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方法論記事

高解像度落射顕微鏡を用いた3次元画像の迅速な取得

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DOI:

10.3791/54625

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2016年11月21日

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1Department of Pediatric Surgery, The Second Affiliated Hospital & Yuying Children's Hospital, Wenzhou Medical University, 2Departments of Urology, Boston Children's Hospital, 3Department of Surgery, Harvard Medical School, 4Department of Cardiovascular Surgery, Guangdong Cardiovascular Institute, Guangdong General Hospital, Guangdong Academy of Medical Sciences

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

私たちは、マウス胚の3次元(3D)画像を取得するための高解像度の顕微鏡法を用いた詳細なプロトコルを記述します。この改良されたプロトコルは、蛍光色素の浸透性を高めるために改良された組織調製法を利用しているため、小さな標本と大きな標本の両方の形態測定分析が可能になります。

要約

高解像度の顕微鏡顕微鏡(HREM)技術により、高解像度のデジタル体積および3次元(3D)形態測定データの迅速な取得が可能になります。ここでは、マウス胚全体をイメージングするための詳細なプロトコールについて説明します。このプロトコルは、サンプル調製、埋め込み、画像取得、そして最後に3D視覚化の4つの主要なセクションで構成されています。この技術では、標本を蛍光色素で染色する必要がありますが、これは大きな標本や密度の高い標本では問題となる可能性があります。この制限を克服するために、既存のプロトコルを改善して、尿素とドデシル硫酸ナトリウムを含む溶液で標本を前処理することにより、色素の組織浸透を強化しました。このプロトコルは、標準的な実験室環境に容易に適応できるように、日常的な実験装置と試薬のみを使用します。得られた高解像度3D画像は、マウス胚の内臓の詳細な形態学的特徴を忠実に再現し、それによって形態測定分析を可能にすることを示しました。私たちは、標準的な実験装置を使用して、小型および大型の試料の高解像度3D画像を取得するための詳細で改良されたプロトコルを一緒に提示します。

概要

3Dイメージング技術の出現により、胎児の発育中の詳細な形態学的特徴の体系的な解析の可能性が開かれました。現在、マイクロ磁気共鳴イメージング(マイクロMRI)、マイクロコンピュータ断層撮影、高周波超音波、光干渉断層撮影、光学プロジェクト断層撮影、エピスコピック顕微鏡1-4など、さまざまな3Dイメージングモダリティが利用可能になっています。各モダリティには、解像度、コントラスト、速度、コスト、子宮内能力、および可用性において独自の特徴があります。

エピスコピック蛍光画像キャプチャー(EFIC)および高解像度エピスコピック顕微鏡(HREM)は、エピスコピック顕微鏡イメージング法です 4.ここでは、高解像度のシリアル画像が組織切片ではなく、ブロック面から連続的にキャプチャされます。結果として得られる画像は、組織の歪みを最小限に抑えて、またはまったく詳細な形態学的特徴を忠実に反映しています。取得した体積データは、正確な形態計測解析に適した高解像度の3D画像に容易に変換することができます。比較的低コストで高解像度であるため、HREMとEPICは、ヒトの先天性欠損症2,4-8のマウスモデルの全身評価の優れた代替手段となっています。

EFIC法とHREM法の両方で、試料を適切な媒体に埋め込む必要があります。EFICは、埋め込まれた組織から放出される自家蛍光を検出します。このため、自家蛍光を多く放出する標本に限られ、初期胚9のように自家蛍光が比較的弱い標本には限られていない。自家蛍光の依存性を克服するために、標本は高分解能電子顕微鏡イメージングのためにエオシンなどの蛍光色素で染色されます。また、色素や染色方法の選択肢により、HREMは組織構造や形態の文脈で分子シグナルを検出するための適合性を高めることができます4,10。

この記事では、後期マウス胚の全身評価に適した改良型HREMプロトコルを紹介します。染色を容易にするために、組織の浸透性を高めるための前処理ステップを含め、それにより高齢のマウス胚のHREMイメージングが可能になります。

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プロトコル

すべての動物の使用は、ボストン小児病院で施設内動物管理使用委員会によって承認されています。

1.試料の調製

  1. 時限交配
    1. 同じケージで一緒のC57Bl6野生型のオスとメスを入れます。
    2. 次の日の朝早く、嵌合プラグの形成のために確認してください。嵌合プラグ（ 別名 、膣または交尾プラグ）は、そのブロック膣を硬化ゲル状の堆積です。
    3. 胎生0.5（E0.5）などのプラグ日付を設定します。
  2. マウス胚の単離
    1. CO 2窒息により妊娠した雌を安楽死させます。
    2. 吸収パッドに仰向けマウスを入れて、70％エタノールで腹部をスプレー。
    3. 皮膚を持ち上げ、手術用はさみを使用して尾側腹部での初期5ミリメートルの切開を行います。カットし、完全に内臓を露出させるために腹部の皮膚を取り除きます
    4. VAの近くにカットGINAは、子宮全体を削除します。
    5. 子宮角に沿って移植部位の間で切断。各セグメントまたは受胎は、内部に一つだけの胚を持っている必要があります。
    6. 1xの氷冷リン酸緩衝生理食塩水（PBS）で子宮セグメントを保管してください。
  3. 胚の解剖
    1. ステレオスコープの下の氷冷PBSで別々の皿に各受胎を置きます。
    2. 順次細かい解剖鉗子を使用して、子宮組織、胎盤、その後、胎児膜を削除します。
    3. 大ホールピペットを用いて、1×氷冷PBSで50mlチューブに解剖胚を転送します。組織の損傷を最小限にするためにピンセットで直接胚を拾うことは避けてください。
  4. 固定
    1. 固定剤の少なくとも10のサンプルボリュームを持つ以上24時間4℃で10％中性緩衝ホルマリン溶液中で切開した胚を修正しました。
  5. 前処理
    1. 4：クリアソリューションを準備二重蒸留水中M尿素、10％グリセロール、4％ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）。
    2. クリアリング・ソリューションとの固定液を交換してください。
    3. 2週間 - 優しく1室温でロッカー上の標本を回転させます。第二および第三日目に一度クリアソリューションを交換します。標本はゆっくりとはっきりと半透明になります。
    4. 10％ホルマリンでクリアソリューションを交換し、2日間ロッカーに残します。
  6. 脱水
    1. 5分ごとに、1×PBSで3回を前処理したサンプルを洗ってください。
    2. 穏やかなロッカー上で室温にて昇順エタノール系列でサンプルを脱水します。 E15.5の胚については、50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％及び100％エタノール、2時間、各段階を含む、上昇エタノール系列を使用します。古い胚については、インキュベーション時間を長くする必要があります。
  7. 染色
    1. エオシンY二ナトリウム塩と0.02の0.1375グラムを追加します。染色溶液を準備100％エタノール50ml中にアクリジンオレンジヘミ（塩化亜鉛）塩75グラム。 2時間撹拌。濾紙でフィルタリングします。室温で保存し、アルミホイルで覆うことにより、光を避けます。
    2. 1時間染色溶液に試料を転送します。
    3. 新鮮な染色液と染色一夜に交換してください。
  8. 浸潤
    1. 浸透液を調製：JB-4埋め込みキットの溶液Aの100ミリリットル、触媒C、エオシンY二ナトリウム塩の0.275グラムとアクリジンオレンジヘミ（塩化亜鉛）塩の0.055グラムの1.25グラムを兼ね備えています。 2時間アイスバケット中（200 rpm）を混合するために攪拌し、次いで濾紙で濾過します。
    2. 4℃で浸透ソリューションを保存し、アルミホイルで覆うことにより、光を避けます。
    3. 浸透液に胚を移す：染色溶液（1：1）、および4℃でロッカー上で少なくとも3時間インキュベートします。
    4. 浸透液に胚を移し、3時間インキュベート低温室でロッカーの研究。
    5. 一回毎日浸透ソリューションを交換し、さらに3日間緩やかなロッカーに寒い部屋に残します。

2.埋め込み

  1. 氷の上に溶液Bと浸透策を保管してください。
  2. すぐに埋め込む前に埋め込みソリューション（溶液Bと浸透策の1時25分）を行います。
  3. オリエント埋め込む金型内の検体は、その後静かに埋め込む型の中に冷たい埋め込みソリューションを注ぎます。再配向させる必要に応じてピンで。
  4. 埋め込みソリューションが固化されているかどうかを調べるためにピンを使用します。試料ブロックを押し、必要に応じてそれをトリミング。
  5. クロスの向きを取得するために別々の金型を使用して試料ブロックの向きを変えます。
  6. 埋め込む金型の上にブロックホルダーを置きます。金型とブロックホルダは埋め込みソリューションによって水没するまで静かに金型内に埋め込みソリューションを注ぎます。
  7. 第2の容器に試料を保持し、それを残しますヒュームフード内で4時間 - 3氷上で。
  8. 4°Cで固化した標本を保管してください。
  9. 埋込み型を剥がします。ブロック内の試料の位置を検査するために、斜め照明で実体顕微鏡下にブロックを置きます。試料の周りのブロック面には、マークグリッド線。
  10. 参照としてマークされたグリッド線を使用して材料を埋め込むのアクセス量を除去するためにブロックをトリム。

3.画像取得

  1. ミクロトームに試料ブロックを固定し、新鮮な切断面を得ます。セット部の厚さ（ 例えば 、e9.5-10.5、1.5ミクロン; e11.5-12.5、2.0ミクロン; e13.5-15.5、2.5ミクロン; E16.5-古い、3ミクロン）。ミクロトームのホームポジションに検体/ブロックを保管してください。
  2. 水平方向に試料のブロック面に対向ステレオズーム顕微鏡をマウントします。
  3. コンピュータと顕微鏡の電源を入れ、画像取得ソフトウェアを起動します。
  4. 視覚化し、ブロック面に光学系の焦点を合わせますイメージングソフトウェアの「ライブビュー」モードで。
  5. ブロック-顔がファインダーの中心になるように、必要に応じて顕微鏡およびミクロトームを合わせます。
  6. ブロック全体-顔がファインダー内に収まるようにズームを調整します。
  7. 緑色蛍光タンパク質（GFP）フィルター（励起470±20 nmで、ダイクロイック495nmで、発光525±25 nm）を選択し、必要に応じて再び焦点を合わせます。
  8. 測定し、設定された露光時間を手動で（ 例えば、80から400ミニ秒）。
  9. 各新鮮なカットの後、ブロックの顔の画像を取得し、可能な場合は、自動的に画像を保存します。
  10. 解像度、切片厚とズームを含むレコードの重要なパラメータ。
  11. 標本全体を終えた後、エクスポートし、必要に応じてすべての画像ファイルは、JPEG形式に変換します。
  12. イメージング処理ソフトウェアを使用して、すべての原稿画像を反転し、明るさとコントラストを調整します。
  13. 別のフォルダ内のすべての処理された画像を保存します。

4. 3D可視化

  1. 指示に従って、3D可視化ソフトウェアに対するすべての処理された画像をアップロードします。
  2. 入力解像度とセクションの厚さは、ボリュームデータ（ すなわち、ボクセルサイズ）へのすべての画像を変換し、3Dファイルを保存します。
  3. 自動モードを使用して、すべての画像の位置を合わせます。必要に応じて手動で個々の画像を調整します。
  4. 新しいファイル名に合わせた画像を保存します。
  5. 3次元可視化ソフトウェアを使用して、試料の形態学的特徴を分析します。

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結果

我々は、E9.5とE13.5 8間のマウス胚の高品質のHREM画像を報告しています。後期段階の胚の画像品質は、しかしながら、かなりために蛍光色素エオシンの限られた組織浸透の危険にさらされています。染色効率を向上させるために、我々は、蛍光イメージング11に互換性のあるいくつかの前処理方法をテストしています。具体的には、E15.5マウス胚のSca /電子A2 12または全身CUBIC 13のいずれかで処理しました。我々はまた、簡略化された式、クリア溶液（4 M尿素、10％グリセロール、4％ドデシル硫酸ナトリウム）を試験しました。すべての前処理方法は、染色効率を増加させました。胚はクリアソリューションによる治療の1週間後に半透明になりました。明らかな組織損傷は、治療後に検出されませんでした。前処理された胚はembeddeされる前に脱水、染色および浸潤などの工程を経て処理されましたプラスチック包埋媒体中のd。 HREM画像はセクション3で上述したように埋め込まれた標本から得られた（画像取得）お...

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ディスカッション

ここでは、迅速な3D可視化および複雑な構造の形態計測分析のために互換性のあるシリアルHREM画像を取得するために、ルーチン実験装置を使用して修正されたプロトコルを提示します。高解像度の画像ではなく、個々のセクションのブロック面から直接取得されるため、微細な形態学的特徴を保持し、迅速に3次元可視化プログラムでデジタル再構築されます。

3Dイメージングは​​、複雑な形態学的特徴を視覚化し、理解する上で重要な利点を提供しています。ほとんどの3Dイメージング技術は、特殊な装置1-4に依存します。これとは対照的に、EFICおよびHREMイメージングは、デジタルカメラやミクロトーム14を装備した実体顕微鏡を含む標準的な実験装置を利用しています。顕微鏡とミクロトームの間の機能的結合は、画像取得の自動化は、全体の画像取得プロセスの自動化を可能に可能にします。しかし、ことを示しています機能性カップリングは8必須ではありません。それは安静時停止位置での標準ミクロトームのブロック面に直接面するようにする代わりに、我々は単に水平に実体顕微...

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開示事項

著者らは開示するものは何もない。

謝辞

技術サポートを提供してくださったYichen Huang博士、Chunming Guo博士、Zhenfang Zhou博士に感謝いたします。この研究は、NIH/NIDDK (1R01DK091645-01A1, XL) と American Heart Association (AHA, 13GRNT16950006, XL) の資金提供を受けました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
マウスジャクソン研究所C57BL6
エチルアルコールPharmco-Aaper111000200 200 プルーフ、アブソリュート、ACS/USP/コーシャグレード
ホルマリンシグマHT501128-4L
尿素シグマU5128クリアリングソリューション
グリセロールフィッシャー科学G33-4クリアリングソリューション
ナトリウムドデシル硫酸塩Invitrogen15525-017清澄化溶液
エオシン Y 二ナトリウム 塩フィッシャー 科学BP241925浸透液
アクリジン オレンジ ヘミ(塩化亜鉛)塩シグマA6014浸透液
Whatman 論文GE3030-153
JB-4 埋め込みキット - ソリューション APolysciences, Inc.0226A-800浸透液
JB-4 埋込キット - ソリューションB(株)ポリサイエンス0226B-30埋込みソリューション
JB-4 埋め込みキット - CatalystPolysciences, Inc.02618-12液
金型埋め込み(株) Polysciences, Inc.23185-116 x 8 mm
Peel-A-Way シャープ埋め込み金型Polysciences, Inc.18986-122 mm x 22 mm角、12 mm x 12 mm
JB-4に切り捨てられる JB-4 プラスチックブロックホルダーPolysciences, Inc.15899
の目盛り付きトランスファーパイプVWR414004-014
ペトルディッシュVWR25384-088胚解
剖鉗子イノックスチップ ROBOZRS-5015胚解剖
Graefe Tissue Forcep ROBOZRS-5153胚解剖
デリケート手術用ハサミ ROBOZRS-6700胚解剖
14 ml ポリプロピレン丸底チューブファルコン352059
50 ml ポリプロピレン円錐チューブファルコン352098
アイスバケツマジック タッチ アイスウェア インターナショナル コーポレーションR19-343
100 ml(3.4オンス)帯電防止ポリスチレン計量ボートVWR89106-766
330 ml(11.2オンス)帯電防止ポリスチレンはボートVWR89106-770
ナトリウムMPバイオメディカル102892PBS溶液
塩化カリウムグマP0662PBS溶液
リン酸カリウム一塩基性シグマP5405PBS溶液
ナトリウム二塩基性七水和物グマアルドリッチS9390PBS溶液
デジカメ浜松ホトニクスC11440-10C
ミクロトームライカRM2265
イルミネーターカールツァイスHXP 200C
蛍光ステレオズーム顕微鏡カールツァイスアクシオ Zoom.V16
実体顕微鏡オリンパスSZX16
光ファイバー光源ライカKL 1500 LCD
使い捨てミクロトームブレードVWR95057-832
シングルエッジディスペンサーペルソナ62-0330-0000
ZENCarl Zeisspro 2012
PhotoshopAdobeCS6 v13.0
Amira 3DソフトウェアVisage Imaging5.4
コンピューターDell T7600、2x900GB SASハードドライブおよび64 GB DDR3 RDIMMメモリ
ロッキングプラットフォームシェーカーVWR40000-304
標準ホットプレートスターラーVWR12365-382
分析天びんメトラー・トレドAB54-S
浸透使い捨て塩化シリン酸シを量ります

参考文献

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