細胞の挙動のNanotopographical変調のステッチ法を用いたナノパターン基板を拡大

サマリー

細胞挙動のナノトポグラフィー変調の研究のために、小さなナノパターン化された型から広い面積のナノパターン基板を生成するためのプロトコルが提示されます。

要約

Substrateナノトポグラフィーは、細胞の表現型と機能の強力な調節因子であることが示されています。細胞挙動のナノトポグラフィー変調を解剖するには、ナノトポグラフィー上で十分な細胞を培養し、その後の生化学的および分子生物学的分析のために十分な細胞を培養できるように、広い領域のナノパターン化された基質が望ましいです。しかし、現在のナノファブリケーション技術では、広い領域にわたって高度に定義されたナノパターンを生成するには限界があります。ここでは、ステッチ技術を使用して、ナノパターン化された基板を小さくて高度に定義されたナノパターンから大きな領域に拡張する方法を紹介します。この手法は、明確に定義された金型からポリ(ジメチルシロキサン)(PDMS)金型を複製するソフトリソグラフィー、複数のPDMS金型を1つの大きな金型に組み立てるスティッチ技術、ポリスチレン(PS)基板上にマスター金型を生成するナノインプリントなど、複数の技術を組み合わせたものです。PSマスターモールドを用いて、PDMSワーキング基板を作製し、細胞拡散のナノトポグラフィーによる変調を実証しています。この方法は、広い領域にわたって明確に定義されたナノパターンを生成するためのシンプルで手頃な価格でありながら汎用性の高い方法を提供し、ハイブリッドコンポーネントを備えたマイクロ/ナノスケールデバイスを作成するために拡張される可能性があります。

概要

最近の多くの発見により、基板ナノトポグラフィーが細胞の接着、拡散、移動から増殖、分化まで、細胞の挙動に顕著な影響を与えていることが明らかになっています^1-6。例えば、深いナノグレーティングで培養された細胞では、細胞サイズが小さく、増殖速度が低いことが観察されており、細胞の整列、伸長、遊走が促進されたにもかかわらず、フラットコントロール^2,7-10と比較して、アポトーシスにさえつながることさえあります。さらに、ナノトポグラフィーは、幹細胞のニューロン^2,11,12、筋肉¹³、骨^3,4などの特定の系統への分化を促進することが示されています。さらに、人工ナノマテリアル^14,15の毒性に対する懸念が高まっているため、ナノマテリアルの正確なリスク評価のために、ナノトポグラフィーを生理学的に関連性のあるin vitroモデルに組み込む必要がある。生化学的および分子生物学的解析を行うには、ナノパターン化された基質の広い領域で十分な細胞を増殖させる必要があります。しかし、従来のナノファブリケーション技術では、広い領域にわたって高度に定義されたナノパターンを生成するには限界がありました。

コロイドリソ^{グラフィー16}やポリマーデミキシング¹⁷を含む自己組織化は、低コストで大面積のナノ構造を容易に生成することができる。自己組織化は、コロイド粒子や高分子などの集合体要素間の相互作用、およびこれらの要素と基板との間の可能な相互作用に依存するため、正確な空間位置決めと任意の形状¹⁸を持つナノ構造を生成するスタンドアロンの方法にはなり得ない。それに伴う欠陥の密度が高いことも欠点です。ナノパターンの精密な空間制御は、トップダウンリソグラフィーアプローチを使用して、組み立て要素^19〜21のボトムアップアセンブリをガイドするトポグラフィーおよび/または化学テンプレートを提供するテンプレート化された自己組織化を採用することによって達成することができる。ステップアンドフラッシュリソ^{グラフィー22}およびロールツーロールナノインプリントリソ^{グラフィー23}などの代替ナノファブリケーション技術が開発されているが、その洗練されたプロセスまたは特殊な装置の要件のために、使用が制限されている。それにもかかわらず、テンプレート化されたナノファブリケーション技術または代替のナノファブリケーション技術には、定義されたナノスケールパターンを持つテンプレートまたはマスターモールドが必要です。

そのようなテンプレートとマスターモールドは、従来、集束電子、イオン、または光子ビームリソグラフィーを使用して生成されていました。例えば、電子ビームリソグラフィー(EBL)²⁴および集束イオンビームリソ^{グラフィー25}は、5nm以下の分解能で明確なパターンを生成することができる。2光子リソグラフィーは、^30nm26という小さな特徴サイズを示しています。集束ビームリソグラフィー技術は、明確に定義されたナノスケール構造の生成を可能にしますが、設備投資と時間とコストのかかるプロセスにより、学術研究での広範な使用が制限されます²⁷。したがって、高忠実度で大面積のナノパターン表面を生成するための、可能でありながら手頃な価格の技術を開発することが非常に望ましいです。

私たちは、小さく明確に定義された金型²⁸からナノパターン化された表面の広い領域を生成するための、単純で費用対効果の高いステッチ技術を報告しました。このプロトコルは、EBLで書かれたパターンを使用したポリ(ジメチルシロキサン)(PDMS)金型の複製から、複数のPDMS金型を1つの大きな金型に組み立てること、ポリスチレン(PS)基板などの高分子上のマスター金型の生成、作業基板の製造まで、段階的な手順を提供します。拡大したナノパターン基板を用いて、細胞拡散のナノトポグラフィー調節を実証しました。

プロトコル

EBLモールドからPDMS金型の1レプリケーション

1. シリコン型^29を製作
   1. スピンコートは、200μlのポリメチルメタクリレート（PMMA）、1分間2,500 rpmで1×1cmのシリコン（Si）基板上に溶液が薄膜を形成します。
   2. 2分間180℃でSi基板上にPMMA膜を焼きます。
   3. 300μC/ cm ²の面積の用量で集束電子ビームを用いて、PMMAフィルム上に設計されたナノパターンを書きます。
   4. 80秒間現像液中でのPMMAナノパターンを開発します。
   5. 10 kVで、0.5 mAで放出電流及び0.5オングストローム/秒の蒸着速度の出力電圧で電子ビーム蒸発器を使用して、厚さ50nmのニッケル層とPMMAのナノパターンを堆積させます。
   6. 80℃で20分間20ミリリットルリムーバーでPMMA部分を持ち上げ。
   7. 反応性イオンエッチング（RIE）Si基板にナノパターンを所望の深さのシリコンモールドを取得します。
      注：のTetRのガス混合物afluoromethane（CF _4）、150 W、400 WとRIE電力の誘導結合プラズマ（ICP）電源投入時/酸素（O _{2）（90％/} 10％）は、560ナノメートルの深さにSi基板をエッチングするために使用されます。
2. SilanizeのSiモールド
   1. 100ミリメートルPSペトリ皿にカバーガラスとSiモールドを入れて、換気フード内に配置ガラスデシケーターでそれらを転送します。
   2. カバースリップ上に10μlの1H、1H、2H、2H-Perfluorooctyltrichlorosilaneをドロップします。
      注意：1H、1H、2H、2H-Perfluorooctyltrichlorosilaneは皮膚腐食性および重篤な眼の損傷を引き起こす可能性があります。適切な個人保護具（PPE）を着用してください。
   3. 部分的にペトリ皿をカバーしています。
   4. シリコン金型のシラン化を完了するために、ドラフト内で5時間、真空下でデシケーターを保管してください。
3. PDMSプレポリマーを準備
   1. 使い捨ての計量ボートに10gのPDMS樹脂1.05グラムの硬化剤を秤量します。
   2. プラスチック製のスプーンを使って徹底的にPDMSプレポリマーを混ぜます。
   3. 透明な混合物が観察されるまで約20分間真空下でプラスチック製デシケーター中でPDMSプレポリマーを脱気。
4. PDMS金型を複製します
   1. 60ミリメートルペトリ皿にシラン化したSiモールドを置きます。
   2. ペトリ皿中のSiモールドにPDMSプレポリマーを注ぎます。
   3. すべての気泡が消えるまで約10分間プラスチック製デシケーターと脱ガスにペトリ皿を置きます。
   4. ホットプレートにペトリ皿を移し、4時間70℃でPDMSプレポリマーを硬化させます。
   5. 慎重にピンセットを用いて、シリコンモールドからPDMSモールドをはがし。
      注：PDMS型は最大1週間、周囲条件で保存することができます。硬化後、PDMS金型³⁰の一部の未架橋のPDMS樹脂分子と残留硬化剤があります。低分子量の分子が徐々に外に拡散し、時間の経過とともに表面に蓄積します。これは、PDMS表面³¹の地形学的および機械的特性に影響を与えます。 DIF融合は、1週間以内に重要ではありません。

大型、シングルモールドにPDMS金型の2ステッチ

1. ステップ1.4を繰り返して、複数のPDMS金型を準備します。
   注：PDMS混合物の同じ量、同じ厚さのPDMSモールドを得るたびに秤量します。
2. 光学顕微鏡下で、このようなnanogratingsなどの異方性のPDMSナノパターンの向きを決定し、マーカーペンでPDMSモールドの裏面にマークします。
   注：それはそのようなナノピラー等方性ナノトポグラフィの向きをマークする必要はありません。
3. ドラフト内でエタノールとSi基板をきれいにし、圧縮空気で乾燥させました。
4. ブレードで各PDMSモールドのパターン化されていない部分を切り落とします。
   注：ステッチ金型の周囲に配置されますPDMS金型については、他の人と接触している唯一のパターン化されていない領域がトリミングされるべきです。
5. 上のナノフェイスダウンでトリミングPDMSモールドを配置その後、ミラーSi基板の側との近くに他の金型を揃えるが、周囲の金型（複数可）には触れていません。
6. PDMS接着剤層を調製します
   1. 厚さ0.5mmの層を形成するために清浄なガラススライドインチ（2.5cm×7.5センチ）の1gをPDMSプレポリマー（1.05：10 PDMS樹脂と硬化剤の比率）を脱気キャスト。
   2. 3-5分間ホットプレート上で100℃でPDMS層焼きます。層をタッチして、層が部分的にではなく、完全に硬化されることを保証するために針を使用してください。
      注：部分的に硬化したPDMSは、未硬化PDMSプレポリマーのように流れることができないが、それは硬化PDMSと比較して粘着性です。
7. 整列PDMSモールドの裏面にPDMS層を配置し、すぐにこのアセンブリを反転し、ホットプレートに移します。
8. PDMS接着剤層とPDMSモールドの裏面との間の良好な接触を確実にし、1時間100℃でPDMS接着剤層を硬化させるために、アセンブリの上に金属ブロックを用いて、圧縮力（5キロパスカル）を適用します。
   注：慎重にアセンブリの傾きを避けるために、金属ブロックの位置を調整します。
9. 金属ブロックを削除し、Si基板からのシングル、ステッチPDMSモールドを剥がします。

PS基板上のマスターモールドの3世代

注：スライドガラス上に固定化されたステッチPDMSモールドは、PS版や作業ナノ基材を製造することが可能なPS薄膜上にマスターモールドを生成するために使用することができます。

1. PS版上のマスターモールドを生成します
   1. PS版を準備
      1. 二日間80℃の真空オーブン中でPSペレットを乾燥させます。
      2. 230℃でプレス機を予熱。
      3. 下から上へ順に、アルミニウム板、ポリテトラフルオロエチレン（PTFE）シートとアルミニウムスペーサーを組み立てます。
      4. 3センチメートル（L）×3センチメートル（W）×0.3センチメートル（H）の正方形の開口部を有するアルミニウムスペーサーで負荷3.5グラムのPSペレット。
         注：スペーサーがほぼ0です。1 PDMSモールドよりも厚くcmであり、従って、最終的なナノPSは、基板は、約0.1センチメートルの厚さです。
      5. アルミスペーサー上の別のPTFEシートとし、別のアルミニウム板を置きます。
      6. プレス機械にアセンブリを配置します。
      7. 30分間230℃でPSペレットを予熱。
      8. 5分間のアセンブリ上の圧縮圧力（0.1MPaに）適用します。
      9. 圧力を解放した後、アセンブリ上に圧力0.5MPaの圧縮圧力を再適用します。
      10. 1.5 MPaでの望ましい圧力まで圧力0.5MPaの増加に伴って繰り返しステップ3.1.1.9に到達します。
      11. プレス機のヒーターの電源をオフにして、1.5 MPaでの一定の圧力で70℃以下に冷却します。
      12. アセンブリを取り出し、PS版を再入力から水分を防ぐために、80℃の真空オーブン中でPS版を保存します。
   2. PS版へのナノインプリントステッチPDMSモールド
      1. アルミスペーサーでPS版を置き3インチのSiウェハ上に設定。
         注：スペーサの内側の寸法は、PS版と同じであるので、PS版は、右スペーサに収まります。
      2. 30分間250℃でホットプレート上でPS版を加熱します。
      3. 溶融したPS版上のナノパターンのフェースダウンで縫製PDMSモールドを置きます。
         注：PDMSモールドの片側は最初のPS版の表面と接触して置かれ、他方は、界面での気泡の形成を回避するために、PSの表面に接触して徐々に低下します。
         注意：ホットプレートの表面が高温になっています。ナノインプリントプロセス中thermoglovesを着用してください。
      4. ステッチPDMSモールドのスライドガラス上にアルミ板を置きます。
      5. アルミ板上に金属ブロックを使用して圧縮圧力（12.5キロパスカル）を適用し、3分間待ちます。
         注：アルミニウム板が傾いていないことを確認してください。
      6. 持ち上げて、アルミ板から金属ブロックを交換し、私25キロパスカルに圧縮圧力をncrease。
      7. 圧力とを繰り返し、ステップ3.1.2.6は50キロパスカルまで上昇しました。
         注：この手順は、PDMSモールドとPSプレートとの間に閉じ込められた空気を除去することです。
      8. 15分間、50 kPaでの一貫した圧力下240と250℃の間のホットプレートの温度を維持します。
      9. ホットプレートの電源をオフにして、全体のセットアップをクールダウン。
         注：ファンは、冷却プロセスを促進するために使用することができます。
      10. PS版からステッチPDMSモールドを剥がし慎重に温度が50℃以下になった後の金属ブロックを削除し、。
          注：PS基板が逆ナノパターンを有し、作業PDMS基板を製造するためにマスターモールドとして使用することができます。
2. PS薄膜上にマスターモールドを生成します
   1. PS薄膜を作製
      1. ドラフト内で10ミリリットルのトルエン中の1グラムPSを溶解させます。
         注意：トルエンは皮膚を引き起こす可能性がありますirritationおよび重篤な眼の損傷、および長期または反復暴露による臓器の障害を引き起こす可能性があります。適切なPPEを着用してください。
      2. 1分間2500 rpmでのウエハ2で上にスピンコート1ミリリットルのPS溶液を、〜1μmの厚さのPS薄膜を形成しました。
      3. 3日間、ドラフトのSiウェハ上のPSフィルムを設定することにより、膜からトルエンを蒸発させます。
      4. 一晩80℃の真空オーブン中でPS薄膜をアニールします。
   2. ナノインプリントPS薄膜上にPDMSモールド
      1. ホットプレート上で設定されているPS薄膜、上のナノトポグラフィフェースダウンで縫製PDMSモールドを置きます。
      2. PDMSモールドのガラス側の金属ブロックを使用して、PDMSモールドに12キロパスカルの圧縮圧力を適用します。
      3. 180℃にホットプレートの温度を上昇させ、15分間それを維持します。
         注意：溶融PSフィルムは、潤滑剤として機能することができます。滑り落ちるから金属ブロックを防ぐために注意を払います。
      4. ホットプレートの電源を切り全体のセットアップをクールダウン。
         注：ファンは、冷却プロセスを促進するために使用することができます。
      5. 温度が50℃以下に低下した後、金属ブロックを外し、慎重にPSフィルムからステッチPDMSモールドを剥がします。
         注：ナノPSフィルムは、作業PDMS基板を製造するためのマスター型として機能します。

細胞の挙動の4 Nanotopographical変調

注：ヒト上皮細胞は、細胞拡散のnanotopographical変調を実証するために、代表nanotopographies上で培養されます。

1. 用途に応じて、ステップ3.1または3.2のいずれかから生成されたマスターモールドからPDMS作業基板をキャストします。
2. 中空鋼アーチパンチを使用して、特定のマルチウェルプレート（ 例えば 、24ウェルプレート）の構成に合わせてディスクにナノPDMS基板をカット。
3. OウェルにPDMSディスクを配置するためにピンセットを使用して、FAマルチウェルプレート。
4. 、30分間毎に70％エタノール、次いで、UV露光を使用してPDMS基板を滅菌します。
5. 1X滅菌リン酸緩衝食塩水（PBS）で3回PDMS基板を洗浄します。
6. コート室温で30分間、細胞外マトリックスタンパク質（ すなわち 、20 / mlのフィブロネクチン）を有するPDMS基板。
7. 5分間PDMS基板を滅菌PBSで3回、それぞれを洗い流します。
8. 10％ウシ胎児血清を含むダルベッコ改変イーグル培地中で、ヒト肺癌細胞A549を中断し、血球計数器を用いて細胞を数えます。
9. 一日、5％CO _2を含む加湿雰囲気中、37℃でPDMS基板と培養それらを2,000細胞/ cm ²の播種密度で細胞をプレート。
10. PBSで細胞を3回洗浄します。
11. 4時間、PBS中の4％パラホルムアルデヒドおよび2％グルタルアルデヒドの混合物中の細胞を固定し、CO ₂の重要なPOを用いて細胞を脱水電子顕微鏡観察^29を走査^するため^の int型乾燥機。
    注意：パラホルムアルデヒドおよびグルタルアルデヒドは、重篤な皮膚の薬傷・眼の損傷を引き起こす可能性があります。化学フード内で動作し、適切なPPEを着用してください。

結果

ステッチ技術は、高い忠実度でナノ基板の大面積を生成することができます。 図1aは、それぞれ、Si基板上のPS版とPS薄膜に縫い付けPDMS型から転送ナノ大きな領域を表示1B。元EBL-書かれた金型（ 図1c）と、最終的なPDMS作業基板（ 図1D）との比較は、EBL-書かれたナノパターンを忠実に作業基板に転写することができることを確認します。様々な幾何学的形状および寸法のナノトポグラフィーは、細胞の挙動を調節するために使用することができます。モデル細胞としてadenocarcinomic基底上皮細胞株は、A549で、図2に示されているように、異方性nanogratingsは、A549細胞は、等方性ナノピラーに表示多形態と比較nanograting方向に沿って細胞を長くすることができます。

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ディスカッション

我々は、ナノパターン基板の大面積を生成するために、簡単な手頃な価格の、まだ汎用性の高い方法を提示します。忠実に非常に定義されたナノパターンを展開するには、細心の注意は、いくつかの重要なステップに支払われるべきです。第1は、複数のPDMS金型をトリミングすることです。 PDMSモールドのパターン化されていない領域を除去する必要があります。また、金型の側壁には、金型の間のギャップを最小にするために垂直方向にできるだけ完璧なカットする必要があります。集合的に、最後のステッチ型でパターン化されていない領域の一部を低減することができます。第二に、このPDMSモールドのナノパターン化表面は、シリコン基板上に歪みなしで位置合わせする必要があります。 PDMSナノ構造体が変形しやすいので、（PDMSモールドとシリコン表面との間に空気を捕捉避ける）穏やかに均等にシリコン基板のミラー面に対するナノ面を配置することが重要です。 PDMSモールドは、しかしネイに触れないようにできるだけ近くに整列されますさらに、最終的なステッチモールドのパターン化されていない部分を最小限にするために金型をghboring。それ以外の場合は、タッチしたナノ構造は、ナノインプリント...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
日本電子電界放出	SEM JEOL	JSM-7600F	EBL
E-beam e-beam evaporator	Kurt J. Lesker	型式LAB 18 電子ビーム蒸発器	ニッケル蒸着
Trion Minilock III ICP/RIE	Trion technology	型式Minilock-phantom III
プレス機	PHI 油圧プレス	モールド:SQ-230H
スピンコーター	ローレル技術	モデル:WS-400A-6NPP-LITE
CO2クリティカルドライヤー	Tousimis	Modle:Autosamdri-815
シリコンウェーハ	大学ウェーハ	1080
アルミプレート	McMaster-carr	9057K123
フロンシート	McMaster-carr	8711K92
100 mmペトリ皿	ファルコン
60 mm ペトリ皿	ファルコン	353004
ガラスカバースリップ	フィッシャー・サイエンティフィック	12-542-B
スライド・	フィッシャー・サイエンティフィ	12-550-34
使い捨て計量ボート	フィッシャー・サイエンティフィック	13-735-743
ガラス乾燥器	フィッシャー・サイエンティフィ	02-913-360
プラスチックデシケーター	Bel-Art Products	F42025-000
ホットプレート	フィッシャーサイエンティフィック	1110049SH
ピンセット	テッド・ペラ・インク	5726
ブレード	フィッシャーサイエンティフィック	S17302
メタルブロック	マスターカー
パンチ	トンビレッジレザークラフト用品	アーチパンチ
ポリ(メタクリル酸メチル)	MicroChem	495 PMMA A4
PDMS	ダウコーニング	シルガード184キット
ポリスチレン	ダウケミカル	スタイロン 685D
1H,1H,2H,2H-パーフルオロオクチルメチルジクロロシラン	オークウッドケミカル	7142
開発者	MicroChem	MIBK/IPA 1:3 比率
リムーバー		MicroChem リムーバー PG
エタノール	フィッシャー サイエン	フィック BP2818500
トルエン	フィッシャー サイエンティフィック T324-500
リン酸緩衝生理食塩水	Sigma Aldrich	D8537
Dulbecco's modified eagle medium	Sigma Aldrich	D5796
Fetal bovine serum	Atlanta Biologicals	S11550
パラホルムアルデヒド	電子 Microsopy Science	15712-S
グルタルアルデヒド	フィッシャーケミカル	G151-1
フィブロネクチン	コーニング	356008
A549細胞	ATCC	ATCC CCL-185