
2100 バイオアナライザー AgilentG2938B
高感度DNAアッセイAgilent5067-4626
シーケンシングライブラリ qPCR 定量キットIlluminaSY-930-1010
ProFlex サーマルサイクラーApplied Biosystems4484073
QuantStudio 12k FlexApplied Biosystems4471134
EpMotion RobotEppendorf9600001115070
超透明遠心チューブベックマン・コールター344059
臭化カリウムフィッシャーケミカルズP205-500
15 mL コニカルチューブThermo Scientific339650
マイクロ遠心フィルター 0.45 & マイクロ;mミリポアUFC30HV00
マイクロ遠心フィルター 0.22 & マイクロ;mMilliporeUFC30GV00
miRNAEasy Total RNA Isolation KitsQiagen217004
Total Cholesterol colormetric kitCliniqa (Raichem)R80035
10,000 m.w. カットオフ遠心分離フィルターAmiconUFC801024Millipore
PCR strip tubesAxygenPCR-0208-CFisher を通じて購入
microRNA RTキットライフテクノロジー43665971000反応用
PCRマスターミックスライフテクノロジーズ 444004150mLボトル
ピアスBCAキットサーモサイエンティフィック23225
クリーン&コンセントレーターキットザイモD4014
透析チューブスペクトラムラボ132118フィッシャーから購入
bcl2fastq2Illuminan/aソフトウェア
Cutadapthttps://github.com/marcelm/cutadaptn/aソフトウェア
NGSPERLgithub.com/shengqh/ngsperln/aソフトウェア
CQSToolsgithub.com/shengqh/CQS.Toolsn/aソフトウェア
Bowtie 1.1.2 http://bowtie-bio.sourceforge.netn/aソフトウェア
GeneSpringGX13.1.1Agilentn/aソフトウェア
ズ

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Vickers, K. C., Roteta, L. A., Hucheson-Dilks, H., Han, L., Guo, Y. Mining diverse small RNA species in the deep transcriptome. Trends Biochem Sci. 40, 4-7 (2015).
  2. Bartel, D. P. MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function. Cell. 116, 281-297 (2004).

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

再版と許可

このJoVE記事のテキストまたは図の再利用許可をリクエスト

許可をリクエスト

タグ

RNA HDL BCA

関連記事