方法論記事

トランスポゾンのシステムを用いたマウスの羊水細胞から多能性幹細胞の作製

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DOI：

10.3791/54598

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2017年2月28日

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1Stem Cell and Regenerative Medicine Laboratory, Fondazione Istituto di Ricerca Pediatrica Citta della Speranza, 2Lunenfeld-Tanenbaum Research Institute, Mount Sinai Hospital, 3Stem Cells and Regenerative Medicine Section, Developmental Biology and Cancer Programme, UCL Institute of Child Health and Great Ormond Street Hospital

この記事について

サマリー

この研究では、非ウイルスベースのトランスポゾンシステムを使用して、マウスの羊水細胞から人工多能性幹細胞を生成します。

要約

人工多能性幹細胞(iPS)細胞は、マウスとヒトの体細胞から、定義された転写因子を異なる方法で強制的に発現させることにより生成されます。ここでは、マウスの羊水細胞から、非ウイルスベースのトランスポゾンシステムを用いてiPS細胞を作製しました。得られたiPS細胞株はすべて、in vitroおよびin vivoで3つの生殖細胞層すべての誘導体に向けて分化する能力など、多能性細胞の特徴を示しました。この戦略は、罹患した胎児の細胞を使用して先天性欠損症の新しい治療法を開発する可能性を開きます。

概要

出生前診断は、遺伝性疾患（ すなわち染色体異常、単成または複成/多因子疾患）と先天性奇形（ すなわち先天性横隔膜ヘルニア、嚢胞性肺病変、臍帯ヘルニア、胃壁破裂）を評価するための重要な臨床的ツールです。羊水（AF）細胞（ すなわち 、羊水穿刺およびamnioreduction）または帝王切開1、2妊娠中期の間に定期的にスケジュールされた手順から取得するのは簡単です。出生前または新生児の患者からのAF細胞の利用可能性は、再生医療のためのこのソースを使用する可能性を提供し、いくつかの研究は、AF 3、4、5、6から単離された幹細胞集団を使用して、異なる組織の損傷または疾患を治療する可能性を検討しました、7、8、9、10、11、12。簡単に罹患した患者からのAF細胞を得る可能性は、疾患はしばしば静止している時間ウィンドウ内で、再プログラミングのために、この細胞源を使用するというアイデアに道を開きます。実際、AF細胞由来の人工多能性幹（iPS）細胞は、出産前の適切な患者特有の治療を製造するために、 インビトロでの薬物試験のために、または組織工学的アプローチのための目的の細胞に分化することができます。多くの研究は、既に細胞型13、14、15、16、17 <広範囲に再プログラムと区別されるAF細胞の能力を実証しています/ SUP>、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27。

4転写因子（Oct4の、Sox2の、CMYCおよびKlf4の）の強制発現を介して、再プログラミングされた体細胞の高橋と山中28によって発見されて以来、進展が再プログラミングの分野で行われています。異なる方法を考慮すると、我々は、ウイルスおよび非ウイルス性のアプローチを区別することができます。最初は、部分的に再プログラムされた細胞株の結果とのリスクの両方で、高効率レトロウイルス導入遺伝子の通常不完全なサイレンシングを有するウイルスベクター（レトロウイルスおよびレンチウイルス）の使用を想定し挿入突然変異29、30、31。 すなわちプラスミド、ベクター、mRNA、タンパク質、トランスポゾン：非ウイルス法は、異なる戦略を使用しています。トランスジェニック配列を含まiPS細胞の誘導は、漏出性導入遺伝子発現および挿入突然変異の潜在的に有害な影響を回避することを目指しています。上記の全ての非ウイルス戦略の中で、のpiggyBac（PB）トランスポゾン/トランスポザーゼシステムは挿入または切除イベント32を触媒する導入遺伝子およびトランスポザーゼ酵素の一過性発現に隣接する唯一の逆方向末端反復を必要とします。 iPS細胞の生成のための他の方法を介してトランスポゾンを使用する利点は、レトロウイルスベクターの同じ効率を示す非ウイルスベクターアプローチとベクトルフリーiPS細胞を得る可能性があります。これはreprogrのための統合されたトランスポゾンエンコーディングのトレースレス切除することにより可能ですiPS細胞33内のトランスポザーゼの新たな一過性の発現以下の要因をamming。 PBは、異なる細胞型34、35、36、37に効率的であることを考えると、ウイルスベクターに対する臨床的アプローチに適している、および生体異物を使用し、現在のウイルス産生プロトコルに反して異種非含有のiPS細胞の産生を可能にします条件は、このシステムは、マウスAFからiPS細胞を得るために使用されます。

ここでは、マウスのAF細胞（IPS-AF細胞）38からの多能性のiPSクローンの生産を表示するには、すでに発表された研究を、以下の詳細なプロトコルを提案します。

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プロトコル

すべての手順は、イタリアの法律に従いました。マウスAFサンプルをGFPと呼ばれるC57BL / 6-Tgの（UBC-GFP）30Scha / Jマウスからの13.5日後交尾（DPC）で妊娠したマウスから採取しました。

1.トランスポゾン生産

注：トランスポゾン発現ベクターは、標準的なクローニング手順を用いて作製しました。マウスAF細胞のトランスフェクション用のプラスミドDNAを、市販のキットを用いて調製しました。

  1. 1.5ミリリットルマイクロ遠心チューブ内DH5α細菌の50μlのプラスミドDNAの10 ngのを混ぜます。 20分間氷上でマイクロ遠心チューブをインキュベートします。
  2. 40秒間42℃でヒートショック。
  3. 2分間氷上でマイクロ遠心チューブを置きます。
  4. 予め温めた（37℃）LB培地（LB）培養液250μlのを追加します。 37℃で30分間（300 rpm）を振ります。
  5. 0.1mg / mlのアンピシリンを含むLBプレート上に各形質転換30μlのスプレッド。プレートを乾燥し、37°C​​ OVで反転インキュベート許可ernight。
  6. 次の日は、午後に、各形質転換から、無菌の200μlのヒントを使用して、3個のコロニーを選択し、0.1mg / mlのLBアンプに転送します。
  7. 37℃で一晩（300 rpm）した細菌を振ります。
  8. プラスミド精製のための市販のキットを使用します。 -20℃でストックのプラスミド。

2.マウス胎児線維芽細胞（MEF）の文化

  1. 0.1％ゼラチンで6ウェルプレートのコーティング
    1. フードの下コートプレートは、6つの各ウェルに滅菌0.1％のゼラチンを1ml加えます。ゼラチンを1時間インキュベーター（37℃）で重合してみましょう。
    2. 過剰を捨てて、1時間、プレートを乾燥させます。
    3. 室温でプレートを密封して保存するためにパラフィルムを使用してください。
  2. マイトマイシンCとのMEFの不活化
    1. 37℃の浴を用いて4×10 6のMEF細胞のバイアルを解凍します。
    2. MEF媒体とペトリ皿（150ミリメートル）上のフードにMEFをシード。
    3. 37℃で細胞を培養し、5％CO 2。
    4. （注意）細胞がコンフルエントであるマイトマイシンC（5 mg / mlで）を追加します。
    5. 3時間インキュベーター（37℃、5％CO 2）に入れる細胞。
    6. マイトマイシンCで洗浄細胞を1×リン酸緩衝生理食塩水（PBS）で3回培地を除去します。
    7. 5分間37℃のインキュベーターに商業トリプシンと場所細胞の2ミリリットルを追加します。後、トリプシン反応を停止するためにメディアをブロックする18ミリリットルを追加します。
    8. 製造業者のプロトコルに従ってburkerチャンバーを用いて細胞を数えます。
    9. 5分間、145×gで遠心分離した細胞。上清を捨てます。
    10. シード0.1％ゼラチンコーティングしたプレート上の不活性化MEFの60,000細胞/ cm 2。
    11. AFおよび/またはIPS-AF細胞を播種する前に、37℃で24時間、5％CO 2の細胞を養います。

3.マウスのAF細胞の単離

  1. 時限交配を設定し、膣のPLUをチェック共同住宅の24時間後にGS。
  2. 13.5 DPCまで観察し、頸椎脱臼を通して妊娠中のダムを生け贄に捧げます。
  3. 70％エタノールを用いて動物の腹壁を清掃してください。
  4. はさみを使用して、腹腔内へのアクセスを得るために腹壁の長さを切開正中開腹術を行います。
  5. 鉗子を使用して子宮を公開します。はさみを使用して子宮を取り出して、滅菌1×PBSで満たされた100ミリメートルペトリ皿に移す氷上に置きました。
  6. 10X倍率でAFを収集するために実体顕微鏡を使用してください。
  7. 鉗子で子宮を持ち、はさみで子宮壁を取り除きます。胎児膜およびその結果としての羊水漏れへの損傷を避けるように注意してください。
  8. 滅菌1×PBSで満たされた100ミリメートルペトリ皿に胎児を収集し、氷上に置きます。
  9. きれいな100ミリメートルペトリ皿に細かい点鉗子と場所との1胎児の胎盤をつかみます。
  10. 細かい点の鉗子を使用してSAC卵黄を削除してください。
  11. は細かい点の鉗子を使用して羊膜を破砕し、15ミリリットルコニカルバイアルにインスリン注射器を使用して、各胎児のためにAFの30μLを集めます。
  12. AF収集した後、1％ウシ胎児血清（FBS）を補充した滅菌1×PBSで各胎児を洗い、そして15ml中にAFを含有する円錐管を集めます。
  13. 5分間、145×gで遠心分離AF。ボンネットの下に上清を除去し、ペレット化したAF細胞を播種します。

4.マウスのAF細胞培養

  1. マウスAF細胞の播種
    1. ある日播種の前に、マイトマイシンC処理MEF 0.1％ゼラチンでコーティングした6ウェルプレートを準備します。
    2. AF収集後、AF用培地を用いて（約1×10 7細胞を6胎児から得た）分裂不活性化MEFに羊水穿刺から得られた細胞を播種します。
    3. 37℃で細胞を培養し、5％CO 2、一日おきに培地を変えます。
    4. 培養7日後、トランス以下の手順でfect AF細胞。

5.トランスフェクション、IPS-AF細胞の生成と文化

注：マウスAF細胞（PB-CAG-rtTAの）トランスポゾンプラスミドトランスポザーゼ発現プラスミド（mPBase）と一緒に、逆テトラサイクリントランスアクチベーターで、PB-tetO2-IRES-OKMSトランスポゾンプラスミドでトランスフェクトしました。全てのプラスミドは、教授アンドラーシュナジ33によって提供されました。

  1. 1.5ミリリットルマイクロ遠心チューブに：mPBase0.5μgのとPB-CAG-rtTAの（2μgのトータルDNA）の0.5μgのでPB-tetO2-IRES-OKMS1μgのを混ぜます。
  2. 無血清培地で100μL（ - DMEMダルベッコ改変イーグル培地）にDNAを希釈します。
  3. DNAを含む1.5 mlのマイクロ遠心チューブに：トランスフェクション試薬の8μL（ 例えば 、FUGENE）（8μLのトランスフェクション剤に2μgの（DNA）のトランスフェクション剤のプラスミドDNAの比で）を追加します。
  4. 室温で15分間トランスフェクション試薬/ DNA混合物をインキュベートします。
  5. /ウェル2 mLの最終容量で、マウスのAF細胞と6ウェルプレートにウェル当たりトランスフェクション試薬/ DNA混合物の100μLを滴下添加して、静かに旋回することにより配布します。 24時間放置。
  6. 翌日は、ドキシサイクリンの1.5μgの/ mLの（各ウェルのメディアの2ミリリットル）を補充した新鮮なのiPS-AF培地で細胞を供給することにより、山中の要因（Oct4の、Klf4の、CMYC、Sox2の）の発現を誘導します。
  7. 新鮮なDOX含有培地（ポイント5.13までドキシサイクリンを補充した培地中で細胞を維持する）で、通過することなく、毎日の細胞を養います。
  8. mCherryを発現のために24時間以内に、毎日のコロニー形成（コロニーは、典型的には、トランスフェクション後20〜30日の間に表示される）のための細胞を観察します。
  9. 一日コロニーピッキングの前に、マイトマイシンC処理したMEF 96ウェル組織培養プレートを準備します。
  10. ボリュームusinの50μLに、単一のコロニーをピックアップGA 200μLピペット、および個々のウェルで96ウェルプレートに順次転送します。
  11. 翌日、商業トリプシンを50μl添加することによって、単一細胞にすべてのコロニーを解離し、37℃で5分間インキュベートします。
  12. コロニーを脱凝集するために上下にピペット。
  13. ドキシサイクリンを補充した新鮮なのiPS-AF媒体の100μLを充填した96ウェルプレートコーティングされた0.1％ゼラチンで不活性化MEFで新しいウェルに解離したコロニーを含むトリプシンの譲渡50μL。
  14. 細胞60〜70％コンフルエンスに達すると、24ウェルプレートのウェルに分割。
  15. コロニーはドキシサイクリンなしの状態でも表示されるかどうかを確認するために2つの井戸、ドキシサイクリンなしのドキシサイクリンとの1および他に2：細胞が60から70パーセントコンフルエンスに達したら、1を分割します。
  16. IPS-AF媒体に不活性化MEFに、ドキシサイクリンの独立したiPS-AFクローンを、維持し続けます。
  17. 37℃、5％CO 2、CHで細胞を培養毎日培地をanging。

6.アルカリホスファターゼ染色

  1. ドキシサイクリンの独立したiPS-AF細胞の出現があるたびに、製造業者のプロトコルに従って、アルカリホスファターゼ染色を実行します。

7.免疫蛍光

  1. ドキシサイクリンの独立したiPS-AF細胞の出現があるたびに、不活性化MEF 24ウェルプレートのウェルに15万細胞/ cm 2を播種し、37℃、5％CO 2で48時間、細胞を増殖させます。
  2. （注意）を室温で15分間、4％パラホルムアルデヒド（PFA）のウェルあたり300μLを加えることにより細胞を固定してください。
  3. 細胞を透過性にするために、0.1％NP-40の300μLを加えます。
  4. 0.1％PBS-Tweenで20300μlで細胞を洗浄。
  5. 室温で1時間ブロッキング緩衝液（1×PBS中の10％ウマ血清）の300μlのを追加します。
  6. （1:10のOct4（1:80）、Sox2の（1:80）、Klf4の（1:80）、Nanogの次の一次抗体を使用して、0）およびSSEA1（1:80）。 1％ウシ血清アルブミン（BSA）、10％正常ヤギ血清でSSEA1を希釈し、0.3Mグリシン0.1％PBS-Tween-20を含みます。 1×PBS中の10％ウマ血清を持つすべての他の抗体を希釈します。
  7. 4℃で一晩抗体をインキュベートします。
  8. 0.1％PBS-Tween-20での300μlですすいでください。
  9. Alexa594結合ヤギ抗マウスIgG（1：200）、Alexa594結合ニワトリ抗ヤギIgG（1：200）、Alexa594結合ニワトリ抗ウサギIgGを1×PBS中の10％ウマ血清で希釈した二次抗体を使用し（1：200）、Alexa568結合ヤギ抗マウスIgM（1：200）。室温で2時間インキュベートします。
  10. 1×PBSですすいでください。
  11. 1×PBS中：ヘキスト溶液（万1）で染色核。

インビトロ細胞分化8.

  1. ハンギングドロップ胚様体（EB）を形成するために、分化培地を使用して、ペトリ皿の蓋の上に単一の滴（2,000細胞/ 20μl）を養います。
  2. 37℃で皿をインキュベート4日間、5％CO 2。
  3. 分化培地中で3日間懸濁培養100mmの細菌等級皿にEBSを移します。
  4. 別の14日間（DMEMで1:10に希釈した）基底膜マトリックスでコーティングされた24ウェルプレート中にプレートしたEB。
  5. T（1：100）、αFP（1：200）とTubb3（1：500）37免疫蛍光分析のために、一次抗体を使用しています。

9. インビボテラトーマ形成

  1. - / - γC - / -マウスRAG2の後肢の筋肉に1×10 6のiPS-AF細胞を含有する1×100μlのPBSを注入します。
  2. 6週間細胞注射後に頸椎脱臼を通してマウスを生け贄に捧げます。
  3. 以下の分析のためのマウスの後肢から、その大きさによって区別、腫瘍塊を除去します。
  4. クライオスタットを用いて、イソペンタン、凍結腫瘍の7-10μmの厚さの横断切片をカットします。
  5. ヘマトキシリンANのためのdはエオシン（HE）染色：
    1. 製造業者のプロトコールに従って、腫瘍組織の組成を評価するためにHEで染色。
  6. 免疫染色のために：
    1. 室温で15分間、4％PFAでテラトーマのセクションを修正しました。
    2. 0.1％トリトンX-100で透過性。
  7. 以下の抗体を用いてインキュベートする：Tubb3（1：100）、αFP（1：50）およびαSMA（1：100）は、1×PBS中の1％BSAで希釈しました。 1（Tubb3用）37℃で時間または4℃で一晩（他の抗体用）インキュベートします。
  8. 20分間、100％メタノールを用いてペルオキシダーゼを遮断します。
  9. 二次抗体抗マウスHRPコンジュゲート（150 1）を用いて37℃で45分間インキュベートします。
  10. 1×PBSですすいでください。
  11. 5分間ペルオキシダーゼ（HRP）基板（ 材料表を参照してください）でインキュベートします。
  12. 5分間水道水ですすいでください。
  13. 9秒間ヘマトキシリンQSで染色。
  14. 水道水ですすいでください。

    15. 細胞からの10 RNA抽出

    1. 製造業者の推奨プロトコルに従って、商業用のRNA抽出キットを使用してください。

    奇形腫から11 RNA抽出

    1. サンプルを解凍避けるために、乳棒と乳鉢および液体窒素を使用して奇形腫を均質化。
    2. 組織25mgを秤量します。
    3. RNA抽出のための市販試薬1mLのクロロホルムの200μLを追加します。
    4. 5分間、室温でインキュベートします。
    5. 13,000×gで遠心分離し、15分間、4°C。
    6. 新しいチューブにクリアして上清を移します。
    7. RNAは、製造業者のプロトコルに従って商用のRNA抽出キットを使用して精製しました。

    12.逆転写 - ポリメラーゼ連鎖反応分析

    1. 逆転写（RT） - ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）およびオリゴ（dT）アコーために逆転写酵素を用いて第一鎖cDNAを合成製造業者のプロトコルに丁は、50 ngの/ cDNAのμLを得ました。 10 ngの/μLの濃度でRNaseフリー水を用いてcDNAを希釈します。
    2. cDNAの1 ngの/μLを利用し、製造業者のプロトコルに従って、DNAポリメラーゼを用いてRT-PCRを行います。

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結果

再プログラミングの能力を評価するために、マウスAF細胞をGFPマウスの胎児から採取しました。細胞は、PB-（ドキシサイクリン誘導方法でmCherryを蛍光タンパク質に連結山中因子（Oct4の、Sox2の、CMYCおよびKlf4の）を発現円形トランスポゾンプラスミドPB-tetO2-IRES-OKMSでトランスフェクション、およびテトラサイクリントランスを逆にしました。 CAG-のrtTA）トランスポザーゼ発現プラスミド（mPBase）と一緒にプラスミド。マウスAF細胞をMEFフィーダー層上のインビトロ拡張の1週間後のOct4、Klf4の、CMYCおよびSox2のトランスフェクトしました。以前39に記載されているように 、外因性因子の発現のために、ドキシサイクリンは、1.5 / mlの濃度で、トランスフェクションの翌日に添加しました。 mCherryをの発現は、トランスフェクションを示すドキシサイクリン加え、24時...

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ディスカッション

多能性の誘導を得るために選択された方法は、長期移植に関して細胞臨床的安全性に関連します。今日では、再プログラミングに適したいくつかの方法があります。非組込み方法のうち、センダイウイルス（センダイウイルス）ベクターは、感染した細胞40の核内に統合することなく、タンパク質を大量に生産することができ、iPS細胞を得るための戦略であり得るRNAウイルスです。センダイウイルスベクターは、翻訳グレードiPS細胞の生成のための魅力的な候補かもしれないが、それはいくつかの欠点を提示します。ウイルスレプリカは、トランスジェニック配列の性質に敏感です。センダイウイルスベクターは、構成的に複製するので、別の戦略は、この態様41,42を改善するために使用される場合であっても、宿主細胞から排除することは困難です。このようなレベル2の生物学的安全キャビネットのように、特別な処理を必要とします。そこで私唯一の商業ベンダーが利用可能です。再プログラミングのための臨床グレードのセンダイウイルスの現在不足して...

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開示事項

著者らは、開示することは何もありません。

謝辞

この作業は、CARIPARO Foundationの助成金番号13/04およびFondazione Istituto di Ricerca Pediatrica Città della Speranzaの助成金番号10/02の支援を受けました。マルティナ・ピッコリ、キアラ・フランツィン、ミケーラ・ポッツォボンは、リチェルカ小児科スペランツァ財団から資金提供を受けています。エンリカ・ベルタンは、CARIPARO財団助成金番号13/04によって資金提供されています。パオロ・デ・コッピは、グレート・オーモンド・ストリート・ホスピタル・チルドレンズ・チャリティーから資金提供を受けています。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
100 mmバクテリアグレードのシャーレ BDファルコン351029in vitro分化用
2-メルカプトエタノール SigmaM6250マウスAF、iPS-AF細胞、分化培地用
Alexa568-conjugated goat anti-mouse IgM Thermo Fisher ScientificA21043二次抗体(免疫蛍光法)
Alexa594-conjugated chicken anti-goat IgG Thermo Fisher ScientificA21468二次抗体(免疫蛍光法)
Alexa594-conjugated chicken anti-rabbit IgG Thermo Fisher ScientificA21442二次抗体(免疫蛍光法)
Alexa594-conjugated goat anti-mouse IgG サーモフィッシャーサイエンティフィックA11005二次抗体(免疫蛍光法)
アルカリホスファターゼキット Sigma85L1アルカリホスファターゼ 
アンピシリンSigmaA0166細菌選択用
ウシ血清アルブミンの染色 シグマA7906BSA、ブロッキングソリューション用。PBS 1x
ChloroformSigmaC2432RNA抽出
用 DH5&α;細胞サーモフィッシャーサイエンティフィック18265-017クローニング手順
ダルベッコの修飾イーグル培地(DMEM)サーモフィッシャーサイエンティフィック41965039MEF、マウスAF、iPS-AF細胞および分化培地用
ドキシサイクリン SigmaD9891外因性因子発現
用微量遠心チューブ (1.5 ml) ザルシュテット 72.706PBプロダクション用 
ES FBS サーモフィッシャーサイエンティフィック10439024マウスAF、iPS-AF細胞、分化培地
FBS用 サーモフィッシャーサイエンティフィック10270106MEFミディアム
用 ファインポイント鉗子F.S.TDumont #5 AFアイソレーション
ゼラチンJ.T.Baker1310.1%を使用し、PBS 1x
GlycineBio-Rad161-0718ブロッキング溶液で希釈しました。PBS 1x
ヘマトキシリン QSVector LaboratoriesH3404Nuclei detection
HE Bio-Optica04-061010奇形腫の組織学的解析
Hoechst サーモフィッシャーサイエンティフィックH3570核検出
ウマ血清 サーモフィッシャーサイエンティフィック16050-122ブロッキング溶液
HRP-標識ヤギ 抗マウス IgGSantaCruzsc2005二次抗体 (免疫ペルオキシダーゼ)
ImmPACT NovaRED ベクターラボラトリーズSK4805ペルオキシダーゼ基質
針付きインスリン注射器(25 G)テルモSS+01H25161羊水穿刺手順
Klf4 SantaCruzsc-20691ウサギポリクローナルIgG
L-グルタミン サーモフィッシャーサイエンティフィック25030マウスAF、iPS-AF細胞、分化培地
LBブロス(レノックス)グマL3022細菌増殖用
LIF SigmaL5158マウスAF細胞およびiPS-AF細胞用培地
マトリゲル BD354234in vitro分化用。DMEMで1:10に希釈
ノールSigma32213ペルオキシダーゼブロッキング
MULTIWELL 24ウェルプレートBD Falcon353047in vitro分化用
MULTIWELL 6ウェルプレートBD Falcon353046MEF、マウスAFおよびiPS-AF細胞培養
用 Nanog ReproCELLRCAB0002P-FRabbit polyclonal IgG
非必須アミノ酸 SigmaM7145マウスAF、iPS-AF細胞、分化培地用
Normal Goat SerumVector LaboratoriesS2000ブロッキング溶液用。PBS 1x
NP-40Sigma12087-87-0細胞透過化します。PBS 1x
Oct4SantaCruzsc-5279マウスモノクローナルIgG2b
オリゴ(dT)で希釈 サーモフィッシャーサイエンティフィック18418012RT-PCR
パラホルムアルデヒド(溶液)グマ441244PFA、固定剤、PBS
10xThermo Fisher Scientific14200-067D-PBSで希釈、Ca2+/Mg2+。滅菌水で希釈してPBS 1x
ペニシリン-ストレプトマイシン サーモフィッシャーサイエンティフィック15070063MEF、マウスAF、iPS-AF細胞、分化培地用
ペトリディッシュ(150mm)BD Falcon353025MEF培養、組織培養用
PiggyBacトランスポゼース発現プラスミド Andras Nagy教授 研究室提供-mPBase
PiggyBac-tetO2-IRES-OKMS トランスポゾンプラスミドAndras Nagy教授提供 研究室-PB-tetO2-IRES-OKMS
QIAprep スピン Maxiprep キットQiagen12663プラスミド精製用
QIAprep スピン Miniprep キットQiagen27106プラスミド精製用
逆テトラサイクリントランスアクチベータートランスポゾンプラスミド Andras Nagy laboratory教授提供-rtTA
RNeasy Mini Kit Qiagen74134RNA抽出
用Sox2 SantaCruzsc-17320ヤギポリクローナルIgG
SSEA1 Abcamab16285マウスモノクローナルIgM
SuperScript II 逆転写酵素 サーモフィッシャーサイエンティフィック18064-014RT-PCR
T Abcamab20680ウサギポリクローナルIgG
Taq DNAポリメラーゼモフィッシャーサイエンティフィック10342020PCR
トリプシン サーモフィッシャーサイエンティフィック25300-054細胞培養継代
Triton X-100Bio-Rad161-047細胞透過化用、PBS 1x
TRIzol 試薬で希釈 サーモフィッシャーサイエンティフィック15596-026RNA抽出
Tubb3  プロメガ G712AマウスモノクローナルIgG1
TWEEN-20SigmaP1379細胞透過化用、PBS 1x
&αで希釈;fp   R&D SystemsMAB1368マウスモノクローナルIgG1
αSMA Abcamab7817マウスモノクローナルIgG2a
トランスフェクション試薬(FuGENE HD)Promega E2311AF細胞トランスフェクション用
実体顕微鏡ニコンSM2645羊水穿刺を行う 
200 μlヒント Sarstedt 70.760012バクテリアのコロニーを選ぶには
はさみF.S.T14094-11 ステンレス 25U羊水穿刺を行うには 
エタノールシグマ2860のダムの腹壁をきれいにするために
培養ペトリ皿(150 mm) BD Falcon353025MEF拡張用
マイトマイシンCSigmaM4287-2MGMEF不活化用
MULTIWELL 96ウェルプレートBD Falcon353071iPS-AF培養用
で希釈 用細菌 シ メタで希釈してシサー用妊娠中組織

参考文献

  1. You, Q., et al. Isolation of human mesenchymal stem cells from third-trimester amniotic fluid. Int J Gynaecol Obstet. 103 (2), 149-152 (2008).
  2. Prusa, A. R., Hengstschlager, M. Amniotic fluid cells and human stem cell research: a new connection. Med Sci Monit. 8 (11), RA253-RA257 (2002).
  3. Ditadi, A., et al. Human and murine amniotic fluid c-Kit+ Lin- cells display hematopoietic activity. Blood. 113 (17), 3953-3960 (2009).
  4. Piccoli, M., et al. Amniotic fluid stem cells restore the muscle cell niche in a HSA-Cre, Smn(F7/F7) mouse model. Stem Cells. 30 (8), 1675-1684 (2012).
  5. Zani, A., et al. Amniotic fluid stem cells improve survival and enhance repair of damaged intestine in necrotising enterocolitis via a COX-2 dependent mechanism. Gut. 63 (2), 300-309 (2014).
  6. Rota, C., et al. Human amniotic fluid stem cell preconditioning improves their regenerative potential. Stem Cells Dev. 21 (11), 1911-1923 (2012).
  7. Mirabella, T., et al. Pro-angiogenic soluble factors from Amniotic Fluid Stem Cells mediate the recruitment of endothelial progenitors in a model of ischemic fasciocutaneous flap. Stem Cells Dev. 21 (12), 2179-2188 (2012).
  8. Mirabella, T., Cili, M., Carlone, S., Cancedda, R., Gentili, C. Amniotic liquid derived stem cells as reservoir of secreted angiogenic factors capable of stimulating neo-arteriogenesis in an ischemic model. Biomaterials. 32 (15), 3689-3699 (2011).
  9. Yeh, Y. C., et al. Cardiac repair with injectable cell sheet fragments of human amniotic fluid stem cells in an immune-suppressed rat model. Biomaterials. 31 (25), 6444-6453 (2010).
  10. Kim, J. A., et al. MYOD mediates skeletal myogenic differentiation of human amniotic fluid stem cells and regeneration of muscle injury. Stem Cell Res Ther. 4 (6), 147(2013).
  11. Vadasz, S., et al. Second and third trimester amniotic fluid mesenchymal stem cells can repopulate a de-cellularized lung scaffold and express lung markers. J Pediatr Surg. 49 (11), 1554-1563 (2014).
  12. Turner, C. G., et al. Preclinical regulatory validation of an engineered diaphragmatic tendon made with amniotic mesenchymal stem cells. J Pediatr Surg. 46 (1), 57-61 (2011).
  13. Galende, E., et al. Amniotic Fluid Cells Are More Efficiently Reprogrammed to Pluripotency Than Adult Cells. Cloning Stem Cells. 12 (2), 117-125 (2009).
  14. Li, C., et al. Pluripotency can be rapidly and efficiently induced in human amniotic fluid-derived cells. Hum Mol Genet. 18 (22), 4340-4349 (2009).
  15. Ye, L., et al. Induced pluripotent stem cells offer new approach to therapy in thalassemia and sickle cell anemia and option in prenatal diagnosis in genetic diseases. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (24), 9826-9830 (2009).
  16. Wolfrum, K., et al. The LARGE Principle of Cellular Reprogramming: Lost, Acquired and Retained Gene Expression in Foreskin and Amniotic Fluid-Derived Human iPS Cells. PLoS ONE. 5 (10), 137-138 (2010).
  17. Ye, L., et al. Generation of induced pluripotent stem cells using site-specific integration with phage integrase. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (45), 19467-19472 (2010).
  18. Lu, H. E., et al. Selection of alkaline phosphatase-positive induced pluripotent stem cells from human amniotic fluid-derived cells by feeder-free system. Exp Cell Res. 317 (13), 1895-1903 (2011).
  19. Lu, H. E., et al. Modeling Neurogenesis Impairment in Down Syndrome with Induced Pluripotent Stem Cells from Trisomy 21 Amniotic Fluid Cells. Exp Cell Res. 319 (4), 498-505 (2012).
  20. Kobari, L., et al. Human induced pluripotent stem cells can reach complete terminal maturation: in vivo and in vitro evidence in the erythropoietic differentiation model. Haematologica. 97 (12), 1795-1803 (2012).
  21. Li, Q., Fan, Y., Sun, X., Yu, Y. Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Human Amniotic Fluid Cells by Reprogramming with Two Factors in Feeder-free Conditions. J Reprod Dev. 59 (1), 72-77 (2012).
  22. Fan, Y., Luo, Y., Chen, X., Li, Q., Sun, X. Generation of Human β-thalassemia Induced Pluripotent Stem Cells from Amniotic Fluid Cells Using a Single Excisable Lentiviral Stem Cell Cassette. J Reprod Dev. 58 (4), 404-409 (2012).
  23. Liu, T., et al. High efficiency of reprogramming CD34+ cells derived from human amniotic fluid into induced pluripotent stem cells with Oct4. Stem Cells Dev. 21 (12), 2322-2332 (2012).
  24. Jiang, G., et al. Human transgene-free amniotic-fluid-derived induced pluripotent stem cells for autologous cell therapy. Stem Cells Dev. 23 (21), 2613-2625 (2014).
  25. Drozd, A. M., et al. Generation of human iPSC from cells of fibroblastic and epithelial origin by means of the oriP/EBNA-1 episomal reprogramming system. Stem Cell Res Ther. 6 (122), (2015).
  26. Moschidou, D., et al. Human mid-trimester amniotic fluid stem cells cultured under embryonic stem cell conditions with Valproic acid acquire pluripotent characteristics. Stem Cells Dev. 22 (3), 444-458 (2012).
  27. Moschidou, D., et al. Valproic Acid Confers Functional Pluripotency to Human Amniotic Fluid Stem Cells in a Transgene-free Approach. Mol Ther. 20 (10), 1953-1967 (2012).
  28. Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
  29. Mikkelsen, T. S., et al. Dissecting direct reprogramming through integrative genomic analysis. Nature. 454 (7200), 49-55 (2008).
  30. Sridharan, R., et al. Role of the murine reprogramming factors in the induction of pluripotency. Cell. 136 (2), 364-377 (2009).
  31. Knight, S., Collins, M., Takeuchi, Y. Insertional mutagenesis by retroviral vectors: current concepts and methods of analysis. Curr Gene Ther. 13 (3), 211-227 (2013).
  32. Fraser, M. J., Ciszczon, T., Elick, T., Bauser, C. Precise excision of TTAA-specific lepidopteran transposons piggyBac (IFP2) and tagalong (TFP3) from the baculovirus genome in cell lines from two species of Lepidoptera. Insect Mol Biol. 5 (2), 141-151 (1996).
  33. Woltjen, K., Kim, S. I., Nagy, A. The PiggyBac Transposon as a Platform Technology for Somatic Cell Reprogramming Studies in Mouse. Methods Mol Biol. 1357, 1-22 (2015).
  34. Wu, S. C., et al. piggyBac is a flexible and highly active transposon as compared to sleeping beauty, Tol2, and Mos1 in mammalian cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (41), 15008-15013 (2006).
  35. Ding, S., et al. Efficient transposition of the piggyBac (PB) transposon in mammalian cells and mice. Cell. 122 (3), 473-483 (2005).
  36. Wang, W., et al. Chromosomal transposition of PiggyBac in mouse embryonic stem cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (27), 9290-9295 (2008).
  37. Cadiñanos, J., Bradley, A. Generation of an inducible and optimized PiggyBac transposon system. Nucleic Acids Res. 35 (12), e87(2007).
  38. Bertin, E., et al. Reprogramming of mouse amniotic fluid cells using a PiggyBac transposon system. Stem Cell Research. 15 (3), 510-513 (2015).
  39. Woltjen, K., et al. piggyBac transposition reprograms fibroblasts to induced pluripotent stem cells. Nature. 458 (7239), 766-770 (2009).
  40. Fusaki, N., et al. Efficient induction of transgene-free human pluripotent stem cells using a vector based on Sendai virus, an RNA virus that does not integrate into the host genome. Proc Jpn Acad Ser B Phys Biol Sci. 85 (8), 348-362 (2009).
  41. Nishishita, N., et al. Generation of virus-free induced pluripotent stem cell clones on a synthetic matrix via a single cell subcloning in the naive state. PLoS One. 7 (9), e38389(2012).
  42. Ono, M., et al. Generation of induced pluripotent stem cells from human nasal epithelial cells using a Sendai virus vector. PLoS One. 7 (8), e42855(2012).
  43. Yant, S. R., et al. High-resolution genome-wide mapping of transposon integration in mammals. Mol Cell Biol. 25 (6), 2085-2094 (2005).
  44. Wilson, M. H., Coates, C. J., George, A. L. PiggyBac transposon-mediated gene transfer in human cells. Mol Ther. 15 (1), 139-145 (2007).
  45. Galvan, D. L., et al. Genome-wide mapping of PiggyBac transposon integrations in primary human T cells. J Immunother. 32 (8), 837-844 (2009).
  46. Huang, X., et al. Gene transfer efficiency and genome-wide integration profiling of Sleeping Beauty, Tol2, and piggyBac transposons in human primary T cells. Mol Ther. 18 (10), 1803-1813 (2010).
  47. Meir, Y. J., et al. Genome-wide target profiling of PiggyBac and Tol2 in HEK 293: pros and cons for gene discovery and gene therapy. BMC Biotechnol. 11 (28), (2011).
  48. Moretti, A., et al. Patient-specific induced pluripotent stem-cell models for long-QT syndrome. N Engl J Med. 363 (15), 1397-1409 (2010).
  49. Filareto, A., et al. An ex vivo gene therapy approach to treat muscular dystrophy using inducible pluripotent stem cells. Nat Commun. 4 (1549), (2013).
  50. Darabi, R., et al. Human ES- and iPS-derived myogenic progenitors restore DYSTROPHIN and improve contractility upon transplantation in dystrophic mice. Cell Stem Cell. 10 (5), 610-619 (2012).

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