方法論記事

梗塞エリアの中央動脈閉塞技術と可視化を使用したマウスにおける虚血性脳卒中および虚血 - 再灌流の誘導

DOI：

10.3791/54805

⸱

2017年2月2日

 ,  , 
1Department of Biochemistry and Molecular Biology, Miller School of Medicine, University of Miami, 2Miller School of Medicine, University of Miami, 3Jerzy Kukuczka Academy of Physical Education

この記事について

サマリー

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私たちは、シリコーンコーティング縫合糸を使用して、中大脳動脈の閉塞によって誘発される脳卒中のマウスモデルを記述します。このプロトコルは、永久的な閉塞または一時的な虚血を誘発し、続いて再灌流を誘発するために適用することができます。

要約

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脳血管疾患は、世界の人口に非常に多く存在し、脳卒中を含むいくつかの種類の疾患を包含しています。脳卒中が組織損傷に及ぼす影響を研究し、治療的介入の有効性を評価するために、さまざまな種でいくつかの実験モデルが開発されました。それらには、完全な全体的な脳虚血、不完全な全体的な虚血、限局性脳虚血、および多巣性脳虚血が含まれます。このプロトコルに記載されているモデルは、中大脳動脈閉塞症 (MCAO) に基づいており、限局性虚血のカテゴリに関連しています。この技術は、半球の厳密に定義された領域で一貫した局所虚血を引き起こし、他の方法よりも侵襲性が低くなります。記載されている手順は、いくつかの遺伝的変異が利用可能であり、行動および神経欠損の評価を支援するためにマウス用に標準化された多数のテストを考慮して、マウスで実行されます。

概要

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脳卒中などの心血管疾患の研究では、in vivoでのモデルの使用に依存しています。虚血、薬物毒性、および/または治療の可能な含意を理解するために、治療群間比較試験を可能にする疾患の、適切な標準化され、信頼性、および再現可能なモデルを使用する必要があります。本稿では、我々はトランスジェニックマウスおよび標準化された評価モデルの多数の利用可能性を考えると、マウスを使用しています。実験的虚血性脳卒中と後の回復後の運動や行動障害を評価するためにスコアをかき集め1を開発されている、2。

いくつかの虚血性脳卒中モデルは、このような完全なグローバル脳虚血、不完全なグローバル虚血、多病巣性脳虚血および局所脳虚血として、ご利用いただけます。後者のグループはまた、患者における最も一般的なストロークのカテゴリです。前夜の大多数NTSは、中大脳動脈（MCA）またはその付近塞栓や血栓性閉塞の形成によって開始されます。これらのパラメータが与えられると、密接に提示されたモデルは、人間の脳卒中の疾患の病因を模倣し、関連性の高い3得られた結果になります。それにもかかわらず、ヒトの疾患の治療に動物モデルからの発見の翻訳は、困難であることが判明しました。今までは、血栓組織プラスミノーゲン活性化因子の使用のみが急性虚血性脳卒中

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プロトコル

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すべての手順は、国立衛生研究所（NIH）のガイドラインに従ってマイアミ施設内動物管理使用委員会（IACUC）の大学によって承認されました。滅菌設備及び無菌技術への使用が必要です。

1.閉塞縫合糸の準備します

  1. 25グラムと25の間のマウスのための0.23ミリメートル - - 体重35グラム20の間のマウスのための0.21ミリメートルの直径の縫合糸を使用してください。 MCAO手順のための縫合糸の種類の選択は、動物の体重に依存します。
  2. 銀のペンを使用して、シリコーンコーティングされた先端から始まる9ミリメートルで縫合糸をマーク。これは、挿入長のためのガイドとして機能します。

外科2.準備

  1. 実験室麻酔システムを使用して、酸素と混合イソフルランでマウスを麻酔。商業マシン上で2時5と酸素の流れを設定するにイソフルランを使用してください（ 材料表を参照してください）。 surgerに動物を移しY面とノーズコーンを使用して麻酔を維持する（1.5を設定イソフルランを使用 - 2で2.5と酸素の流れを）。
    1. あえぎなしで毎秒2呼吸 - マウス呼吸数は約1であることを確認してください。また、動物はウィスカの刺激反応とペダル反射（つま先ピンチ）を示さないことを確認してください。手術中の呼吸数と労力、少なくとも5分ごとに監....

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結果

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閉塞縫合糸の挿入経路を図1に示されています。 MCAOの縫合糸は、ICAに分岐、オクルージョン領域にルーティングされます。 MCAの成功閉塞は、TTC染色によって可視、組織損傷につながります。 図2は、偽処置動物（ 図2A）から、60分MCAO虚血再灌流動物（90分または24時間の閉塞後に染色、 図2B）からの染色の画像を提示します。ストローク量を決定するために、最初の対側の総面積から同側の非梗塞面積を減算することにより、イメージング手順に含まれる定規を使用して、各セクションのストローク面積を計算します。この計算は、市販のソフトウェアやオープンソースソフトウェアを使用して行うことができます。その後、スライドは1ミリメートルの厚さであり、foはストローク量を合計することを考慮して各スライスするストローク量を計算すべてのスライスrを。この手順は、異なる動物群と処置との間で比較することができ、各動物の総行程容積を提供します。平均して、60分間の.......

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ディスカッション

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記載MCAO方法の成功した利用は、脳血流の解剖学の理解に大きく依存します。縫合糸の正しい配置が原因で、直接視覚的な手がかりがないために識別することは困難であるので、反復練習は、調査研究のためにそれを使用する前に、手順を習得することが重要です。行程容積は、一貫した結果を保証するために分析されるべきです。レーザードップラーシステムの付加は、血流の正常咬合を決定するために役立つことができ、手順が正しく行われていることを確認するために定期的に使用されるべきです。オクルージョン領域にMCAO縫合ルーティングする動脈を操作することによって容易にすることができます。それだけで、分岐/ダウン左に縫合糸を案内してからそれを防ぐために、鉗子で少し分岐上記ICAに対するプレス（2-3 mm）をECA / ICAを通過した後、MCAに縫合糸を案内するのを助けるために、翼口蓋動脈に入ります。また、ステップ3.3またはPUに配置された枕を移動llingボトムアップ結び目と挿入を容易にするために、動脈を配向させるのに役立ちます右に。プロトコルの残りのステップは、実体顕微鏡下マイクロサージェリーを伴い、非常に簡単です。 90％ - 私達のグループによって得られ、他の人.......

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開示事項

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著者には競合や利益相反はありません。

謝辞

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このモデルを私たちの研究室で最初に確立したLei Chen博士(ニューヨーク州マウントサイナイのアイカーン医科大学)に感謝します。HL126559、DA039576、MH098891、MH63022、MH072567、DA027569、NSC 2015/17/B/NZ7/02985 で一部サポートされています。リュック・バートランド博士は、米国心臓協会(American Heart Association)(16POST31170002)のポスドク研究員によって部分的にサポートされています。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
MCAO縫合糸 0.23 mmDoccol702345PK5Re
MCAO縫合糸 0.21 mmDoccol702145PK5Re
シルバーペンステープル503205
麻酔器Vetequip901806
手術用ハサミファインサイエンスツール14558-09
外科用鉗子 ストレートチップファイン科学ツール00108-11
外科用鉗子 斜め先端ファインサイエンスツール00109-11
春はさみファインサイエンスツール15000-08
ナイロン縫合糸ブレインツリー scintificSUT-S 104
クロージング縫合VWR95057-036
イソフルランピラマル
2,3,5-塩化トリフェニルテトラゾリウムFisherSci50-121-8005
ブレインブロックBraintree scintificBS-A 5000C
クライオスタットブレードVWR89202-606
オプション:
Periflux レーザードップラーシステムPerimedPeriflux 5000
モニタリングユニットPerimedPF 5010 - LDPM
糸

参考文献

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  1. Cuomo, O., et al. Antithrombin reduces ischemic volume, ameliorates neurologic deficits, and prolongs animal survival in both transient and permanent focal ischemia. Stroke. 38 (12), 3272-3279 (2007).
  2. Wauquier, A., Melis, W., Janssen, P. A.

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