方法論記事

非コード小型RNA定量化のための高密度リポタンパク質の単離

DOI：

10.3791/54488

⸱

2016年11月28日

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Medicine, Vanderbilt University School of Medicine, 2Center for Quantitative Sciences, Vanderbilt University School of Medicine, 3Department of Cancer Biology, Vanderbilt University School of Medicine

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

このプロトコルは、高密度リポタンパク質の小さなRNAの単離と定量化を説明しています。

要約

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

小さな非コードRNA（のsRNA）の多様性は急速に拡大し、生物学的プロセスにおける役割、遺伝子調節を含む、浮上しているされています。最も興味深いことに、sRNAsはまた、細胞の外で発見されており、安定的にすべての生物学的流体中に存在しています。このように、細胞外sRNAsは、疾患バイオマーカーの新規なクラスを表し、おそらく、細胞シグナル伝達および細胞間通信ネットワークに関与しています。バイオマーカーとしての可能性を評価するために、sRNAsは血漿、尿、および他の体液中で定量することができます。それにもかかわらず、完全に内分泌信号のような細胞外sRNAsの影響を理解するために、キャリアが輸送と細胞や組織は、細胞外のsRNAプールに貢献する生物学的流体（ 例えば、血漿）、でそれらを保護し、細胞や組織ができるされているかを決定することが重要です外のsRNAを受け入れ、利用します。これらの目標を達成するために、細胞外のキャリアの非常に純粋な集団を単離することが重要ですsRNAプロファイリングおよび定量化のため。我々は以前に、リポタンパク質、特に、高密度リポタンパク質（HDL）、細胞およびHDL-miRNAの間の機能的マイクロRNA（miRNAの）の輸送を大幅疾患において変化していることを実証しました。ここでは、詳細高の両方を使用して、miRNAを含むすべてのsRNAs、下流のプロファイリングおよび定量化のための高純度のHDLを得るために、密度勾配超遠心分離（DGUC）と高速タンパク質液体クロマトグラフィー（FPLC）でタンデムHDL分離を利用した新しいプロトコルシーケンシングおよびリアルタイムPCRアプローチ-throughput。このプロトコルは、HDL上のsRNAsの調査のための貴重な情報源となります。

概要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

細胞外の非コード小型RNA（sRNAs）疾患のバイオマーカーおよび潜在的な治療標的の新しいクラスを表し、おそらく細胞間コミュニケーション1を容易にします 。 sRNAの最も広く研究されているタイプは、長さが約22 NTSであり、長い前駆体型および一次転写産物2から処理されるマイクロRNA（miRNAを）です。 miRNAは、転写後ためにタンパク質翻訳及びmRNA分解2の誘導の抑制を介して遺伝子発現を調節することが実証されています。それにもかかわらず、miRNAはsRNAsの多くの種類のひとつです。 sRNAsは、親のtRNA（tRNAの由来sRNAs、TDR）、小核のRNA（のsRNA由来sRNAs、sndRNA）、小核小体のRNA（のsnoRNA由来sRNAs、snRNAの）、リボソームRNA（rRNAの由来sRNAs、RDRから切断することができるように）、YのRNA（YDR）、およびその他のRNA 1。これらの新規sRNAsのいくつかの例は、miRNAと同様に機能することが報告されています。しかし、生物学的府遺伝子調節における役割は3-6可能性があるが、これらのsRNAsの多くのnctionsは、まだ決定されていません。最も興味深いことに、miRNAおよび他のsRNAsは、唾液、血漿、尿、及び胆汁を含む細胞外液、中に安定に存在しています。外sRNAsは、おそらく、細胞外小胞（EV）、リポタンパク質、および/または細胞外リボ核タンパク質複合体との会合を通じてのRNaseから保護されています。

以前、我々は、リポタンパク質、即ち、高密度リポタンパク質（HDL）、血漿7における搬送miRNAを報告しました。この研究では、HDLは、連続密度勾配超遠心法（DGUC）、高速タンパク質液体クロマトグラフィー（サイズ排除クロマトグラフィー、ゲル濾過、FPLC）、およびアフィニティークロマトグラフィー（抗アポリポタンパク質AI（アポA-I）免疫沈降を用いて単離しました）7。リアルタイムPCRベースの低密度アレイと個々のmiRNAアッセイの両方を使用して、miRNAレベルは、HDLで定量治癒から単離されましたなたと高コレステロール血症の被験者7。このアプローチを用いて、miRNAをプロファイルし、高純度のHDL製剤における特定のmiRNAを定量することができました。 2011年以来、私たちは、アフィニティークロマトグラフィーは、HDLの純度を高めているが、抗体の飽和が大幅に収量を制限し、コスト高であることができると判断しました。現在、我々のプロトコルは、ダウンストリームRNA単離とのsRNAの定量化のために高品質のHDLサンプルを生成FPLC、続いDGUCの二段階の順次タンデム方式をお勧めします。近年の例えば sRNAsのハイスループットシークエンシング（sRNAseq）、の進歩、miRNAは、および他の非のmiRNAのsRNAクラスの意識向上に、sRNAseqは、現在の最先端のmiRNAおよびのsRNAプロファイリングです。このように、我々のプロトコルは、定量化miRNAおよびsRNAseqを使用して、HDLサンプル上の他のsRNAsをお勧めします。それにもかかわらず、HDLから単離した全RNAは、個々のmiRNAと他のsRNAsを定量またはリアルタイムPCR aを用いsRNAseq結果を検証するために使用することができますpproaches。ここでは、具体的に収集、精製、定量化、データ分析、および高純度のHDL-sRNAsの検証のためのプロトコルについて説明します。

この論文の全体的な目標は、ヒト血漿から分離された高純度のHDLでのsRNA定量化の実現可能性とプロセスを実証することです。

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プロトコル

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. HDL精製（〜5.5日）

  1. 密度勾配超遠心分離（DGUC、〜5日）
    1. 新鮮な静脈血から分離された血漿の9 mLに100倍の抗酸化剤の90μLを追加します。
    2. ステップ1.1.1（0.0278グラム/ mLの臭化カリウム血漿）からの血漿の9 mLに0.251グラムのKBrを追加することによって、1.025グラム/ mLに1.006グラム/ mLのKBrを持つプラズマ密度を調整します。すべての塩は室温で溶解し、チューブを超遠心し、すべての気泡がトップに上昇を確認するために転送されるまで、プラズマをロック。
    3. ベンド先端から90℃で1センチメートル18-G針の先端は、ベベル側が上を向きます。シリンジと18ゲージの針を使用して、慎重にプラズマ（ 表1）の上にオーバーレイ溶液＃1の3ミリリットルを配置します。
      注：曲がった針は、すべてのVLDL / IDL、LDLを確保し、HDLがオーバーレイと混合せずに削除されます。
    4. チューブの上部とcarefuにメニスカスから3ミリメートルのスペース - 2を残して、上部の気泡の大部分を削除しますLLY SW-40Tiバケットにチューブを配置します。
    5. バランスに（キャップ​​付き）各バケットを計量し、正反対のバケット（バケット+キャップ）とのバランス：第6位に＃1〜＃4、＃5から＃2、＃3。
      注：これらのバケットは、常にバランスと一致する必要があります。
    6. （材料のリスト）超遠心機ロータを配置します。 ＃4の中間ブレーキと4℃で24時間274400×gで遠心分離します。
    7. 慎重にバケットから、ロータからバケットやチューブを取り外します。
    8. 慎重に注射器と曲がった針を使用してオーバーレイの最上層から2ミリリットルを削除します。これは、4℃で保存することができるVLDL / IDL画分となり °Cまたは-80 °C。
    9. VLDL / IDL画分を除去した後、サンプル（血漿）の残りの7ミリリットルを収集し、15 mLコニカルチューブに入れてください。オーバーレイ溶液＃2（ 表1）で9 mLに試料の体積を起動します。
    10. 使用してのKBrと1.080グラム/ mLに1.025グラム/ mLのサンプル密度を調整します9 mLのサンプルまたは0.0828グラムで約0.746グラムのKBr /サンプルのmLでのKBr。すべてのKBr（約20分）に溶解し、確実に気泡がトップに上昇しながら、チューブを超遠心に転送されるまで、慎重にサンプルを揺すります。
    11. 注射器と針で、慎重にサンプル（ 表1）の上にオーバーレイ溶液＃3の3ミリリットルを配置します。管の上部にメニスカスから3ミリメートルのスペース - 2のままにしておきます。
    12. チューブの上部に残っている気泡の大部分を除去し、慎重にSW-40Tiバケット内に充填された超遠心管を配置します。
    13. バランスに（キャップ​​付き）各バケットを計量し、正確1.1.5のように、反対側のバケット+キャップでバランスをとります。
    14. （材料のリストを参照してください）超遠心機ロータを配置します。 ＃4の中間ブレーキと4℃で24時間274400×gで遠心分離します。
    15. 慎重にバケットから、ロータからバケットやチューブを取り外します。
    16. 慎重に注射器を使用してオーバーレイの最上層から2ミリリットルを削除してあることntの針。これは、4℃で保存することができるLDL画分となり °Cまたは-80 °C。
    17. LDL画分を除去した後、サンプル（血漿）の残りのおおよその7ミリリットルを収集し、新しい15 mLコニカルチューブに入れてください。 1.080グラム/ mLの溶液＃4（ 表1）で9 mlまでの試料（血漿）の音量を持参。
    18. 1.30グラムのサンプルの各mLのための3.33 9 mLのサンプル（血漿）中のグラムとKBrまたは0.37グラムのKBrを使用してのKBrと/ mLに1.080グラム/ mLのサンプル密度を調整します。ロックまたはわずかにすべてのKBr（塩）が溶解するまでサンプルを攪拌し、管を超遠心する転送します。
    19. 注射器と針で、慎重にサンプル（ 表1）の上にオーバーレイ溶液＃5の3ミリリットルを配置します。
    20. 管の上部にメニスカスから2〜3ミリのスペースを残して、管の上部に残っている気泡の大部分を除去し、慎重にSW-40Tiバケット内に充填された超遠心管を配置します。
    21. （各バケットを計量バランス上のキャップ）、そして正確に1.1.5のように、反対側のバケット+キャップでバランスをとります。
    22. （材料のリストを参照してください）超遠心機ロータを配置します。 ＃4ブレーキと4℃で48時間274400×gで遠心分離します。
    23. 慎重にバケットから、ロータからバケットやチューブを取り外します。
    24. 慎重に注射器と曲がった針を使用してオーバーレイの最上層から約2ミリリットルを削除します。これは、4℃または-80℃で保存することができるHDL画分です。
      注：DGUC HDL後は、高塩溶液を除去するために透析することができます。
    25. 密閉された透析スリーブ（10,000 MWカットオフ）に集めHDL画分を配置し、1 L 1×PBS中で一晩透析、透析します。変更透析緩衝液（1×PBS）24時間かけて3回。磁気撹拌棒を含むPBSの穏やかな摂動は、透析が向上します。
    26. BCA法8を使用してDGUC-HDLのタンパク質濃度を決定します。
  2. 高速タンパク質液体CHROグラフィー（FPLC）またはサイズ排除クロマトグラフィー（〜6時間）
    1. 0.22μmのマイクロ遠心フィルターを通して500μLでDGUC-HDL（総タンパク質）の1.2 mgのフィルタ注入する直前に、（材料のリストを参照してください）。
      注：0.22μmのフィルターの前に0.45μmのマイクロ遠心フィルターを通してDGUC-HDLサンプルの追加のフィルタリングは、いくつかのサンプルのために必要な場合があります。
    2. フィルタリングDGUC-HDLサンプルを収集し、FPLC（記入）注射器、およびFPLCに注入する前に、シリンジ内に気泡がないことを確認をロードします。
    3. 2.6 MPaの圧力限界で0.3 ml /分のFPLC流量を設定します。注射をサンプリングする前に、緩衝液の0.2カラム容量（約15mL）でカラムを平衡化します。 FPLC（注入ループ）機器内にバッファの3 mLのサンプルを注入し、実行を開始します。 72画分の合計1.5 mL画分を収集します。

2.高スループット小さなRNAシーケンシング（sRNAseq、〜9日）

  1. RNA単離（〜1日）
    1. 製造業者の説明書に従って比色分析キットを用いて総コレステロールレベルを測定することによりDGUC-HDLに相当するFPLC画分を同定します。 DGUC-HDLを含む7 FPLC画分 - このFPLCセットアップを使用して、6を見つけることを期待しています。
    2. DGUC-HDL FPLC画分からすべてのボリューム（約8 -1 0 mLのプール1.45 mLの画分の容積）を収集し、使用して集中10kDaのMWカットオフ遠心分離フィルターユニット1時間4000×gで4℃、またはHDL濃縮まで約100μLです。
    3. HDL濃縮物を収集し、BCA法8を用いて、HDL、総タンパク質濃度を定量します。
    4. セット内の各サンプルから小分けしすることができ、最大1 mgのHDL総タンパク質の最高濃度を、決定します。例えば、各試料のHDL、総タンパク質の同量のRNAを単離します。
    5. 使用して、RNAの単離を行います改良プロトコール （材料のリストを参照してください）。
      1. 1分間のサンプルと渦（材料のリストを参照してください）フェノール溶解試薬の10倍のボリュームを追加します。
      2. 5分間、室温でインキュベートします。
      3. クロロホルム（ステップ2.1.5.1で使用されるフェノール溶解試薬の体積の20％）を加え、15秒間激しく振ります。
      4. 3分 - 2室温でインキュベートします。
      5. 冷却遠心機で4℃、12,000×gで15分間遠心。
      6. 間期を避け、新たなチューブに上部の水相を転送します。
      7. 1分間水相とボルテックスに100％エタノールの1.5倍体積を加えます。
      8. 少なくとも1時間または一晩-80℃で保存サンプル。
      9. 提供ミニカラムを用いてRNA単離プロトコールを続行します。
      10. 30μLのRNaseフリーのH 2 Oで溶出まず、フリットに直接2分間低速（2,000×gで）でスピンをH 2 Oの15μLを追加し、その後、1分間高速（最大）で回転します。 H 2 Oの追加の15μLと、この手順を繰り返します
    6. 直ちに-80℃でのsRNAライブラリ生成またはストアに進みます。
  2. ライブラリーの生成（〜6時間）
    1. 以下に詳述するように、PCR増幅に1修正を加えて、製造業者の指示に従って、のsRNAライブラリー生成キットのプロトコルを使用してのsRNA cDNAライブラリーを準備します。
      1. 0.5μLのDNase / RNaseフリーのH 2 Oを含む氷上でPCRマスターミックスを準備し、15μLのPCRミックス（PML）と1μLRNA PCRプライマー（RP1）サンプル毎（エラーをピペッティングするための追加の10％を含みます）。
      2. 各（cDNA）をサンプルにPCRミックスの16.5μLを追加します。
      3. 多重化のために各サンプルにインデックス/バーコード番号を割り当て、サンプルに（対応する数）1μLのPCRプライマーのインデックスを追加します。
      4. マイクロフュージを使用してクイックスピンを実行します。
        注：合計ボリュームがすべき今サンプル当たり30μLです。
      5. 表2および3に詳述するようにPCR増幅のためのサイクル条件を行います。
  3. サイズアダプタを削除するためのsRNAライブラリを選択します。アダプタ（〜1.5時間）
    1. ターゲット：156 bpの、スタート：135 bpの、エンド：177 bpの、範囲旗：ブロード以下のサイズのパラメータを持つあたり、製造元の指示として自動DNAサイズセレクタを使用してライブラリのサイズ選択を行います。
  4. DNAクリーンアップ（〜0.5時間）
    1. 製造元の指示に従って、サイズ選択のsRNAのcDNAをクリーンアップします。
    2. クリーン溶出し、2×7μLのDNase / RNaseフリーのH 2 OでのsRNAするcDNAを濃縮します
  5. sRNA cDNAライブラリーの収量と品質（〜1時間）を定量化し、評価します
    1. manufactあたりとしてバイオアナライザー（材料のリスト）上に高感度DNAチップを用いたsRNAのcDNAライブラリーの品質と大きさを評価しますurerの指示。
    2. 製造業者の指示に従って、高感度DNA分析（材料のリスト）を使用して、個々のsRNA cDNAライブラリーの濃度を定量します。
      注：これは、可能な場合は、別のインデックスを持つすべてのサンプルがフローセルの同じレーン上で実行することが推奨されています。複数のレーンが必要な場合、適切ケースおよびコントロールサンプルを混ぜます。
  6. ハイスループットのsRNAシーケンシング（〜7日）
    1. プール個人が等モル濃度に基づいてのsRNAライブラリのインデックスを作成しました。
    2. 画面は、バイオアナライザー上で高感度DNAチップを用いて、品質のsRNAライブラリをプールし、2.5.1のようにライブラリーDNA濃度を決定 - 2.5.2。
    3. 製造業者の説明書（材料のリスト）に従ってシーケンシングライブラリーのqPCR定量キットを使用して適切な配列決定の深さを確保するために、アダプタコンテンツの定量的PCR（定量PCR）を行います。
    4. 単一の読み取りを使用してシークエンシングを行い、50 B25 Mは、製造業者の指示に従って、/サンプルを読み取り - Pプロトコルは、約20の深さに到達します。

3.データ解析（〜1日）

  1. 逆多重化されたサンプルの前処理生FASTQファイル（材料のリスト）に、ユーザーガイドの指示に従って、bcl2fastq2を使用してください。
  2. 使用Cutadaptアダプタ9をトリミングして削除するには、ユーザーガイドの指示（材料のリスト）に従って、長さ<16ヌクレオチド（NTS）を読み出します。
  3. ユーザーガイドの指示（材料のリスト）に従って、NGSPERLの枠組みの中でremoveSequenceInFastq機能を使用して、アダプタのキャリーオーバー（CTACAGTCCGACGATC）：ストップ・ソリューション・シーケンス（CCACGTTCCCGTGG STP）を含む、のsRNAライブラリに存在する汚染配列を除去。
  4. ユーザーガイドの指示（材料のリスト）に従って、FastQCは定量的科学研究センター（CQS）ツールを使用して、品質管理メトリックを実行します。
  5. （読み取り、「同一」崩壊redundaの非冗長リストを生成読み込み）とユーザーガイドの指示（材料のリスト）に従って、CQSToolsを使ってレコードコピー数のnt。
  6. 、ユーザーガイド当たりの命令（材料のリスト）として：整列は1ミスマッチ（-a -m 100 --best --strata -v 1オプション）を可能にするBowtie1.1.2を用いて、ヒトのゲノムに読み込みます。
  7. アライメント、カウントを読んで実行し、ユーザーガイドの指示に従って、NGSPERLを使用して集計作業をもたらします。
  8. スプレッドシートファイルにエクスポートカウントテーブルを変換します。
  9. ノーマライズは、そのクラスの読み込み（ 例えば、miRNAの総数は読み込み）やパーがmiRNA（RPMM）にマッピング読み込みとして信号を報告総数に対する特定のクラス（ 例えば、miRNAの）の読み取り。 （ 例えば 、RPMM =（miRNAののmiR-X /総＃読み取り）* 1,000,000）。
  10. 低レベルと高レベルの差のためにソフトウェアに一般的な単一色の技術としてカウントテーブルを正規化した入力は、ユーザーガイドの指示（材料のリスト）ごとに分析しています。
    注：現在、十分に特徴付けられたハウスキーピング遺伝子がある/ SRNHDL-のsRNAについて。スパイクインコントロールを使用することができるが、問題となり得ます。総タンパク質入力またはボリュームをHDLへ正規化すると、お勧めします。最も重要なことは、リアルタイムPCRまたは定量的PCRを用いたmiRNAとsRNAsを定量化するために様々な戦略の一つにより配列決定の結果を検証することをお勧めします。

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結果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

このプロトコルは、ハイスループットシークエンシングまたはリアルタイムPCR（ 図1）により、高純度HDL上のsRNAsの定量化を可能にするために一緒にリンクされている確立された方法のシリーズです。このプロトコルの実現可能性と影響を実証するために、HDLは、タンデムDGUCおよびFPLCの方法によって、ヒト血漿から精製しました。 HDL（コレステロール分布による）に対応する収集FPLC画分を濃縮し、全RNAをHDL 1mgの（全タンパク質）から単離しました。 sRNAライブラリは、n = 4健康なヒト被験者から収集されたHDLで生成されました。全てのヒト血液/血漿サンプルは、アクティブな治験審査委員会プロトコル（＃070416）の下で収集した、医学のバンダービルト大学によって承認されたヒト被験者はインフォームドコンセントに登録しました。準備のsRNAライブラリは、高度なゲノム（VANTAGE）DNA配列決定センターとデータ分析を行ったためヴァンダービルト・テクノロジーズで配列決定しました社内のパイプラインを使用して。データの視覚化は、ソフト...

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ディスカッション

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

このプロトコルは、非常に純粋なHDLのハイスループットシークエンシングまたはリアルタイムPCRによりmiRNAおよび他のsRNAsを定量化するために設計されています。いずれのアプローチと同様に、特別な配慮を浄化HDLおよびRNAのプロセスの各ステップに与えられ、その後sRNAsを定量化する必要があります。このプロトコルは、プラズマの≥2 mLで始まるプロジェクトのために設計されています。それにもかかわらず、高品質のRNAの分析は、正常アフィニティークロマトグラフィーを使用して、ヒトまたはマウス血漿のわずか80μLから精製したHDLで完了することができます。しかし、より大きな出発プラズマボリュームがここに提示される方法を使用して、より良いデータを生成します。サンプル処理及び抽出方法が劇的なmiRNA /のsRNAの品質と歩留まりを変更することができます。抗凝固剤の使用は、血漿採取のために不可欠ながら、おそらく下流の抽出に影響を与えます。例えば、ヘパリンは、容易にRNA抽出14,15の間に除去されず、PCR 16-18において利用下流の酵素を阻害することができます。また、第EREは、クエン酸ナトリ...

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開示事項

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

著者らは開示するものは何もない。

謝辞

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

この作業は、国立衛生研究所、国立心肺血液研究所からK.C.V. HL128996、HL113039、およびHL116263に対する賞によって支援されました。この研究は、アメリカ心臓協会からK.C.V. CSA2066001、D.L.M POST26630003、およびRMA POST25710170への賞によっても支援されました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
超遠心分離機 ベックマン・コールターA99839オプティマ XPN-80
超遠心分離機ローターベックマン・コールター331362SW-41Ti
AKTA ピュア FPLC システムGE ヘルスケア29018224
3x FPLC スーパーデックス 200 増加カラム インラインGE ヘルスケア2899094410/300 gl
シナジーマックスバイオテック インスツルメンツ7191000
卓上遠心分離機Thermo Scientific75004525Sorvall ST40R
冷蔵遠心分離機Eppendorf226298675417R (USA Scientificから購入)
Microfuge USA Scientific2631-0006
PippenPrepSage SciencePIP0001
2100 バイオアナライザー AgilentG2938B
高感度DNAアッセイAgilent5067-4626
シーケンシングライブラリ qPCR 定量キットIlluminaSY-930-1010
ProFlex サーマルサイクラーApplied Biosystems4484073
QuantStudio 12k FlexApplied Biosystems4471134
EpMotion RobotEppendorf9600001115070
超透明遠心チューブベックマン・コールター344059
臭化カリウムフィッシャーケミカルズP205-500
15 mL コニカルチューブThermo Scientific339650
マイクロ遠心フィルター 0.45 & マイクロ;mミリポアUFC30HV00
マイクロ遠心フィルター 0.22 & マイクロ;mMilliporeUFC30GV00
miRNAEasy Total RNA Isolation KitsQiagen217004
Total Cholesterol colormetric kitCliniqa (Raichem)R80035
10,000 m.w. カットオフ遠心分離フィルターAmiconUFC801024Millipore
PCR strip tubesAxygenPCR-0208-CFisher を通じて購入
microRNA RTキットライフテクノロジー43665971000反応用
PCRマスターミックスライフテクノロジーズ 444004150mLボトル
ピアスBCAキットサーモサイエンティフィック23225
クリーン&コンセントレーターキットザイモD4014
透析チューブスペクトラムラボ132118フィッシャーから購入
bcl2fastq2Illuminan/aソフトウェア
Cutadapthttps://github.com/marcelm/cutadaptn/aソフトウェア
NGSPERLgithub.com/shengqh/ngsperln/aソフトウェア
CQSToolsgithub.com/shengqh/CQS.Toolsn/aソフトウェア
Bowtie 1.1.2 http://bowtie-bio.sourceforge.netn/aソフトウェア
GeneSpringGX13.1.1Agilentn/aソフトウェア
ズ

参考文献

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