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方法論記事

調製と

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DOI：

10.3791/54652

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2016年11月23日

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1Drug Discovery and Development, Istituto Italiano di Tecnologia, 2Departments of Anatomy and Neurobiology, Pharmacology, and Biological Chemistry, University of California, Irvine School of Medicine

この記事について

サマリー

ここでは、アクティビティベースのプローブの調製および使用を記載する（ARN14686、ウンデカ-10- ynyl- N - [（3 S）-2-オキソアゼチジン-3-イル]カルバメート）の検出および定量を可能にします前炎症性酵素Nの活性形態は、in vitroおよびex vivoの両方、酸アミダーゼ（NAAA）を-acylethanolamine。

要約

活性に基づくタンパク質プロファイリング（ABPP）は、酵素の活性部位を標的とする化学的プローブの使用を介して複雑なプロテオームにおける目的の酵素を同定するための方法です。プローブに導入されたレポータータグは、ゲル内蛍光スキャニング、タンパク質ブロット、蛍光顕微鏡、または液体クロマトグラフィー - 質量分析法による酵素標識の検出を可能にします。ここでは、化合物のARN14686、選択的にNが酸アミダーゼ（NAAA）を-acylethanolamine酵素を認識し、クリックケミストリーアクティビティベースのプローブ（CC-ABP）の製造および使用を記載します。 NAAAは、パルミトイルエタノールアミド（PEA）及びオレオイルエタノールアミド（OEA）などの内因性ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体（PPAR） - アルファアゴニストを非活性化することによって炎症を促進するシステイン加水分解酵素です。 NAAAは、リソソームの酸性pHで自己タンパク質分解によって活性化される不活性な完全長プロ酵素として合成されます。ローカリゼーション研究の時間AVEは、NAAAは、主にマクロファージおよび他の単球由来細胞における、並びにBリンパ球で発現されることを示します。我々はARN14686タンパク質ブロット、蛍光顕微鏡によりげっ歯類組織において活性NAAA エクスビボの検出および定量化するために使用できる方法の例を提供します。

概要

一般的に使用される発現パターン、相互作用、及びショットガン分析1,2のための液体クロマトグラフィー-質量分析プラットフォームを含むタンパク質の機能を調査する方法、酵母ツーハイブリッド法3,4、およびインビトロアッセイにおいて 、それらがあることで制限されていますその天然の状態でタンパク質の活性を評価することができません。活性に基づくタンパク質プロファイリング（ABPP）は、このギャップを埋めるために使用することができます。このアプローチでは、共有結合的に目的の酵素の活性部位に結合することができる小分子プローブは、標的検出を可能にするレポーター基に結合しています。クリックケミストリー（CC）を使用して、レポータープローブに組み込むことができ、または標的係合5,6を発生した後に導入することができます。後者の手順は、SUCバイオ直交反応を介してレポーター試薬の数に変更することができ、そのような末端アルキンまたはアジドなどの適切な化学基を含有するプローブの使用を必要としますCu（I）などのhはヒュイゲン[3 + 2]環7-9またはシュタウディンガーライゲーション10,11 -触媒。

最近、我々は、in vitroでの最初のABPとしてシステイン加水分解酵素、NAAA 12のインビボでの検出中の化合物ARN14686を開示しました。 NAAAは、抗炎症性核内受容体PPAR-α13-15の内因性アゴニストであるオレオイルエタノールアミド（OEA）とパルミトイルエタノールアミド（PEA）を含む飽和および一価不飽和のFAE、の加水分解不活性化を触媒します。 NAAAは、主に先天性免疫応答の調節における役割を示唆し、ならびにBリンパ球14,16のように、マクロファージおよび他の単球由来細胞において発現されます。酵素は不活性型の粗面小胞体で合成され、自己タンパク質分解機構17によって、細胞の酸性区画において活性化されます。自己タンパク質分解切断は、新しいN末端システイン（C13を生成し、マウスおよびラットにおける1、ヒトにおけるC126）、すなわちFAE加水分解18,19のための求核責任があります。 NAAA活性の薬理学的阻害は、のFAE 16,20,21の増加細胞レベルの賛成でFAE合成/分解のバランスを変化させます。いくつかのβラクトンおよびβラクタム誘導体は高い効力および選択16,22-26でNAAA活性を阻害することが示されています。これらの阻害剤は、触媒システイン16,27,28 のS -acylationを介して作用します。

（ - [（S）-2-オキソアゼチジン-3-イル]カルバミン酸4- cyclohexylbutyl- N）16化合物ARN14686は全身活性、セリン由来βラクタムNAAA阻害剤の化学構造、ARN726に基づいて設計しました。 ARN726の4-t-ブチルシクロヘキシル基は、アジドベアリングレポータータグとその後のCCのコンジュゲートのための末端アルキンタグを担持するC9飽和脂肪族鎖で置換しました。私たちは、minimallに2段階のABPを設計することにしましたyはこのようにNAAAに対するプローブの親和性を維持し、元の足場の構造を変更します。また、かさばるタグの導入を避け、そのようなプローブは、直接ABPよりin vivoでの治療のためのより適切である可能性があります。 ARN14686は、酵素12の触媒システインと共有結合付加物を形成することにより、高い効力を有するNAAA（hNAAA IC 50 = 6 nMで、rNAAA IC 50 = 13 nM）を阻害します。生きたラットの実験では、プローブは、NAAAは肺で発現撮影において選択的であることが示されました。高いプローブ濃度（ インビトロでの 10μM、10ミリグラム/静脈、静脈ミリリットル）12を使用する際に酸セラミダーゼ、NAAAと33-34％の同一性を共有する他のシステインアミダーゼは、低親和性標的として同定されました。我々はまた、完全フロイントアジュバント（CFA）29の投与後の炎症を起こしたラット組織における活性NAAAの存在を研究するためにARN14686を使用しています。

ここでは、preparatiためのプロトコルの概要を説明します（ 図1）及びex vivoで NAAA活性化の調査への応用ARN14686の上。例として、我々は、CFA投与後のラットの足でNAAAを可視化する実験手順を説明します。この実験では、タンパク質は、プローブの静脈注射後の足の組織から抽出され、ABP標識プロテオームは、ビオチンアジドとCCに供されます。ビオチン化されたサンプルは、ストレプトアビジンビーズを使用して濃縮され、そしてタンパク質ブロットが行われます。別のアプリケーションでは、我々は、プローブ処置マウスからのマウスの肺における蛍光顕微鏡により活性NAAAの局在化を説明します。この場合には、組織を切片化し、切片をローダミン添加用CCに供されます。ワークフロー方式は、図2に示されています。

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プロトコル

注意：すべての化学反応は、換気ドラフト中や白衣、手袋、保護用眼鏡を使用して行われるべきです。反応はまた、窒素環境下で行われるべきです。

倫理的な声明：動物を伴う私たちの手順は、実験や他の科学的な目的（DM 116192）、および欧州経済共同体の規制のために使用される動物の保護に関するイタリアの規則に従って行われている（OJ EC Lの1分の358 1986年12月18日）。

注：の合成[（3 S）-2-オキソアゼチジン-3-イル]酢酸アンモニウムは、大規模な収率（N -Cbz-L-セリン50gの）について記載されているが、それは容易に縮小することができます。

1.合成

注：合成反応スキームについては、 図1を参照してください。

  1. 2-ピリジルウンデカ-10-イニルカーボネートおよびウンデカ-10-イニル2-オキソピリジン-1-カルボキシレートの調製
    1. 50mLの丸底フラスコに、undec-の350 mgの溶解10-YN-1オール乾燥ジクロロメタン3.5ミリリットルインチ
    2. 1.1.1で溶液に、4-ジメチルアミノピリジン（DMAP）と2-dipyridylcarbonate（DPC）の530 mgの25mgを追加します。 16時間室温（RT）で混合物を撹拌しました。
    3. ジクロロメタン20mlを追加します。
    4. 分液漏斗に混合物を転送します。水15mlを加え、それを振ると、2つの相を分離することができます。
    5. 、コックを開いて、有機相（下）を収集し、その後コックを閉じます。飽和NaHCO 3溶液の15ミリリットルを追加します。分液ロートを振ると、2相を分離しましょう。このステップをさらに2回繰り返します。
    6. し、Na 2 SO 4で有機層を乾燥丸底フラスコ（風袋最初）に綿を通して濾過し、そして減圧（回転蒸発器）の下で乾燥するまで蒸発させます。
    7. フラスコを秤量し、2-ピリジルウンデカ10イニル、炭酸ウンデカ10イニル1.7の比率で2-オキソピリジン-1-カルボキシレートの混合物である油の600 mgを得る：1。
      1 H NMR（400 MHzの、DMSO-dの6）主要成分δ= 8.39（ddの、J = 5.0、2.0、1H）、7.98（tdの、J = 7.9、2.0、1H）、7.40（dddの、J = 7.2、 4.9、0.9、1H）、7.30（D、J = 8.2、1H）、4.22（T、J = 6.6、2H）、2.73（T、J = 2.4、1H）、2.18から2.11（メートル、2H）、1.76 - 1.62（M、2H）、1.50 - 1.23（M、12H）。
      1 H NMR（400 MHzの、DMSO-dの6）微量成分δ= 7.74（ddの、J = 7.2、1.9、1H）、7.47（ddの、J = 6.7、2.3、1H）、6.44（D、J = 9.4、 1H）、6.30から6.25（メートル、1H）、4.35（T、J = 6.5、2H）、2.72（T、J = 2.4、1H）、2.18から2.11（メートル、2H）、1.77から1.60（メートル、2H ）1.52 - 1.20（M、12H）。
    8. 任意のさらなる分離または精製することなく、オイルを使用してください。
  2. [（3 S）-2-オキソアゼチジン-3-イル]酢酸アンモニウムの調製
    1. ベンジルNの調製- [（S）-1-（ヒドロキシメチル）-2 - [（4-メトキシフェニル）アミノ] -2- oxoethイル]カルバミン酸。
      1. 4-L丸底フラスコに、テトラヒドロフラン、ジクロロメタンの0.5 Lの1.5 L のP -anisidineの141.5グラムを溶解します。
      2. 氷浴中で0℃に溶液を冷却します。
      3. N -Cbz-L-セリン50.0gのを追加し、N 43.9 - G（3-ジメチルアミノプロピル） - N 'エチルカルボジイミド塩酸塩。
      4. 0℃で30分間磁気棒との混合物を撹拌しました。
      5. 氷浴から溶液を除去し、16時間室温で磁気棒でかき混ぜます。
      6. 減圧下（回転蒸発器）下で溶媒を蒸発させます。
      7. へらでかき混ぜ、1シクロヘキサン/酢酸エチル、およびデカント：1の400ミリリットルを追加します。
      8. 手順を繰り返し1.2.1.7 2回以上。
      9. 酢酸エチル500mlにゴム状残留物を溶解し、飽和NaHCO 3溶液（2回）の400mlで、0.1 M HCl溶液（10倍）400mlで洗浄し、ブライン400mLで。
      10. 有機層を乾燥Na 2 SO 4、丸底フラスコ（風袋最初）に綿を通して溶液を濾過し、減圧下（ロータリーエバポレーター）下で乾燥して蒸発させます。
      11. フラスコを計量し、白色固体の61.4グラムを得ます。
        1 H NMR（400 MHzの、DMSO-dを6）δ= 9.86（BS、1H）、7.52（D、2H、J = 9.0 Hz）と、7.42から7.25（M、6H）、6.91から6.85（M、2H） 、5.06（D、1H、J = 12.9 Hz）で、5.02の（d、1H、J = 12.9 Hz）で、4.98（T、1H、J = 5.6 Hz）と、4.24から4.15（M、1H）、3.72（S、 3H）、3.70から3.57（メートル、2H）。
    2. ベンジルNの調製- [（S）-1-（4-メトキシフェニル）-2-オキソ-アゼチジン-3-イル]カルバメート。
      1. N 58.6グラム溶解- [（S）-1-（ヒドロキシメチル）-2 - [（4-メトキシフェニル）アミノ] -2-オキソ-エチル]カルバミン酸N、N-ジメチルホルムアミドの1.6 Lです。
      2. 氷浴で0℃にソリューションを冷却します。
      3. 1,1'- sulfonyldiimidazoleの50.6グラムを加え、30分間磁気棒でかき混ぜます。
      4. ソリューションをクール氷/塩化ナトリウム浴で-20℃にし、水素化ナトリウムの10.2グラム（鉱油中60％）を少量ずつを追加します。
      5. 1時間-20℃で混合物を撹拌し、次いでメタノール2ml及び水1Lでクエンチしました。
      6. 真空は、沈殿物をフィルタリングし、200mlの水で洗浄し、そして真空下で乾燥しました。
      7. 白色固体の42.2グラムを取得します。
        1 H NMR（400 MHzの、DMSO-dの6）δ= 8.08の（d、1H、J = 8.5 Hz）で、7.42から7.28（メートル、5H）、7.30（D、2H、J = 8.9 Hz）で、6.95の（d 、2H、J = 8.9ヘルツ）、5.06（S、2H）、4.86（DDD、1H、J = 8.5、5.6、2.6ヘルツ）、3.90（T、1H、J = 5.6ヘルツ）、3.73（S、3H） 、3.55（ddの、1H、J = 5.6、2.6ヘルツ）。
    3. ベンジルNの調製- [（S）-2-オキソアゼチジン-3-イル]カルバメート。
      1. ベンジルN 9.0gのサスペンド- [（S）-1-（4-メトキシフェニル）-2-オキソアゼチジン-3-イル]カルバメートアセトニトリルを500mlと水400mlです。
      2. 氷浴中で0℃に溶液を冷却します。
      3. CERIの45.4グラムを追加します。C硝酸アンモニウム部単位45分かけて、15分間0℃で磁気棒で撹拌しました。
      4. 慎重に飽和NaHCO 3溶液500mlを追加し、酢酸エチル500mlを加えます。
      5. 沈殿物を濾過し、200mlの酢酸エチルで洗浄します。
      6. 二相溶液を分離し、200mlの酢酸エチル（3回）で水層を洗浄します。
      7. し、Na 2 SO 4で有機層を乾燥珪藻土シリカのパッドに通して活性炭の5グラム、フィルタを追加し、減圧下（回転蒸発器）の下で乾燥するまで蒸発させます。
      8. ジエチルエーテルを加え、へらでかき混ぜます。
      9. 固体を濾過し、オフホワイトの固体の4.85グラムを得ます。
        1 H NMR（400 MHzの、DMSO-dを6）δ= 7.97（D、1H、J = 8.7 Hz）と、7.94（BS、1H）、7.42- 7.30（M、5H）、5.05（S、2H）、4.67 （DDD、1H、J = 8.7、5.4、2.7ヘルツ）、3.40（トン、1H、J = 5.4 Hzで、）、3.09（ddの、1H、J = 5.4、2.7ヘルツ）。
    4. [（S）-2-オキソアゼチジン-3-イル] -アンモニウムアセテートの調製。
      1. 酢酸エチル245 ml中酢酸0.93 mlで溶解します。マークこれは、「トラッピングソリューションです。」
      2. エタノール298 ml中[（R）-2-オキソアゼチジン-3-イル]カルバミン酸tert-ブチル-ベンジルN 3.28gのを溶かします。
      3. シクロヘキサジエンの14.1ミリリットルと10％パラジウム炭素の3.27グラムを追加します。
      4. 12時間室温でサスペンションを撹拌し、次いでケイソウ土の短いパッドを通して濾過しました。捕獲溶液に直接溶出液を注ぎます。
      5. 35℃以下の温度を維持しながら、減圧下（回転蒸発器）下で溶媒を蒸発させます。
      6. テトラヒドロフランで得られた固体をトリチュレートし、白色固体1.72 gを得ました。
        1 H NMR（400 MHzの、DMSO-dの6）δ= 7.68（BS、1H）、3.99（dddの、1H、J = 5.2、2.4、1.2ヘルツ）、3.32（トン、1H、J = 5.2 Hz）で、2.79 （DD、1H、J = 5.2、2.4ヘルツ）、1.90（S、3H）。
  3. 調製ウンデカ-10- ynyl- N - [（3 S）-2-オキソアゼチジン-3-イル]カルバメート
    1. 10 mLの丸底フラスコに、乾燥ジクロロメタン2ml中の[（3 S）-2-オキソアゼチジン-3-イル]酢酸アンモニウムの60ミリグラムを溶解します。
    2. 氷浴中で0℃に溶液を冷却し、Nの81μLを、N-ジイソプロピルエチルアミン滴ずつ加えます。
    3. 、乾燥ジクロロメタン2mlにウンデカ10イニル2-オキソピリジン-1-カルボキシレートを含む粗混合物350mgのを溶かした溶液にそれを追加し、15時間室温で攪拌します。減圧下（回転蒸発器）下で乾燥するまで溶剤を蒸発させます。
    4. 自動化されたカラムクロマトグラフィー装置を使用して、カラムクロマトグラフィー（シリカゲル）で精製：
      1. 、シリカゲル上にサンプルを吸収シクロヘキサンでカラムを平衡化し、カートリッジにサンプルをロードします。
      2. 0：0：100からシクロヘキサン/酢酸エチルで溶出100および試験管にピークを集めます。
      3. 減圧下（回転蒸発器）下で乾燥し、白色固体の40 mgを得た化合物に対応する画分の溶媒を蒸発させます。

CC試薬の調製

  1. タグアジド分子の5 mMのストック溶液の調製
    1. ジメチルスルホキシド（DMSO）のアジドPEG3-フルーア545 0.5でミリリットルの1.5ミリグラムを溶解させます。 -20℃で0.5 mlマイクロチューブ中のアリコートとストアを行います。
    2. DMSO 0.5mlにアジドPEG3ビオチンの1.1ミリグラムを溶解させます。 -20℃で0.5 mlマイクロチューブ中のアリコートとストアを行います。
  2. トリス（2-カルボキシエチル）ホスフィン（TCEP）の50mMのストック溶液の調製
    1. 水1ml中TCEPの14.3ミリグラムを溶解し、そして新鮮なたびにそれを作ります。
  3. CuSO 4の50 mMの溶液の調製・5H 2 O
    1. ガラスバイアル中、12を溶解水1ml中のCuSO 4・5H 2 Oの0.48ミリグラム。までの1ヶ月間室温で保管してください。
  4. トリス83.5 mMのストック溶液の調製（1-ベンジル-1H-1,2,3-トリアゾール-4-イル）メチル]アミン（TBTA）
    1. ガラスバイアルでは、DMSO200μlにTBTAの8.85ミリグラムを溶解します。までの1ヶ月間室温で保管してください。
  5. （使用直前に）TBTAの1.7mMの作業溶液の調製
    1. ガラスバイアルに83.5 mMのTBTAの20μlを添加して、DMSOの180ミリリットルで希釈します。
    2. ターシャリーブタノールと渦の800μLを加えます。

CFA-処置されたラットの足組織における3 NAAA発現解析

注：175〜200グラムの重量を量る、雄性Sprague-Dawleyラットを使用し、動物の倫理的な使用のためのガイドラインに従って、すべての手順を実行します。ハウス、12時間の明/暗サイクル上の換気ケージのラットに、彼らに食料と水を自由に与えます。 CFのプロトコルの場合治療は、7日CFA投与後Bonezzi ら 29使用動物によって掲載された記事を参照してください。

  1. ARN14686の静脈内投与
    1. 車両におけるARN14686（15％PEGおよび15％のトゥイーン食塩水）を溶解します。ラットの体重（投与量は3mg / kgであり、注入量5ミリリットル/キログラム）に応じて溶液濃度を計算します。
    2. 3ナイーブと3 CFA処置ラットにおける静脈内注射を続行します。適切なプラスチック製の拘束装置に各ラットを置きます。その後、血管拡張を可能にするために2-4分間温水でラットの尾を置き、尾静脈を介して化合物IVを注入。
    3. ビヒクルのみで3匹のラット（ナイーブおよびCFA-処理したもの）を静脈注射します。
  2. ポウコレクションと解剖
    1. プローブまたは車両投与後にCO 2吸入4時間によってラットを犠牲にし、メスを用いて0.5センチメートル膝関節の上にそれらを切断することによって、彼らの足を集めます。
    2. 慎重にはさみ補助切開によって皮膚を除去し、骨からそれらをこすることによって軟組織を解剖します。骨を捨て、足の軟組織を収集します。 -80℃で液体窒素とストア内のスナップ凍結サンプル。
  3. ポウ均質化とライソゾームタンパク質調製
    注：彼らはCCの反応を阻害することができるように、界面活性剤およびアミン含有緩衝液を使用しないでください。
    1. （ 材料/試薬の表を参照）足組織は3匹のラット（セクション3.2.1で説明したように得た）から結合してリン酸緩衝生理食塩水（PBS、pH7.4）中320 mMのスクロースおよびプロテアーゼ阻害剤カクテル4mlにそれらをホモジナイズ。高性能な分散器を使用（ 素材/試薬の表を参照されたいです）。
    2. 4℃で千×gで20分間、組織ホモジネートを遠心。上清を保存します。
    3. 組織ペレットに2 PBS中の320 mMのスクロースmlのプロテ​​アーゼ阻害剤カクテルを追加し、もう一度均質化します。
    4. 4℃で千×gで20分間遠心分離し、ステップ3.3.2から1に上清を追加します。
    5. 4℃で12,000×gで30分間回収した上清を遠心します。
    6. PBSの2容量でペレットを再懸濁を計量（ すなわち、ペレットの各100 mgのために200μl）。 1.5ミリリットルのコレクションチューブに移し、1時間-80℃で凍結します。
    7. サンプルを解凍し、-80℃で1時間、再び凍結します。
    8. 凍結/解凍サイクルをさらに2回繰り返します。
      注：このステップは、タンパク質を可溶化することを意図しています。必要に応じて、一晩凍結。
    9. 4°C 10万×gで1時間遠心分離します。可溶性のリソソームタンパク質を含んでいる上清を、収集し、ペレットを捨てます。 -80℃で保存したり、すぐにタンパク質定量を進めます。
    10. BCAタンパク質アッセイ30市販のキットを用いて、タンパク質含有量を定量化する（参照素材/試薬表 ）、製造元の指示に従います。
    11. 使用するまで-80℃でサンプルを保管してください。
  4. アジドPEG3ビオチンとCC
    注：CCおよびストレプトアビジンビーズ濃縮（3.4から3.6ステップ）のプロトコルは、わずかSpeersとCravatt 31によって公開されたプロトコルから変更されています。
    1. プローブ - 車両処置ラット（ナイーブおよびCFAで処置したラット）からリソソームタンパク質を500μl（PBS中1mg / mlのを、）を準備します。
    2. ストレプトアビジンアガロースの50％スラリーの40μlを有するプリ・クリアーサンプルを4℃で1時間（使用前にPBS 1mlで3回洗浄します）。 4℃で千×gで4分間遠心分離し、上澄みを取ります。
    3. アジドPEG3ビオチンと渦の5 mMストックの11.3μlを添加します。
    4. 新たに調製したTCEPおよび渦の50 mMストックの11.3μlを添加します。
    5. 50 mMの硫酸銅の11.3μlの1.7 mMのTBTAの新たに調製したワーキング溶液のプレミックス34μlの・5H 2 Oの株式。
    6. 予混合TBTA /のCuSO 4・5H 2 O溶液と渦の45.3ミリリットルを追加します。
    7. 2時間25℃で反応をインキュベート（長いインキュベーション時間は、反応に影響を与えません）。この段階で、タンパク質の沈殿を観察します。インキュベーションの最初の一時間後に混ぜます。
  5. 過剰CC試薬の除去
    1. 4℃で6500×gで4分間遠心分離サンプル、上清を除去します。
    2. 超音波処理（プローブ超音波処理器で5秒）により冷メタノール再懸濁750μlのを追加します。
    3. 4℃、6500×gで4分間のサンプルを遠心分離し、注射器と針を用いて上清を除去します。
    4. （超音波処理が必要とされない）を2回繰り返し手順3.5.2。
    5. 最後の洗浄後、タンパク質ペレットと5秒間超音波処理3倍にPBSでドデシル硫酸ナトリウム（SDS）2.5％の325μlを添加します。
    6. 65℃で5分間サンプルを加熱し、超音波処理利得。
    7. 室温で6500×gで5分間遠心し、上清を保存します。
    8. 0.5％にSDSの濃度を希釈するためにPBSの1.4ミリリットルを追加します。 -20℃で保存またはストレプトアビジン濃縮を続けます。
  6. ストレプトアビジン濃縮
    1. PBSで、4.2ミリリットルにステップ3.5.8で得られた試​​料の体積をもたらします。 （使用前に1mlのPBSで3回洗浄）カットエンドチップを用いて、ストレプトアビジンアガロースの50％スラリー40μLを加えます。
    2. 回転させながら室温で2時間インキュベートした後、1400×gで2分間遠心します。
    3. ビーズペレットを乾燥させずに上清を除去し、（ 素材/試薬表を参照してください）1ミリリットルスピンカラムにビーズを転送するために、残留上清を使用しています。
    4. 、（PBS中）1％SDSの3×1mlで重力によって（PBS中）6 M尿素の3倍1ミリリットル、およびPBSの4倍の1ミリリットルを洗います。
    5. PBSの使用2回500μlを室温で1400×gで2分間、1.5mlチューブと遠心分離機にビーズを転送します。ゆっくり注射器と針で上清を吸引除去します。
    6. 95°C 32で15分間、続いて室温で15分間、溶出緩衝液の25μlの（6 M尿素、2 Mチオ尿素、2％SDS、6 mMのビオチン、すべてのPBS中）を添加して、樹脂に結合したタンパク質を溶出させます。
  7. タンパク質ブロット
    1. （：9ミリリットルまで0.5ミリリットルの1MのTris-HClのpH 6.8、5ミリリットル20％のSDS、5 mgのブロモフェノールブルー、3ミリリットルグリセロール、およびH 2 Oを9ミリリットル用）および追加6X Laemmli緩衝液の5μLを追加使用直前にβメルカプトエタノール5％。簡単に言えば4〜12％ポリアクリルアミドゲルに得られた上清の樹脂と負荷を25μlをペレット化するために2000×gでサンプルを遠心します。
    2. 製造元の指示33に従ってブロッティング膜上のゲル電気泳動およびタンパク質の転送を行います。
    3. ブロッキング緩衝液10mlで1時間ブロッティング膜を飽和0.1％のTween-20を含有する（ 材料/試薬の表を参照のこと ）。それはバックグラウンドを増加させることができるように、牛乳を使用しないでください。
    4. RTで1時間バッファー+ 0.1％のTween-20を遮断する10ミリリットルに溶解（ 素材/試薬の表を参照されたい）PBS中の0.05％のTween-20 10mlでメンブレンを洗浄し、蛍光ストレプトアビジンの10μlを添加します。
    5. PBS単独（10分毎）で1回、PBS中0.05％Tween-20で4回洗浄し、。
    6. （ 素材/試薬の表を参照されたい）イメージスキャナを使用してください。楽器と接続されたコンピュータのスイッチをオンにします。準備ができるまで待ちます。
    7. 取得プログラムを起動し、蛍光モードを選択します。膜面積を選択し、保存されたファイルの保存先フォルダを選択します。
    8. 次の取得パラメータを設定します：680nmの励起長、BPFR700フィルタ、千V光電子増倍管（PMT）の値（チャンネル2）、および25ミクロンのピクセルサイズ。画像を取得します。

蛍光ミクロスによるマウス肺における触媒活性NAAAの4ローカライズコピー

注：使用して男性の8〜10週齢のマウスや動物の倫理的な使用のためのガイドラインに従って、すべての手順を実行します。ハウス12時間の明/暗サイクル上の換気ケージのマウスと彼らに食料と水を自由に与えます。

  1. マウスにおけるARN14686の静脈内投与
    1. 車両にARN14686を溶解：15％PEGおよび15％のTween-20食塩水。マウス体重（投与量は3mg / kgであり、注入量5ミリリットル/キログラム）に応じて溶液濃度を計算します。
    2. 3匹のマウスの静脈注射を続行します。適切なプラスチック製の拘束装置に各マウスを置きます。その後、血管拡張を可能にし、尾静脈を介して化合物IVを注入するために2-4分間温水にマウス尾を置きます。
    3. ビヒクルのみで3匹のマウス静脈注入します。
  2. 肺コレクションとスライスの準備
    警告：ヒュームフードに注意してパラホルムアルデヒドを持ち、手袋を着用！
    1. chloでマウスを麻酔RAL水和物（400 mgの/キログラム）。つま先のピンチで麻酔を確認してください。次のようにtranscardial灌流を実行します。
      1. 表面的にハサミで腹側皮膚をカットし、胸部および腹膜表面を露出させます。
      2. 表面的だけで剣状突起の下に、はさみで腹膜をカットし、ダイヤフラムと内臓を露出させます。いずれかの重要な血管系を引き裂くしないように注意してください。
      3. もう一方の外側面から振動板を切断して胸腔を開きます。
      4. 自動化されたシリンジポンプに接続された25 G針を挿入し、リン酸緩衝液（0.1M、pH7.4）中の4％PFAを60ml、続いて0.9％食塩溶液20mlを注入します。
    2. 潅流が完了したら、鉗子を用いて心臓を引き、慎重にそれを解剖します。鉗子で気管をつかみ、ハサミを使用して、それを介して完全に切断。そっと上向きに気管を引っ張ると胸郭から肺を除去します。に組織を解剖左から右肺を分離します。
    3. Postfixは冷2-メチルブタン中で1時間、凍結サンプルの4％パラホルムアルデヒド中で組織し、-80℃で保管してください。
    4. クライオスタットを用いて、40μmのセクションを収集し、スライド上にすぐにそれらをマウント（1五回ごと）、および以下に詳述するように、免疫組織化学のためにそれらを処理します。
  3. 組織スライス透過処理し、ブロッキング
    1. PBS（5分間2回）で洗浄し、室温で15分間、0.1％トリトンX-100 PBSで透過性。
    2. PBS（5分間2回）で洗浄し、室温で30分間、PBS中の3％ウシ血清アルブミン（BSA）でブロックします。
    3. PBS（5分間2x）で洗浄し、CCを続行します。
  4. 組織切片上のアジドPEG3-フルーア545とCC
    1. 1ミリリットルの溶液については、セクション2に記載のように調製CC試薬を混合して溶液を調製し、追加：アジドPEG3-フルーア545（5 mMストック）の2μlを、TCEP20μlの（新たに調製した50ミリモルのSTOCをk）は、TBTAの58.8μlのワーキング溶液（新たに調製した1.7 mM）の、のCuSO 4の20μlの・5H 2 O（50 mMストック）、およびPBS900μlの。
    2. セクション4.2に従って調製した組織切片にCCミックスの約400μLを加えます。 CCミックスの選択されたボリュームはスライスをカバーするのに十分であることを注意してください。光から保護し、室温で1時間インキュベートします。
    3. PBS（5分間×）、冷メタノール（5分間×）、PBS中の1％のTween-20および0.5mM EDTA（2分間3回）の溶液、及びPBS（5分間1×）で洗浄します。
    4. 空気乾燥は、カバースリップ（気泡形成を回避する）と密接DAPIと退色防止封入の低下を（ 素材/試薬表を参照）、追加、およびポリッシュでシールします。分析まで4℃で保存。
  5. 画像収集
    1. 546 nmおよび450 nmの励起レーザを搭載した共焦点顕微鏡を使用して、次の（ 素材/試薬表を参照してください）ユーザーガイド。
    2. 接眼レンズを介してスライドをプレビューし、関心のある領域に集中することを確認して、NA = 1.40で60X対物レンズを選択します。
    3. サンプルおよび機器の機能に応じて収集パラメータを決定します。

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結果

ARN14686はNAAA阻害剤ARN726の足場に基づいて設計されました。 ARN726の4-t-ブチル-シクロヘキシル基は、C9の飽和脂肪族鎖は、末端アルキンタグ（ 図1）を有する基で置換しました。アルキンタグは、フルオロフォアまたはCCを介してビオチン分子を追加するために二段階標識化手順の使用を可能にするために導入されました。この機能は、in vitroおよびin vivoで NAAAを調査するために非常に汎用性の高いツールをARN14686レンダリングします。

ここでは、この分子の潜在的なの代表的なものであるARN14686の二つのアプリケーションを示す。 図2は、ここで報告された実験手順のスキームです。プローブの静脈内投与した後、二つの異なる検出方法を使用することができる：タンパク質ブロットによるアクティブNAAA式のⅰ...

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ディスカッション

酵素活性は、微RNA転写、タンパク質合成、タンパク質の転座、翻訳後修飾、およびタンパク質 - タンパク質相互作用を含む種々のレベルで調節されます。多くの場合、単独の酵素の発現は、その活性を考慮していません。 ABPPは、その天然の状態でタンパク質の活性を研究するために開発されました。二つの機能が必要とされている：共有結合プローブで標識された酵素を検出するために、興味のある酵素の活性部位とレポータータグに結合する化学プローブを。

プローブ設計と合成は、手順の重要なポイントです。プローブは、その標的に対する十分な親和性と選択性を持っている必要があります。また、レポータータグの存在は、目標係に影響を及ぼしてはなりません。この問題は、大部分は、ターゲットが捕捉された後のレポータータグが導入された二段ABPの設計によって克服されます。タグを含まないプローブは、 インビボ研究のために特に適しているタンパク質の活性最小限の外部の変化と、生きた細胞または生物で評価することができます。 NAAAプローブARN14686は、上記で概説した要件を満たすように設計されました。 βラクタム...

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開示事項

著者らは開示するものは何もない。

謝辞

著者は、イタリア、ジェノバのIstituto Italiano di Tecnologiaにあるニコンイメージングセンターに感謝します（イタリア（NIC@IIT。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
1,1'-スルホンニルジイミダゾール シグマAldrich367818有害な
2-ジピリジルカーボネートFluorochem11331
2-メチルブタンシグマAldrichM32631可燃性、有毒、水生環境に有害
4-(ジメチルアミノ)ピリジンシグマAldrich107700
な酢酸シグマAldrich695092可燃性、腐食性
アセトニトリル シグマ アルドリッチ34998可燃性、有毒
な活性炭シグマ アルドリッチ161551
塩化アンモニウムシグマ アルドリッチA9434有害な
アジド-PEG3-ビオチンイエナ・バイオサイエンスCLK-AZ104P4
アジド-PEG3-フルオロ 545イエナ・バイオサイエンスCLK-AZ109
BCA タンパク質アッセイキットサーモフィッシャーサイエンティフィック23227
バイオスピンカラムBiorad732-6204
ビオチンSigma AldrichB4501
ブロッキングバッファーLi-Cor Biosciences927-40000
β-mercaptoethanolSigma AldrichM6250高毒性
ボビン血清アルブミン (BSA)Sigma AldrichA7030
ブロモフェノールブルーSigma AldrichB0126
Bruker Avance III 400Bruker
CeliteSigma Aldrich419931健康被害
セリック硝酸アンモニウム Sigma Aldrich22249性、有害な
クロラール水和物Sigma AldrichC8383高毒性
CuSO4.5H2O シグマ・アルドリッチ209198有毒
シクロヘキサジエンシグマ・アルドリッチ125415可燃性、健康被害
シクロヘキサンシグマ・アルドリッチ34855可燃性、有害、健康被害、環境被害
ジクロロメタンシグマ・アルドリッチ34856有害、健康被害
ジエチルエーテルシグマ・アルドリッチ296082 可燃性、有害な
ジメチルスルホキシド(DMSO)アクロス有機物348441000
ジメチルスルホキシドd6(DMSO-d6)Sigma Aldrich175943
エタノールSigma Aldrich2860可燃性、有害な
酢酸エチルSigma Aldrich34858可燃性、有害な
グリセロールSigma AldrichG5516
Irdye 680-LT StreptavidinLi-Cor Biosciences925-68031
IRDye680-LT Streptavidin Licor925-68031使用前に簡単に遠心分離してタンパク質複合体を沈殿させる
メタノールSigma Aldrich34966高毒性
ノールSigma Aldrich34860可燃性、毒性、健康被害
N-(3-ジメチルアミノプロピル)-N′-エチルカルボジイミド塩酸塩Sigma AldrichE7750有害、腐食性
N,N-ジイソプロピルエチルアミンΣ AldrichD125806可燃性、腐食性、毒性
N,N-ジメチルホルムアミドSigma Aldrich227056可燃性、有害、健康被害
N-CBZ-L-SerineFluorochemM03053有害な
ニコン A1 共焦点顕微鏡ニコン取扱説明書を読む
NuPAGE 4-12% Bis-Tris gelサーモフィッシャーサイエンティフィックNP0335BOX
パラジウム・オン・カーボンシグマ・アルドリッチ330108
p-アニシジンシグマ・アルドリッチA88255毒性, 健康被害, 環境ハザード
パラホルムアルデヒドシグマ アルドリッチ441244有毒、呼吸器系有害、腐食性、反証可能な
ポリ(エチレングリコール) Sigma AldrichP3265
ProLong Gold 色あせ防止マウンタント DAPI付き サーモフィッシャーサイエンティフィックP36931泡形成を避ける
プロテアーゼ阻害剤カクテルシグマアルドリッチP8340
重炭酸ナトリウムグマアルドリッチS6014
デシル硫酸ナトリウム(SDS) Sigma AldrichL3771有毒、腐食性、反発性
水素化ナトリウム Sigma Aldrich452912 可燃性
硫酸ナトリウムSigma Aldrich239313
Starion FLA-9000 immage scannerFUJIFILMRead  取扱説明書
ストレプトアビジン アガロースThermo Fisher Scientific20349
ショ糖Sigma AldrichS7903
Tert-butanolSigma Aldrich360538有毒で可燃性の
テトラヒドロフランシグマ アルドリッチ186562可燃性、有害、健康被害
チオ尿素アクロス オーガニック424542500有毒で、50°Cで暖かい。トリスを溶解するC
SigmaAldrich RDD008
トリス(2-カルボキシエチル)ホスフィン(TCEP)Sigma AldrichC4706
トリス[(1-ベンジル-1H-1,2,3-トリアゾール-4-イル)メチル]アミン(TBTA)Sigma Aldrich678937
Triton-x100Sigma AldrichX100Toxic
Tween-20Sigma AldrichP9416
Tween-80Sigma AldrichP1754
Ultra turrax IKA T18 塩基性組織ホモジナイザーIKA
Undec-10-yn-1-olFluorochem13739有害
尿素Sigma AldrichU5378有毒、50°Cで暖かい;Cを溶解する
有害な有毒酸化なメタ気シド

参考文献

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