方法論記事

レポーターマウスを用いたIL-22を発現するリンパ球の可視化

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DOI：

10.3791/54710

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2017年1月25日

 ,  ,  ,  , 
1Laboratory of Molecular Immunoregulation, Cancer and Inflammation Program, Center for Cancer Research, National Cancer Institute, National Institutes of Health

この記事について

サマリー

ここでは、異なるマウス組織内のIL-22産生細胞を可視化するためのトランスジェニックレポーターマウスモデルについて説明します。この方法は、マウス内の他のサイトカインまたは分泌タンパク質の位置を追跡するために使用できます。

要約

レポーターマウスを広く標的遺伝子の発現の局在を観察するために使用されています。このプロトコルは、新しいトランスジェニックレポーターマウスモデルを確立するための戦略に焦点を当てています。我々は、このサイトカインが炎症によって損傷を受けた組織を修復するために寄与する腸における重要な活性を有するので、インターロイキン（IL）22遺伝子の発現を可視化することを選択しました。レポーター系は、 インビボの製品を特定する他の方法に比べてかなりの利点を提供します。 IL-22の場合には、他の研究は、最初の組織から細胞を単離した、その後、インビトロで細胞を再刺激しました。 IL-22、通常は分泌され、薬剤を使用して細胞内に閉じ込められた、そして細胞内染色は、それを視覚化するために使用されました。この方法は、IL-22を産生する能力を有する細胞を識別し、それは彼らが、in vivoでそのようにやっていたかどうかを決定するものではありません。レポーターのデザインは、ワシントン州にあるIL-22遺伝子に蛍光タンパク質（tdTomato）の遺伝子を挿入するステップを含みます蛍光タンパク質を分泌することができないため、 生体内での産生細胞の中に閉じ込められたままであることのy。蛍光の生産は、フローサイトメトリーを介して組織切片またはエキソビボ分析によって可視化することができます。レポーターのための実際の建設プロセスは、IL-22遺伝子を含む細菌人工染色体をコンビニアリング含まれています。この操作された染色体は、その後、マウスゲノムに導入しました。恒常的なIL-22レポーターの発現は、フローサイトメトリー分析により、脾臓、胸腺、リンパ節、パイエル板、および腸を含む種々のマウス組織において観察されました。大腸炎は、T細胞（CD4 + CD45RBhigh）転写によって誘導し、そしてレポーター発現を可視化しました。陽性のT細胞は、腸間膜リンパ節内の最初に存在した後、それらは、遠位小腸および結腸組織の固有層内に蓄積しました。 BACを用いた戦略は、IL-22 EXPRESに比べて良好な忠実度のレポーター発現を与えましたシオン、それがノックイン手順よりも簡単です。

概要

レポーター遺伝子の細胞型特異的発現を積極的恒常性と摂動状態の下で組織に標的を発現する細胞を同定するのに有用です。また、そのほかの特性を研究するために、生存したままでこれらの細胞の精製を可能にします。レポーターマウスは、特定のサイトカイン、転写因子、および調節要素の作用機序の解明に利用されています。以前の戦略1、2、3は、主にマウス染色体、時間とコストのかかる手順で標的遺伝子座にレポーターをノッキングに頼ってきました。したがって、レポーターマウスを生成するための簡単な方法が望ましいです。

サイトカインは、細胞間のシグナル伝達を介して免疫応答を調節する小、分泌タンパク質/ペプチドの幅広いクラスです。インターロイキン22（IL-22）障壁のfuを含む多く報告された活動、とサイトカインでありますnction、組織修復、及び炎症4。 IL-22は当初、T細胞の生成物5として発見されたものの、その後のレポートは人間6およびマウス7で先天性リンパ球8の他のクラスにナチュラルキラー（NK）細胞におけるその発現を示しました。 IL-22産生細胞の広範囲観察にもかかわらず、IL-22の可視化は、以前に抗体を用いた汚れにex vivoで刺激し、透過処理を必要としました。そのため、新規のIL-22レポーターマウスは、恒常性と発病過程におけるIL-22の機能を調べるために非常に有用なツールになります。

ここでは、in vivoおよびin vitroで IL-22産生細胞を観察するために簡略化されたトランスジェニックレポーターマウスモデルを開発しました。 BACのコンビニアリング法9を使用して、我々は、IL-22 LOCにポリ信号断片とtdTomato cDNA配列を挿入しました私たちと私たちはできるだけIL-22の自然調節を模倣したいと思いますので、他の非翻訳領域、エクソン、および調節要素は、乱されていなかったエクソン1を取り替えました。レポーターの挿入部位を急速に分泌されるIL-22自体とは異なり、生細胞内部のレポーターの蓄積をもたらす、シグナル配列を破壊します。この新しい方法はまた、他の分泌タンパク質のためのレポーターマウスの作製に適用することができます。

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プロトコル

全ての動物は、癌研究のためのフレデリック国立研究所の実験動物委員会の管理と使用に関する2011ガイドに記載の実験手順に従い、適切なケアを受けました。

BAC遺伝子改変によるIL-22-tdTomatoレポーターマウスの1世代

注：マウスは無意識であるべきであり、有害な刺激に応答して移動しません。 70％エタノールで手術領域を滅菌し、ガラスビーズ滅菌器を使用して、すべての手術器具を滅菌します。

  1. アルカリ抽出法10、11を用いて、BAC DNA（RP23-401E11、クローン長228391 BPS）を精製します。標的遺伝子の正確なサイズを確認するためにRP23-401E115μgのののSpeI消化によりBACクローンを特徴づけます。注：BAC DNAは14の断片に消化しました。
  2. PLD53SC-A-GFP-BシャトルベクターのNot Iで/ SalI部位にTdTomatoレポーター遺伝子を挿入11と同じサイト内のGFP遺伝子を交換してください。その後、PCR（95℃、2分によるIL-22（エクソン1）の最初の翻訳エクソンに相同ボックス（AとB）を増幅、テンプレートとしてBAC RP23-401E11を使用して、30のために95°Cの30サイクル秒、30秒、55℃、および72℃30秒間、および10分間72℃での最終伸長）。 50μlのPCR反応系では、BAC DNA 50ngの（1μl）を、プライマー0.5μlの（10μM）、PCRスーパーミックス高忠実度の40μlの、およびH 2 Oの8μlを添加します
    5'- T GGCGCGCC GGAGCTGTGAAGAAAGとリバース：フォワードボックス：注：次のようにAとBの箱のためのプライマーは、5 'CAGAGATCGCACAAGTGTCAACを。 Bボックスフォワード：5'-G TTAATTAA CTGCCCGTCAACAとリバース：5'-T GGCCGGCC TGAGCACCTGCTT CATC 10。制限酵素（ASC IとのPac I）の部位には下線が付されています。
  3. Asc I消化Aの500 ngのとのPac I消化B fragm 500ngのを連結1時間16℃でPLD53SC-ATB（tdTomato）ベクター50ngのにエント。
  4. 37℃でクロラムフェニコール（20μg/ ml）およびアンピシリン（30μgの/ ml）で寒天プレートルリア-ベルターニ（LB）にBAC-コンピテント細胞に11や文化、それらを精製したPLD53SC-ATBベクトルを変換します。 Chの/アンプのマスタープレートから共同統合の2〜3個のコロニーを選択してください。
  5. 20μg/ mlのクロラムフェニコールを補充したLBの1ミリリットル中に各コロニーを植菌し、37℃で1時間および225 rpmのためにそれらをインキュベートします。 LB寒天プレート上に各混合液100μlを広げる（ペプトン140を10g、酵母エキス、寒天12 gであり、水1Lを5g、pH7.5）にクロラムフェニコールおよびスクロースの4〜4.5％の補充。 37℃で一晩培養をインキュベートします。
  6. 大小両方のコロニーを選択し、クロラムフェニコールを2 LB寒天プレート上にreplate。その後、30秒間UV光の有無にかかわらずどちらかのプレートを公開し、さらなる分析のためのUV感受性コロニーを選択。
  7. tdTomato / IL-22ヘテロ接合プライマー（：;：TGT AAT CGG GGA TGT CGG C 5 '5リバースACT TGT GCG ATC TCT GAT GGT'フォワード）を用いたPCRによる修正されたBAC DNAを識別します。次のようにサーモサイクラー条件は、2分間、95°C; 30秒間、30秒間56℃、30秒間72℃、95℃の30サイクル。そして72℃で10分間の最終伸長。
  8. 大プレップBAC DNA 12の直接BAC配列決定によりBACの改質領域のシーケンスを確認してください。
  9. 偽妊娠C57BL / 6（c）マウスにマイクロインジェクション接合体を注入する際に腹腔内に0.25％のトリブロモエタノールの用量でレシピエントマウスを麻酔。
  10. IL-22-tdTomato BACは、反応系100μl中制限endonucleasePi-SceIを5μlので消化することにより（10μgの）を構築し、前核期13でC57BL / 6雌の受精卵に線形化されたBAC DNAを顕微注入する線形化。 SCRE標準的な手順を用いて尾の生検から単離されたDNAのサザンブロット分析により、トランスジェニックマウスアン。

脾臓、胸腺、リンパ節、及びパイエル板から2.単一細胞の準備

注：IL-22-tdTomatoレポーターマウスは、国立癌研究所（NCI、フレデリック、MD）で維持しました。安楽死の方法は、安楽死の最新AVMAガイドラインに準拠しています。すべてのマウスをCO 2吸入14を使用して安楽死させました。

  1. CO 2チャンバー内でIL-22-tdTomatoマウスを安楽死させるときれいなパッドの上に置きます。 70％アルコールを噴霧することにより、腹部の皮膚を殺菌し、開いたそれをカット。左脇腹と胸骨の背後にある胸腺に脾臓を除去します。
  2. mesentericlymphノード（腸間膜組織内）と（小腸の回腸地域全体の小lymphoidnodules）パイエル板を回収するために、真珠のような白い腸間膜はtに近いするノード取ります体の外に全体の小腸および結腸を削除し、最初の細かい点鋸歯状チップを備えた鉗子を分析し、使用して小腸の彼は壁。腸に沿って延びる楕円形のパッチ（パイエル板）を検索し、ハサミでそれらをカット。氷上でPBS緩衝液/ 1％ウシ胎児血清（FBS）中で単一細胞懸濁液に挿入した2つや消しスライド間個別にこれらのリンパ組織（リンパ節およびパイエル板）を挽きます。
  3. ステップ2.2と同様の方法を用いて、脾臓または胸腺組織をみじん切りに。遠心分離機500×gで、4℃で8分間、脾臓サスペンション。細胞ペレットに脾臓あたりのACK溶解緩衝液1mlを追加します。
  4. よく混合し、それらを1分間放置しました。各サンプルに、滅菌リン酸緩衝生理食塩水（PBS）緩衝液9 mlで加えます。赤血球を除去するために500×gで、4℃で8分間の遠心分離によってスピンダウン。
    注：胸腺細胞にACK溶解バッファを追加しないでください。
  5. PBSおよびp 5mlの得られた白血球を再懸濁100μmのセルストレーナーを介して細胞をお尻。 8分間の500×gの遠心分離によって細胞ペレットを収集します。
  6. RPMI培地またはFACS緩衝液5ml中に細胞を再懸濁し、0.4％トリパンブルー染料/ PBS溶液を用いて生存細胞を数えます。

腸からの上皮内リンパ球および固有層細胞の単離3

  1. 右の肛門の上、（近く付録に）回腸、および結腸全体に十二指腸から（次の胃に）、ステップ2.1のように腹部の皮膚を開き、小腸をカット。鉗子を使用して、余分な脂肪と腸間膜組織を削除します。氷冷PBS中ですぐに腸を入れてください。
  2. 小腸の遠位領域に沿ってパイエル板（小、ラフ結節）を探してください。はさみを使って縦に腸andopen鉗子を使用して大衆を削除します。徹底的氷冷PBS 10mlで腸を洗浄します。
  3. プレ消化緩衝液（5mMのEDTA 20mlの組織をインキュベートそしてシェーカーでゆっくり回転（50 rpm）しながら37℃で30分間、ハンクス平衡塩溶液（HBSS））中に1mMジチオスレイトール。 2インキュベーションのそれぞれの後、激しいボルテックス（12,000 rpmで30秒間）によって、上皮内リンパ球（IELs）を含む、上皮細胞層を除去し、100μmのセルストレーナーを介してすべての組織を通過します。
  4. 37℃で30分間の第二のインキュベーションのために組織に新たなEDTA溶液20mlを加えます。 100μmのセルストレーナーを通してIEL画分をパスし、前の画分でそれらをプール。ステップ3.9で扱われることを氷の上に残っている腸の断片を保管してください。
  5. 遠心機で4℃で5分間、800×gでプールIEL画分。 HBSS / 5％FBSの10ミリリットルと共にプールIEL画分を洗浄し、800×gで4℃で5分間、それらをスピンダウン。
  6. 44％のコロイダルシリカ媒体15 8mlに細胞を再懸濁し、67％のコロイダルシリカ培地5mlでそれらを重ねます。遠心分離機44％/ 67室温と1500×gで20分間、0.5パーセントの細胞混合傾斜。
  7. 界面でのバンドからIEL細胞を収集します。まず、1ミリリットルピペットを用いて上清（約5ml）の最上層を除去します。次に、コロイダルシリカ媒体勾配の間期で収穫IELs。
  8. RPMI培地10mlを加えることによって、IEL​​sを洗ってください。 800×gで、4℃で5分間、細胞をスピンダウン。ステップ3.15のためにRPMI 5mlのIELsを再懸濁します。
  9. 固有層リンパ球（LPLs）の単離のために、はさみを使用して小片（1ミリメートル）にステップ3.4から腸組織断片をミンチし、消化緩衝液の10ミリリットル（コラゲナーゼの0.05グラム、DNアーゼIの0.05グラムと作品ダイジェスト37℃で15〜20分間、RPMI / 5％FBS中でディスパーゼII）を0.3g。
  10. 70μmのセルストレーナーを通して混合物を濾過。フロースルー上清を解放LPLが含まれています。
  11. 完全に（通常は、彼らがしなければならない手順3.9から3.10を繰り返すことによって、腸の断片を消化）を3回繰り返しました。たびに、LPLsを含む上清をプール。
  12. 1,500×gで、室温で5分間の遠心分離によって細胞を収集し、RPMI / 5％FBS中でペレットを再懸濁します。 40μmのセルストレーナーを介してそれらを渡します。
  13. 40:80コロイダルシリカ媒体勾配の40％画分10mlに細胞ペレットを再懸濁し、15mlチューブ中の80％の画分5mlの上に重ねます。
  14. 1500×gで20分間の遠心分離により密度勾配分離し、室温15を実行します 。
  15. ステップ3.7で説明したように、LPLsを収集します。 10mlのPBSで一回、それらを洗浄し、PBS / 1％FBSバッファまたはRPMI培地1ml中にペレットを再懸濁します。
  16. 0.4％トリパンブルー色素/ PBS溶液を用いて、生細胞（IELsとLPLs両方）をカウントします。

大腸炎におけるIL-22-tdTomatoの4式

  1. <1×10の濃度でIL-22-TdTomatoマウスから単脾臓細胞懸濁液を準備しますステップ2.1から2.4に記載されているように、滅菌PBS中のsup> 7細胞/ mlで、。
  2. マウスCD4細胞陰性単離法10を用いて、CD4 + T細胞を精製します。 、抗CD4-APC（クローンRM4-5、PBS / 1％FBSバッファー中の0.5μL/ 1×10 6細胞）および抗CD45RB-FITC（クローン16Aにラベルを付け、PBS中0.5μL/ 1×10 6個の細胞30分間4℃でインキュベートすることにより/ 1％FBSバッファ）。
  3. 500×gで、4℃で5分間、細胞をスピンダウン。 PBS / 1％FBS緩衝液2mlで細胞を洗浄し、PBS / 1％FBS染色緩衝液1mlで再懸濁。
  4. マシン16、フローサイトメトリーで標識されたT細胞を実行します。ゲートT細胞集団上のセルとソートCD4 + CD45RB 高の二重陽性細胞（488 nmおよび633 nmのレーザーで検出波長）。
  5. 500×gで5分間、4℃の遠心分離により選別された細胞を収穫。 1×10 6で無菌PBS緩衝液中で細胞ペレットを再懸濁細胞/ ml。 - / -レシピエントマウスRAG1 ofeach腹膜への細胞（0.5×10 6）を注入します。
  6. 種々の時点でCO 2下、レシピエントマウスを生け贄に捧げます。ステップ2.1および2.2に記載したように、腸間膜リンパ節および小腸および大腸を収穫。各腸間膜リンパ節を入れ、カットオープン腸（紙/腸/紙サンドイッチ）4％パラホルムアルデヒド中で（PFA;ヒュームフードの下で扱う）組織を固定する一夜。 16-24時間、18％スクロースをPFAを交換した後、切片のための組織を凍結します。
  7. 組織17、18、19をカットするクライオスタットのマシンを使用してください。約60分間室温に組織切片を温め、室温で10分間アセトン中にそれらを置きます。約5分間、室温でそれらを乾燥させます。
  8. 過剰にFBSを追加ピペットでそれを削除し、1の抗RFPを追加します。0.1％BSA / 1×Pで200希釈BS。 37℃で60分間抗体をインキュベートします。
  9. 室温で30分間、1％BSA / 1×PBS中で300：10分間、1×PBSで切片を洗浄し、組織に対応する二次抗体（ヤギ抗ウサギ568）を適用し、1に希釈しました。
  10. 10分間、1×PBS中でスライドを洗浄し、乾燥し、それらを拭いて、カバースリップを追加します。
  11. 40Xの対物レンズを使用して：一貫性の照明下での蛍光顕微鏡（励起フィルター540から580 nmのRFP）を持つすべてのサンプルを視覚化します。

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結果

マウスIL-22レポーター導入遺伝子は、IL-22遺伝子座を保有する細菌人工染色体を変更するには、コンビニアリングを使用して作成されました。 図1は、sacBII遺伝子を含むpBACe3.6ベクター、ポジティブ選択マーカー、およびクロラムフェニコール抗生物質耐性遺伝子11の図を示しています。 図2に示すように、エクソン1にtdTomatoを導入した後、シグナルペプチド配列は、破壊されました。したがって、tdTomatoの記者は、フローサイトメトリーによってそれらの検出および単離を可能にする、IL-22発現細胞の中に閉じ込められました。ホモ接合マウスは、創始系統から繁殖させ、PCRによってスクリーニングし、通常のノックイン戦略に必要とされるように、彼らは、遺伝的同一性を持つ子孫を達成するために、戻し交配を必要としませんでしたしました。 IL-22レポーターの忠実度をテストするために、in vitroで -generated脾...

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ディスカッション

IL-22は、先天性宿主防御と組織リモデリングに重要な役割を果たしています。 IL-22産生細胞は、細胞内染色によってエキソビボで同定されています。しかし、それはまだ正常な状態または炎症状態のいずれかで、 その場での IL-22の発現を追跡することが困難なままです。このプロトコルは、 生体内でのレポーター発現細胞を局在化することを可能にIL-22レポーターマウスモデルを開発するための新規な方法を説明します。 TdTomatoをコードするレポーター遺伝子は、シグナル配列を破壊部位でIL-22遺伝子座に挿入しました。レポーターにおけるこの戦略の結果は、産生細胞の可視化を可能にする、IL-22急速に分泌されるとは異なり、生細胞内に捕捉されます。操作されたIL-22-レポーターは、このように、調節エレメントを保存するIL-22のそれに対応するレポーターの発現の忠実度を付与することを目的として、大規模なBACの中に含まれていました。トランスジェニックメートルの腸組織氷は、小腸の粘膜固有層にCD4 T細胞および先天性リンパ球恒常性レポーター発現を示しました。誘導性大腸炎では、CD4 T細胞は、...

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開示事項

著者らは開示するものは何もない。

謝辞

動物の技術支援を提供してくださったKelli CzarraさんとMegan Karwanさん、フローサイトメトリーの支援を提供してくださったKathleen NoerさんとRoberta Matthaiさん、病理解析を提供してくださったDonna ButcherさんとMiriam R. Anverさんに感謝します。このプロジェクトは、Ely and Edythe Broad Foundation(Scott Durum)からの助成金によって支援され、契約番号の下で、国立衛生研究所の国立がん研究所からの連邦資金で全体的または部分的に資金提供されています。HHSN261200800001E (MRA)。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
RP23-401E11 BACサーモフィッシャーサイエンティフィックRPCI23。Cニード遺伝子ID:50929
NucleoBond BAC 100Takara Clontech740579
PCR SuperMix High FidelityThermo Fisher Scientific10790020
PI-SceINew England BiolabsR0696S
SpeINew England BiolabsR0133S
LB BrothThermo Fisher Scientific10855-0011 L: 10 g SELECT Peptone 140, 5 g SELECT 酵母エキス, 5 g 塩化ナトリウム 
抗マウスCD3eBioscience11-0031
抗マウスCD4eBioscience17-0041
抗マウスCD45サーモフィッシャーサイエンティフィックMCD4530
抗マウスCD45RBeBioscience11-0455
抗マウスRFPAbcam Ab62341
HBSS、カルシウム、マグネシウム、フェノールレッドなし サーモフィッシャーサイエンティフィック14175145KCl、KH2PO4、Na2HPO4、NaHCO3、NaCl、D-グルコース
Dnase IRoche10104159001
ACK lysing bufferThermo Fisher ScientificA1049201
PercollGE healthcare life sciences17-0891-01
コラゲナーゼ Dロシュ11088858001
ディスパーゼ II (中性プロテアーゼ、グレード II)ロシュ4942078001
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参考文献

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IL 22BACTCD4tdTomato

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