犬の動脈と静脈からの初代内皮細胞の単離および培養

サマリー

血管からの一次内皮細胞の新規分離方法が必要です。このプロトコルは、目的の血管を完全に反転させ、内皮側のみを酵素消化にさらす新しい技術を説明しています。得られた純粋な内皮細胞培養は、心血管疾患、疾患モデリング、および血管新生の研究に使用できます。

要約

心血管疾患は、人間と獣医学の両方で研究されています。内皮細胞は、血管新生、(腫瘍)血管新生、およびアテローム性動脈硬化症を研究するためのin vitroモデルとして広く使用されています。ヒト内皮細胞(EC)のin vitro研究の現在の標準は、ヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)およびヒト臍帯動脈内皮細胞(HUAEC)の使用です。イヌの内皮研究では、イヌの大動脈内皮に由来する細胞株(CnAOEC)が1つだけ利用可能です。現在完全には理解されていませんが、動脈と静脈のいずれかに由来するECには違いがあります。ECのin vitro機能性研究へのより直接的なアプローチとして、さまざまな血管からイヌ初代内皮細胞(CaPEC)を単離する新しい方法について説明します。この技術は、線維芽細胞や平滑筋細胞などの急速に増殖する細胞による汚染の可能性を低減しますが、これは、酵素溶液で血管を洗い流したり、すべての細胞を含む組織の消化前に血管をミンチしたりするなどの標準的な単離方法で一般的な問題です。ここで説明する手法は、イヌのモデル用に最適化されていますが、人間などの他の種でも簡単に利用できます。

概要

イヌは、心血管疾患の研究のための大型動物モデルとして使用され、また先天性（遺伝的）血管異常^1,2苦しむことができる。商業内皮細胞株は、しばしば、内皮細胞（EC）の機能を評価するために使用されるこれらの疾患を研究します。犬のための犬の大動脈由来（CnAOEC）利用可能な1の市販の内皮細胞株は、そこにあります。この細胞株は、主制御通常のEC ^3-5として研究に使用されています。人間の心血管研究では、最も一般的に使用される内皮細胞株は、ヒト臍帯静脈内皮細胞（HUVEC）およびヒト臍帯動脈内皮細胞（HUAECs）は、それぞれ、ヒト臍帯静脈と動脈由来。 HUVECを、1980 ⁶以降血管研究の黄金の標準として使用されてきました。これらは、内皮機能および疾患の適応を研究するための古典的なモデル系であると考えられます。異なる血管から単離された内皮細胞は、appearancで変化します遺伝的背景と微小環境⁷への曝露に起因する電子と機能。また、HUVECをとHUAECsは、臍帯からの条件に関して完全に模倣大人の血管が、彼らはにし、病気への応答さらされていない可能性があり、発達血管構造を導出しています。したがって、一般的には、心血管疾患にHUVECを中に見出された結果とHUAECsを翻訳することは不適切です。

大人ECの適応と行動を研究すると、関心の容器からの一次のECは、より直接的なアプローチとして使用され....

プロトコル

倫理の声明：本研究で用いた血管は、新鮮な犬の死体から得た余剰材料として回収した（n = 4）は他の無関係の研究（大学3R政策）のために安楽死させ、健康な犬から。異常な血管（内および肝外門脈体循環シャント、n = 1のそれぞれ）は、ユトレヒト大学のコンパニオンアニマルのための大学クリニックに提示犬から所有者のインフォームドコンセント後の死後に採取しました。

1.単離および培養初代イヌ内皮細胞の

1. 2ミリリットル/ウェルの0.5％重量/容量ゼラチンとでプレコート6ウェルプレートを37℃で5％CO ₂の加湿雰囲気でインキュベーター中で2時間放置します。前の一次細胞を播種し、過剰なゼラチン溶液を除去します。
2. 無菌的に新鮮な犬の死体（ 図1A）から関心の血管（複数可）（ 例えば、大動脈、大静脈、静脈門脈）を取り外します。血管系の解剖学を維持興味のある容器の両端にストレートピンセットを置くことによって。内皮細胞の損傷を防止するために鉗子で組織の不必要な操作を避けてください。
   1. 手術用ハサミで両端にクランプされた容器をカットし、死体から取り外します。氷上のハンクス平衡塩溶液（HBSS）で輸送。
      注：約5cmの血管の長さは、この手順のために好ましいが、1cmに測定するものはまた、培養に十分な細胞を提供します。
3. 氷冷HB....

結果

別の血管が正常に記載の単離プロトコール（ 図2）に供しました。解剖や健康犬の大動脈、大静脈、静脈門脈、及び冠動脈反転することが可能であった（それぞれのイヌからの全ての船舶を、N = 4）。同じアプローチのECは2先天性門脈体循環シャント（肝外と肝内、n = 1のそれぞれ）から単離したと。大動脈を容易に反転されたが、胸部大動脈セグメントは、腹部大動脈よりも困難でした。胸部セグメントに大動脈を消化溶液に厳密内皮露出を確実にするために個々にライゲーションされる必要があることから分岐する多くの肋間動脈を、有しています。尾部大静脈の解剖セグメントが反転する前にライゲートする必要が腎静脈の分岐点を、含まれています。静脈gastroduodenalisの貢献枝静脈ポータルの血管の反転の前に連結しました。 coronar我々は回旋枝のセグメントを切除し、そこから - （中型犬で直径2mm約1）、イヌにおけるyの動脈は、はるかに小さい血管です。それは小さい直径を有するので、モスキート鉗子をはるかにさらに挿入することができなかったので、1センチかなり短いセグ.......

ディスカッション

イヌのECに焦点を当てた研究ではCnAOECプライマリラインは犬^3、12、13の内皮系統をモデル化するために使用されている。ヒトの研究では、HUVECの文化は、まだゴールドスタンダードと考えられています。明らかに、臍帯由来のECに単に焦点を当てすることは、心血管研究の会社制限があります。内皮細胞は、静脈の仕様を決定する特定の遺伝子の発現パターンを有します。出生後の血管におけるこれらの違いを考慮するために、我々は、内皮細胞の特定の解剖学的位置に基づいて、この新たな分離法を提示します。一般に、一次EC単離するために使用される方法は、両方の非電気部品との汚染の危険性を有する2つの方法を酵素溶液で容器を洗浄するか、消化の前に容器をミンチしています。また、小血管に使用することができ、汚染の少ないチャンスで犬の初代内皮細胞（CaPECs）の単離のための技術を確立しました。この分離メートル内皮細胞のethodは、他のすべての血管細胞型の消化を回避する容器の反転に基づいています。 図1Aに示されるように、内皮細胞培養物の細菌または真菌汚染を防止するために、無菌的に容器を除去することが重要です。細菌.......

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
コラゲナーゼII型	Life Technologies	17101-015
Dispase	Life Technologies	17105-041
DMEM (1x) + GlutaMAX	Life Technologies	31966-021
Hank's Balanced Salt Solution	Life Technologies	14025-050
犬の内皮細胞増殖培地	細胞アプリケーション	Cn211-500
CnAOECs	細胞アプリケーション	Cn304-05
子牛胎児血清(FCS)	GE Healthcare	16000-044
TrypLE Express	Life Technologies	12604-013
SPR	Bio-Rad	170-8898
iScript 合成キット	Bio-Rad	170-8891
SYBR green super mix	Bio-Rad	170-8886
Recovery Cell Freezing Medium	Gibco/Life Technologies	12648-010
冷凍容器、Nalgene Mr. Frosty	Sigma-Aldrich	C1562
Gelatin	Sigma-Aldrich	G1890
手術用ハサミ (メイヨーまたはメッツェンバウム)	B. Braun Medical	BC555R
蚊用鉗子	B. Braun Medical	FB440R
蚊の鉗子が湾曲	B. Braun Medical	FB441R
ポリグラクチン 3-0	Ethicon	VCP311H
Trypan blue	Bio-Rad	145-0013
自動計数チャンバー	Bio-Rad	145-0102
計数スライド、デュアルチャンバー	Bio-Rad	145-0011
マトリゲル	BDバイオサイエンス	BD356231	氷上でゆっくりと解凍
するµ-スライド血管新生	同上	81501
内皮成長培地	ロンザ	CC-3156
EGM-2シングルクォートキット	ロンザ	CC-4176