方法論記事

生体試料の代謝プロファイリングのためのSheathlessキャピラリー電気泳動 - 質量分析法

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DOI:

10.3791/54535

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2016年10月1日

 ,  ,  , 
1Division of Analytical Biosciences, Leiden Academic Center for Drug Research, Leiden University

この記事について

サマリー

sheathless多孔チップインタフェース設計を使用してキャピラリー電気泳動 - 質量分析法による生体試料の代謝プロファイリングのためのプロトコルが提供されます。

要約

メタボロミクスは、分析技術の広い範囲は、複雑なサンプル中の（内因性）代謝物のグローバルなプロファイリングのために使用されます。この論文では、プロトコルは、キャピラリー電気泳動 - 質量分析（CE-MS）により、生体試料中のアニオン性およびカチオン性代謝物の分析のために提示されています。化合物は、それらの電荷対サイズ比に基づいて分離されるCEは、高極性および荷電代謝物の分析に適しています。最近開発sheathlessインターフェース設計、 すなわち、多孔質先端インターフェイスは、イオン化（ESI）MSをエレクトロするCEを結合するために使用されます。このインターフェースアプローチは、極性代謝物クラスの広い範囲のためのナノモル検出限界で、その結果、MSと組み合わせたCEの本質低流動性を有効に利用することができます。ここに提示プロトコルは、分析のために低pH分離条件で多孔質先端エミッタと裸の溶融シリカキャピラリーを使用するに基づいています生体試料中の代謝物クラスの幅広いです。同じsheathlessのCE-MS法のみMS検出を切り替えることにより、糖リン酸、ヌクレオチドおよび有機酸を含むアミノ酸、ヌクレオシド、および小ペプチド、またはアニオン性代謝物を含むカチオン性代謝産物のプロファイリングのために使用することができることが実証され分離電圧極性。尿、脳脊髄液、および神経膠芽腫細胞株の抽出物などの様々な生物学的試料中の非常に情報豊富な代謝プロファイルは、CE-MS分析の1時間未満で、このプロトコルによって得ることができます。

概要

現代のメタボロミクスにおいて、ハイエンド分析分離技術は、生体1の生理学的状態の代表的な読出しを得るために代謝産物クラスの広い範囲を分析するために使用されます。メタボロミクス研究の究極の目的は、所定の生物学的/臨床の質問への答えを得ることです。現時点では、ヒューマン・メタボローム・データベースは、内因性および外因性の両方の化合物を表す40,000以上の代謝産物のエントリ（栄養素、微生物、薬物および他のソースから後者の発信）2から構成されています。物理化学的性質とこれらの代謝産物の濃度範囲で大きな多様性を考えると、異なる分離メカニズムを有する複数の分析技術は、所与の生物学的試料中のできるだけ多くの代謝産物をプロファイルするために一緒に使用されるべきです。例えば、Psychogios らは、代謝の教授のための5つの分析分離技術の組み合わせを使用しました4,000人以上の化学的に多様な代謝物3の検出結果としてヒト血清のiling。

本論文では、注意が生物学的試料4,5の代謝プロファイリングのために最近開発されたCE-MSの戦略に支払われます。 CEは、より具体的には、キャピラリーゾーン電気泳動（CZE、通常CEと称する）は、化合物は、従って、この分析法は、極性および荷電した代謝物の分析のために非常に適している、それらの電荷対サイズ比に基づいて分離されています。 CEの分離機構により生物学的試料6-8の代謝組成物に相補的なビューを提供し、クロマトグラフィーに基づく技術とは根本的に異なっています。曽我および共同研究者は、生物学的サンプル9,10中の代謝物の世界的プロファイリングのためのCE-MSの有用性を示すために最初でした。今までは、メタボロミクスのためのCE-MSの実現可能性と有用性が広く11-15を実証されています。CEは、一般的にシース液のインタフェース技術16,17を介してMSに結合されています。しかしながら、シース液による毛細管流出物の希釈のために、検出感度を本質的に損なわれています。

最近、それは古典的なシース液界面5,18,19を用いた CE-MSに比べてsheathlessインタフェースの使用が大幅に様々な生物学的サンプル中に存在する代謝物の検出範囲を改善することが示されました。約300の分子機能はシース液CE-MS 5で観察したのに対し、例えば、900年頃分子の機能はsheathless CE-MSによるヒト尿中に検出されました。使用sheathlessインタフェースは、ナノESI-MSと組み合わせたCEの本質低流動性の効果的な使用を可能にする、Moini 20によって発明された多孔質先端エミッタ、に基づいていました。

メタボロミクスの分野でsheathless CE-MSの使用を促進するために、プロトコルは、神経膠芽腫細胞株からの抽出物の分析のために例示されるように、このアプローチは、生物学的サンプル中の高極性代謝物の分析のために使用することができる方法を説明提示されます。陽イオン性代謝物プロファイリングのためsheathless CE-MS法は、また、それによって、分析時間を短縮し、グローバルプロファイリングに単一の分析プラットフォームを提供し、正確に同一の毛細管及び分離条件を使用して、アニオン性代謝物プロファイリングのために使用することができることが示されています帯電した代謝物。プロトコルは、MS機器とsheathless多孔質先端エミッタの効果的な位置合わせのための戦略を説明します。

プロトコル

注：メタボリック・プロファイリング研究のためのsheathless CE-MSを使用するためにここで説明するプロトコルは、実験室での使用のみのためです。以下に概説する手順は、最近公表された研究4,5に基づいています。さらなる実験の詳細は、これらの論文に記載されています。このプロトコルを使用する前に、関連するすべての物質安全データシート（MSDS）を参照してください。このプロトコルで概説した実験を行う場合、安全メガネ、白衣と手袋を含め、すべての適切な実験室の安全手順を使用してください。

試薬溶液および試料の調製

  1. バックグラウンド電解質の調製（BGE）
    1. 毎日新しいBGE溶液（10％（v / v）の酢酸、pHが2.2）を準備。
    2. 10mlのガラスバイアル中への水の9.0ミリリットルを追加し、ドラフト内で水に酢酸1.0ミリリットルを追加します。ボルテックスを用いて溶液を十分に混合します。
  2. 代謝物のstandarの調製Dの混合物
    1. 50μlの水に60陽イオン性代謝物を含む50μMのカチオン標準混合物の50μLを溶解し、溶液を十分に混合します。 -80°Cで保存したときに使用されていません。
    2. 50μlの水に30アニオン性代謝産物を含む50μMアニオン標準混合物の50μLを溶解し、溶液を十分に混合します。使用しないときは-80℃で、同じ標準混合物の凍結/融解サイクルを防止するために、一定分量で、このソリューションを保管してください。
      注：-80℃で適切に保存した場合の代謝産物標準の混合物は、3ヶ月間安定です。
  3. 神経膠芽腫細胞株からの抽出物の調製
    1. 1 mlの氷冷0.9％塩化ナトリウム溶液21を付着ヒトU-87 MG神経膠芽腫細胞を3回洗浄します。
    2. 接着細胞を（V / V 8/2）2 mlの氷冷メタノール/水の溶液を加え、ゴム先端セルスクレーパー21を用いてこすり。
    3. 2分間のメタノール/水チューブ内の溶液とultrasonicateを収集します。
    4. 16,100×gで、4℃で10分間、メタノール/水画分（最終比8/8/2、v / v / v）で遠心分離機にサンプルをクロロホルムを加えます。
    5. メタノール/水層を回収し、真空濃縮器を使用して、この画分を蒸発させます。 sheathless CE-MSによる分析のために50μlの水に乾燥した材料を再構成します。使用時に-80℃でサンプルを保管しません。

2. Sheathless CE-MSシステムの設定

  1. 多孔質の先端エミッタとの裸の溶融シリカカートリッジの取り付け
    1. CE機器に（90センチメートル総縦x内径30μm）の多孔質先端エミッタと新しい裸の溶融シリカカートリッジを置きます。
    2. ソフトウェアは100％メタノールを使用してCE機器を制御して15分間50psiで前方にリンスを適用し、視覚的に液体がcapilから流出しているかどうかを確認このすすぎ工程の間ラリアウトレット。また、視覚的に液体が導電性毛細管から流出されているかどうかを調べるにBGE液を用いて5分間50psiで反対方向にリンスを行います。
    3. いかなる液滴形成はキャピラリー出口で観察されなかった場合には100psiの圧力で繰り返しステップ2.1.2。何の液滴の形成は、このステップの間に観察されなかった場合は、新しい裸の溶融シリカカートリッジを取り付けます。
    4. 10分間、50psiで10分間、50psiで、次いで水、10分間50psiで0.1 MのNaOH、続いて10分間、50 psiで、で水と分離キャピラリーを洗浄し、最後にBGE有します。
      注：2.1.4まで2.1.1が唯一の新しいキャピラリーカートリッジのインストールに必要な手順。
  2. ESI-MSへの毛細血管多孔質先端エミッタのカップリング
    注：MSへのCEキャピラリーを結合する前に、MS機器を校正およびCEシステムに接続されていることを確認してください。へのESI電圧を設定します。0ナノスプレー源を持つMS機器を取り付けます。ガス1、ガス2およびインターフェースヒーター温度はわずか5 psiで1500 V.セットカーテンに設定し、イオンスプレー電圧を印加することによって発生する非常に低い流速でESIとして適用されませんでした。
    1. 水管から溶融シリカカートリッジの噴霧器の先端を取り外し、MS機器に結合するためのナノスプレーソースアダプタに取り付けます。 CE機器におけるBGEバイアルの高さは、噴霧器先端部の高さと一致していることを確認してください。
    2. 5分間50psiでBGEですすぐことにより、導電性毛細血管を通る液体の流れを確認してください。このすすぎ工程の間、ESIスプレー針のベースのドロップ形成が観察されるはずです。
    3. 順方向に10分間50psiでBGEと分離キャピラリーをフラッシュします。ドロップの形成は、このステップの間に多孔質先端エミッタ（噴霧器の先端部）の先端に観察されるはずです。
    4. 位置Cの距離でMS入口の入口に多孔質先端エミッタIRCA 2ミリメートル3。
    5. 1分のランプ時間を使用して、30キロボルトの電圧を印加し、第0のESI電圧を使用して、メタボリック・プロファイリング研究のために65〜1000 のm / zへのm / z範囲内のMSデータの取得を開始。
      メモ：エレクトロスプレーがあってはならないとして、質量スペクトルは、信号の無効にする必要があります。
    6. データの測定に運ぶながら千VにESI電圧を設定します。一定の背景信号まで、200 Vの増分でESI電圧を増加させるには、少なくとも15分間観察されます。
    7. 最大かつ最も安定なMS信号（総イオン電気泳動）を提供する位置を参照するために、X、Y、またはZ軸方向に移動させることにより、MSの注入口の中心に対して多孔質先端エミッタ位置を最適化します。
    8. 多孔質先端エミッタの位置を最適化し、最適なESI電圧を決定した後、0VにESI電圧を設定し、5分のランプ時間を用いて、1キロボルト30キロボルトからCEの電圧を低下させます。
    9. MS法のusinを作成します。グラム最適なESI電圧および代謝物の基準および生物学的サンプルの分析のためのCE機器にCE法。

代謝物標準と生物学的サンプルの3解析

  1. sheathless CE-MSシステムの性能評価
    1. CEバイアルに適合し、入口サンプルトレイにこのバイアルを入れて空を100μlマイクロバイアル（PCRバイアル）に転送アニオン性代謝物の標準的な混合物を20μl。
      注：信頼性の注入のためのマイクロバイアルに必要な最小量は2μlです。
      1. ステップ2.2.9中に作成されたMSの買収負イオンモード法を開始し、その後、CE機器を制御するソフトウェアを使用して、CEシーケンスを開始します。
      2. 10 1.0 psiでBGE注入によって、その後60秒間2.0 psiで注射を3分間50psiでBGEと分離キャピラリーをすすぐ（NL 20は、毛細管容積の3％に相当する）と、秒。
        注：その後、MSデータ取得がトリガされます。
      3. 入口で30分間、0.5 psiの圧力で1.0分のランプ時間との-30 kVの電圧を適用します。 30分電気泳動分離後、MSデータ収集を停止し（電気泳動分離は、多孔質先端キャピラリエミッタの耐久性を向上させた後にCE電圧の漸減）5分のランプ時間を使用すること-1キロボルトCE電圧を低下させます。
    2. 試料注射の間、3分間、30psiで水によるキャピラリー、0.1 M水酸化ナトリウム、水およびBGE各リンス。
    3. 移動時間と分析アニオン性代謝産物混合物の信号強度を決定することによって記録されたデータを分析します。
    4. 陰イオン性代謝物質の基準は10と28分の間の領域に表示されるかどうかを評価します。
    5. 3構造的に関連の異性体、 すなわち 、D-グルコース-1-リン酸、D-グルコース-6-リン酸とD-フルクトース-6-リン酸があるかどうかを確認してください部分的に分離、 すなわち 、最初の2つのピークの間の分解能は0.75年頃、最後の2つのピークのである（ 図1を参照）0.50年頃です。
      注：1.5の解像度は、2つの隣接するピークのベースライン分離を示しています。
    6. 繰り返しは、カチオン性代謝物の混合物のために3.1.1と3.1.2を繰り返します。 MS検出は、陽イオンモードになりましたし、CE電圧は30 kVであることを確認してください。
    7. 移動時間と分析カチオン性代謝産物混合物の信号強度を決定することによって記録されたデータを分析します。
    8. カチオン性代謝物の規格は8と22分の間の領域に表示されるかどうかを評価します。イソロイシンとロイシンが15〜15.5分を移行するかどうかを確認し、解像度は0.5年頃であるかどうかを判断。
  2. 生物学的サンプルの分析
    1. 繰り返しは、神経膠芽腫細胞株の抽出物の陰イオン性代謝プロファイリングのために3.1.1と3.1.2を繰り返します。
      注：代謝コン試料の前処理後に得られた10トン、20細胞/ NL年頃の細胞密度に対応し、したがって、20 nlの注入は、分析あたり400セルの等価です。 。
    2. 5 MDA質量精度を使用して、代謝産物の乳酸（ のm / z 89.0243）のための抽出イオン電気泳動を作成し、信号強度が100,000カウントを超えているかどうかを確認してください。
    3. 繰り返しは、神経膠芽腫細胞株の抽出物のカチオン性代謝プロファイリングのために3.1.1と3.1.2を繰り返します。
      注：高度情報豊富な全イオン電気泳動図は、このモードでは、20 nlの注入のために観察されるはずです。
    4. 分析または使用しないときにした後、15分間50psiで水でキャピラリーを洗浄し、また、水を含むチューブに水と多孔質部（出口部分）を含むバイアル中のキャピラリーの入口部分を格納します。

結果

提案sheathless CE-MS法は、非常に効率的な提供することが可能である、すなわち、60,000〜400,000の範囲のプレート番号、BGEとして10％酢酸液（pH 2.2）を用いナノモル検出限界におけるアニオン性およびカチオン性の代謝産物のプロファイル。高度に極性のアニオン性代謝物の分析のための方法の分離性能は、3つの構造的に関連する糖リン酸異性体（ 図1）が示されています。ベースライン分離がこれら三つの分析物のために得られなかったが、部分的な分離は、これらの検体は、同じ正確な質量を有するようにMSによってそれらの選択的検出を可能にするのに十分です。細胞の限られた数、 すなわちの代謝プロファイリングsheathlessのCE-MS法の電位、20 NL噴射が400セルに対応するが、（セル密度が20セル/ NL年頃である）、抽出物中のカチオン性代謝物の分析のために実証されています神経膠芽腫細胞株（の300以上の分子機能は、S / N比≥5の上に検出された図2）。

figure-results-1
sheathless CE-MSによる糖リン酸異性体の図1.分析。負イオンモードでsheathlessのCE-MSで得られた3糖リン酸異性体（25μM）のための抽出イオン電気泳動。実験条件：BGE、10％酢酸（pHは2.2）。分離電圧、-30 kVの（0.5のPSIは、CEキャピラリーの入口で適用されます）。試料注入、60秒間2.0 psiで。許可4で再現しました。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

figure-results-2
イソロイシンおよびリットルの図2.分析陽イオンモードでsheathless CE-MSで得られた2個のアミノ酸の異性体（25μM）のsheathless CE-MS。抽出イオン電気泳動によりeucine。実験条件：BGE、10％酢酸（pHは2.2）。分離電圧+30 kVで、試料注入、60秒間2.0のpsi。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

figure-results-3
細胞株抽出物中のカチオン性代謝物をプロファイリングするためのsheathless CE-MSの 図3. 潜在的な。代謝プロファイル（トータルイオンエレクトロフェロ）陽イオンモードでsheathless CE-MSと神経膠芽腫細胞株の抽出物で観察されました。実験条件：BGE、10％酢酸（pHは2.2）。分離電圧+30 kVで、試料注入、60秒間2.0 psiで。許可4で再現まで。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

ディスカッション

多孔質先端エミッタを用いsheathless CE-MS法は、高極性および荷電代謝物の分析のために提示されています。このアプローチの独特な特徴は、アニオン性またはカチオン性の代謝物のみMS検出およびCE電圧の極性を切り替えることによってプロファイリングすることができることです。生体試料中の高極性および荷電代謝物の広い範囲を構造的に類似した代謝物のために重要である、と（低い）ナノモル範囲の検出限界と高い分離効率で分析することができます。提示されたプロトコルは、生体試料の代謝プロファイリングのための方法の有用性を例示するために、細胞抽出物の代謝プロファイリング用sheathless CE-MSの使用に焦点を当てました。ここで説明するアプローチは、適切なサンプル前処理手順が使用されていることを考えると、そのようなヒト尿5のような生物学的サンプルの他のタイプの代謝プロファイリングのために使用することができます。

sheathlessのCE-MSメトdはCEの本質低流動性の利用を可能にする多孔質の先端エミッタに基づいています。この文脈において、安定したESI信号が再現可能な代謝プロファイリング研究のための前提条件です。したがって、噴霧器の先端が適切にMS入口の前に配置されることが重要です。このセットアップでは、ESIプロセスは、BGEの性質に主に依存しているため、BGEの最適化が重要です。 sheathless構成は、シース液の組成物のすべての種類のイオン化効率を向上させるために添加することができ、シース液CE-MSシステムと比較してあまり汎用性です。 sheathless ESI噴霧器の針が完全に導電性液体（ すなわち 、BGE液）で満たされる必要があります。不安定なESI信号は、部分的または完全に差し込ま毛細血管から生じ得ます。 BGEと高い圧力ですすぎすると、この問題を解決することができます。そうでなければ分離キャピラリーを交換する必要があります。分析性能の評価に先立って、安定したESIのバックグラウンド信号1日から別の一致している最初に生成する必要があります。

代謝プロファイリング研究のためsheathless CE-MS法の分析性能は、代謝産物の標準混合物を用いて毎日チェックする必要があります。同じ実験条件の下では、一貫性の移動時間、 すなわち、内-日の3％以下の変化（N = 10）との間の日（n = 5）で、ピークを代謝物の標準混合物（12.5μM）の20 nlの注入を使用して、 （60,000 400,000の間の範囲）の高さ/地域（15％以下の変動）とプレート番号が得られるはずです。検出限界は、ほとんどの代謝物の規格に対してナノモルの範囲でなければなりません。これらの基準が満たされた場合にのみ、生物学的サンプルの代謝プロファイリングのために準備する方法です。そうでない場合、MS機器は、調整されて再較正される必要があるか、多孔性チップキャピラリーエミッタは変更する必要があります。

CE-MS分析の間の効果的なすすぎ工程がないだけに、非常に重要です潜在的なキャリーオーバーを防止するだけでなく、分離性能を維持します。キャリーオーバーの可能性は、サンプルで汚染されたので、新しいBGEバイアルと交換することで解決BGEバイアルによって引き起こされることがあります。 sheathless CE-MS法を使用しない場合には、分離キャピラリーを切断するために、水に毛細管と、毛細管寿命を延ばすために、水を含むチューブで保護スリーブを有する浸漬外部の入口側を格納することが重要です。

要約すると、提案されたsheathlessのCE-MS法は、このプロトコルで報告された手順に従って使用される生物学的サンプルの代謝プロファイリングのための大きな可能性を示しています。この段階では、相互実験室の比較データは間違いなくメタボロミクスのためのこのアプローチの（長期）再現性および頑健性を評価するためにsheathless CE-MSのために必要とされます。このプロトコルは、このような研究を刺激することができます。様々な分析課題はまだ検討する必要があります。最適なPERFのためormanceは、CEの電流は、好ましくは5μA以下に維持すべきであり、この段階で、キャピラリーの多孔性チップのエミッタのみハイスループットアッセイの開発を妨げることができる91センチの長さで設けられています。また、低pH分離緩衝液は、構造的に関連する糖リン酸のベースライン分離を達成するために最適ではないかもしれないアニオン性、代謝プロファイリングのために使用しました。また、重要な（部分的に）負に用いる分離条件下で荷電されている唯一のアニオン性代謝産物を分析することができることです。次のステップは、現在臨床代謝プロファイリング研究のためsheathless CE-MS法の有用性を評価することで、単一の多孔質先端キャピラリエミッタは、最大100の生物学的試料の分析のために使用することができます。

sheathlessのCE-MS法は、s内の生物学的機能のより深い理解に向けて、すなわち 、メタボロミクスの分野で新たな方向が開かれますが全体的に、さらなる発展十分な制限例。

開示事項

開示するものは何もありません。

謝辞

Dr. Rawi Ramautarは、オランダ科学研究機構(NWO Veni 722.013.008)のVeni助成金制度の財政的支援に感謝したいと思います。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
CESI 8000 装置SciexA98089OptiMS アダプター CESI を
MS OptiMS フューズドシリカ カートリッジに結合するには、30 μm ID x 90 cm全長SciexB07367
OptiMSアダプター Sciex Nanospray IIIソースSciexB07363
CESIバイアルSciexB11648
マイクロバイアルSciex144709
氷酢酸シグマA6283ヒュームフードでの使用
カチオン性代謝物混合物ヒトメタボローム技術H3304-3034
陰イオン性代謝物混合物ヒトメタボロームテクノロジーH3304-1031
メタノール (LC-MS Ultra Chromasolv)Sigma14262ヒュームフードでの使用
水酸化ナトリウム溶液Sigma720790.1 M
U-87 MG 膠芽腫細胞株Sigma89081402
クロロホルムグマ650498有毒、ヒュームフードに使用
シ

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