このプロトコルは、高密度リポタンパク質の小さなRNAの単離と定量化を説明しています。
方法論記事
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このプロトコルは、高密度リポタンパク質の小さなRNAの単離と定量化を説明しています。
小さな非コードRNA(のsRNA)の多様性は急速に拡大し、生物学的プロセスにおける役割、遺伝子調節を含む、浮上しているされています。最も興味深いことに、sRNAsはまた、細胞の外で発見されており、安定的にすべての生物学的流体中に存在しています。このように、細胞外sRNAsは、疾患バイオマーカーの新規なクラスを表し、おそらく、細胞シグナル伝達および細胞間通信ネットワークに関与しています。バイオマーカーとしての可能性を評価するために、sRNAsは血漿、尿、および他の体液中で定量することができます。それにもかかわらず、完全に内分泌信号のような細胞外sRNAsの影響を理解するために、キャリアが輸送と細胞や組織は、細胞外のsRNAプールに貢献する生物学的流体( 例えば、血漿)、でそれらを保護し、細胞や組織ができるされているかを決定することが重要です外のsRNAを受け入れ、利用します。これらの目標を達成するために、細胞外のキャリアの非常に純粋な集団を単離することが重要ですsRNAプロファイリングおよび定量化のため。我々は以前に、リポタンパク質、特に、高密度リポタンパク質(HDL)、細胞およびHDL-miRNAの間の機能的マイクロRNA(miRNAの)の輸送を大幅疾患において変化していることを実証しました。ここでは、詳細高の両方を使用して、miRNAを含むすべてのsRNAs、下流のプロファイリングおよび定量化のための高純度のHDLを得るために、密度勾配超遠心分離(DGUC)と高速タンパク質液体クロマトグラフィー(FPLC)でタンデムHDL分離を利用した新しいプロトコルシーケンシングおよびリアルタイムPCRアプローチ-throughput。このプロトコルは、HDL上のsRNAsの調査のための貴重な情報源となります。
細胞外の非コード小型RNA(sRNAs)疾患のバイオマーカーおよび潜在的な治療標的の新しいクラスを表し、おそらく細胞間コミュニケーション1を容易にします 。 sRNAの最も広く研究されているタイプは、長さが約22 NTSであり、長い前駆体型および一次転写産物2から処理されるマイクロRNA(miRNAを)です。 miRNAは、転写後ためにタンパク質翻訳及びmRNA分解2の誘導の抑制を介して遺伝子発現を調節することが実証されています。それにもかかわらず、miRNAはsRNAsの多くの種類のひとつです。 sRNAsは、親のtRNA(tRNAの由来sRNAs、TDR)、小核のRNA(のsRNA由来sRNAs、sndRNA)、小核小体のRNA(のsnoRNA由来sRNAs、snRNAの)、リボソームRNA(rRNAの由来sRNAs、RDRから切断することができるように)、YのRNA(YDR)、およびその他のRNA 1。これらの新規sRNAsのいくつかの例は、miRNAと同様に機能することが報告されています。しかし、生物学的府遺伝子調節における役割は3-6可能性があるが、これらのsRNAsの多くのnctionsは、まだ決定されていません。最も興味深いことに、miRNAおよび他のsRNAsは、唾液、血漿、尿、及び胆汁を含む細胞外液、中に安定に存在しています。外sRNAsは、おそらく、細胞外小胞(EV)、リポタンパク質、および/または細胞外リボ核タンパク質複合体との会合を通じてのRNaseから保護されています。
以前、我々は、リポタンパク質、即ち、高密度リポタンパク質(HDL)、血漿7における搬送miRNAを報告しました。この研究では、HDLは、連続密度勾配超遠心法(DGUC)、高速タンパク質液体クロマトグラフィー(サイズ排除クロマトグラフィー、ゲル濾過、FPLC)、およびアフィニティークロマトグラフィー(抗アポリポタンパク質AI(アポA-I)免疫沈降を用いて単離しました)7。リアルタイムPCRベースの低密度アレイと個々のmiRNAアッセイの両方を使用して、miRNAレベルは、HDLで定量治癒から単離されましたなたと高コレステロール血症の被験者7。このアプローチを用いて、miRNAをプロファイルし、高純度のHDL製剤における特定のmiRNAを定量することができました。 2011年以来、私たちは、アフィニティークロマトグラフィーは、HDLの純度を高めているが、抗体の飽和が大幅に収量を制限し、コスト高であることができると判断しました。現在、我々のプロトコルは、ダウンストリームRNA単離とのsRNAの定量化のために高品質のHDLサンプルを生成FPLC、続いDGUCの二段階の順次タンデム方式をお勧めします。近年の例えば sRNAsのハイスループットシークエンシング(sRNAseq)、の進歩、miRNAは、および他の非のmiRNAのsRNAクラスの意識向上に、sRNAseqは、現在の最先端のmiRNAおよびのsRNAプロファイリングです。このように、我々のプロトコルは、定量化miRNAおよびsRNAseqを使用して、HDLサンプル上の他のsRNAsをお勧めします。それにもかかわらず、HDLから単離した全RNAは、個々のmiRNAと他のsRNAsを定量またはリアルタイムPCR aを用いsRNAseq結果を検証するために使用することができますpproaches。ここでは、具体的に収集、精製、定量化、データ分析、および高純度のHDL-sRNAsの検証のためのプロトコルについて説明します。
この論文の全体的な目標は、ヒト血漿から分離された高純度のHDLでのsRNA定量化の実現可能性とプロセスを実証することです。
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1. HDL精製(〜5.5日)
2.高スループット小さなRNAシーケンシング(sRNAseq、〜9日)
3.データ解析(〜1日)
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このプロトコルは、ハイスループットシークエンシングまたはリアルタイムPCR( 図1)により、高純度HDL上のsRNAsの定量化を可能にするために一緒にリンクされている確立された方法のシリーズです。このプロトコルの実現可能性と影響を実証するために、HDLは、タンデムDGUCおよびFPLCの方法によって、ヒト血漿から精製しました。 HDL(コレステロール分布による)に対応する収集FPLC画分を濃縮し、全RNAをHDL 1mgの(全タンパク質)から単離しました。 sRNAライブラリは、n = 4健康なヒト被験者から収集されたHDLで生成されました。全てのヒト血液/血漿サンプルは、アクティブな治験審査委員会プロトコル(#070416)の下で収集した、医学のバンダービルト大学によって承認されたヒト被験者はインフォームドコンセントに登録しました。準備のsRNAライブラリは、高度なゲノム(VANTAGE)DNA配列決定センターとデータ分析を行ったためヴァンダービルト・テクノロジーズで配列決定しました社内のパイプラインを使用して。データの視覚化は、ソフト...
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このプロトコルは、非常に純粋なHDLのハイスループットシークエンシングまたはリアルタイムPCRによりmiRNAおよび他のsRNAsを定量化するために設計されています。いずれのアプローチと同様に、特別な配慮を浄化HDLおよびRNAのプロセスの各ステップに与えられ、その後sRNAsを定量化する必要があります。このプロトコルは、プラズマの≥2 mLで始まるプロジェクトのために設計されています。それにもかかわらず、高品質のRNAの分析は、正常アフィニティークロマトグラフィーを使用して、ヒトまたはマウス血漿のわずか80μLから精製したHDLで完了することができます。しかし、より大きな出発プラズマボリュームがここに提示される方法を使用して、より良いデータを生成します。サンプル処理及び抽出方法が劇的なmiRNA /のsRNAの品質と歩留まりを変更することができます。抗凝固剤の使用は、血漿採取のために不可欠ながら、おそらく下流の抽出に影響を与えます。例えば、ヘパリンは、容易にRNA抽出14,15の間に除去されず、PCR 16-18において利用下流の酵素を阻害することができます。また、第EREは、クエン酸ナトリ...
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著者らは開示するものは何もない。
この作業は、国立衛生研究所、国立心肺血液研究所からK.C.V. HL128996、HL113039、およびHL116263に対する賞によって支援されました。この研究は、アメリカ心臓協会からK.C.V. CSA2066001、D.L.M POST26630003、およびRMA POST25710170への賞によっても支援されました。
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| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 超遠心分離機 | ベックマン・コールター | A99839 | オプティマ XPN-80 |
| 超遠心分離機ローター | ベックマン・コールター | 331362 | SW-41Ti |
| AKTA ピュア FPLC システム | GE ヘルスケア | 29018224 | |
| 3x FPLC スーパーデックス 200 増加カラム インライン | GE ヘルスケア | 28990944 | 10/300 gl |
| シナジーマックス | バイオテック インスツルメンツ | 7191000 | |
| 卓上遠心分離機 | Thermo Scientific | 75004525 | Sorvall ST40R |
| 冷蔵遠心分離機 | Eppendorf | 22629867 | 5417R (USA Scientificから購入) |
| Microfuge | USA Scientific | 2631-0006 | |
| PippenPrep | Sage Science | PIP0001 | |
| 2100 バイオアナライザー | Agilent | G2938B | |
| 高感度DNAアッセイ | Agilent | 5067-4626 | |
| シーケンシングライブラリ qPCR 定量キット | Illumina | SY-930-1010 | |
| ProFlex サーマルサイクラー | Applied Biosystems | 4484073 | |
| QuantStudio 12k Flex | Applied Biosystems | 4471134 | |
| EpMotion Robot | Eppendorf | 960000111 | 5070 |
| 超透明遠心チューブ | ベックマン・コールター | 344059 | |
| 臭化カリウム | フィッシャーケミカルズ | P205-500 | |
| 15 mL コニカルチューブ | Thermo Scientific | 339650 | |
| マイクロ遠心フィルター 0.45 & マイクロ;m | ミリポア | UFC30HV00 | |
| マイクロ遠心フィルター 0.22 & マイクロ;m | Millipore | UFC30GV00 | |
| miRNAEasy Total RNA Isolation Kits | Qiagen | 217004 | |
| Total Cholesterol colormetric kit | Cliniqa (Raichem) | R80035 | |
| 10,000 m.w. カットオフ遠心分離フィルター | Amicon | UFC801024 | Millipore |
| PCR strip tubes | Axygen | PCR-0208-C | Fisher を通じて購入 |
| microRNA RTキット | ライフテクノロジー | 4366597 | 1000反応用 |
| PCRマスターミックス | ライフテクノロジー | ズ 4440041 | 50mLボトル |
| ピアスBCAキット | サーモサイエンティフィック | 23225 | |
| クリーン&コンセントレーターキット | ザイモ | D4014 | |
| 透析チューブ | スペクトラムラボ | 132118 | フィッシャーから購入 |
| bcl2fastq2 | Illumina | n/a | ソフトウェア |
| Cutadapt | https://github.com/marcelm/cutadapt | n/a | ソフトウェア |
| NGSPERL | github.com/shengqh/ngsperl | n/a | ソフトウェア |
| CQSTools | github.com/shengqh/CQS.Tools | n/a | ソフトウェア |
| Bowtie 1.1.2 | http://bowtie-bio.sourceforge.net | n/a | ソフトウェア |
| GeneSpringGX13.1.1 | Agilent | n/a | ソフトウェア |
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