このコンテンツを表示するには、JoVEへの購読が必要です。 または、無料トライアルをお申し込みください。

方法論記事

腫瘍の増殖と転移研究のためのトレーサブル記者との乳癌患者由来の異種移植片の標識

11.4K 回視聴

⸱

DOI:

10.3791/54944

⸱

2016年11月30日

 ,  ,  ,  , 
1Department of Pathology, School of Medicine, University of Colorado Anschutz Medical Campus

この記事について

サマリー

緑色蛍光タンパク質を発現するレンチウイルス粒子とルシフェラーゼレポーターによる患者由来異種移植片(PDX)の安定な標識方法について説明します。この方法により、一次部位でのPDXの増殖を追跡し、in vivoイメージングシステムを使用して自然および実験的転移を検出できます。

要約

腫瘍の生物学と治療への反応を研究するための前臨床モデルの使用は、癌研究の中心です。長年にわたるヒト細胞株や多くのトランスジェニックマウスモデルは、ヒト悪性腫瘍の主要な側面を再現できないことがよくあります。したがって、患者の腫瘍とその転移の不均一性をよりよく表す代替モデルが開発されています。外科的に切除された腫瘍サンプルを免疫不全マウスに移植する患者由来異種移植片(PDX)モデルは、複数世代にわたって移植でき、ヒトがん細胞株に由来する異種移植片よりも腫瘍の不均一性をより効率的に反映するため、魅力的な代替手段となっています。PDXの使用には限界があり、トランスフェクションやトランスデューシングによるトレーサブルレポーターの導入や遺伝子発現の操作が難しいことが挙げられます。現在のプロトコルでは、解離した腫瘍細胞をPDXから高い形質導入効率で形質導入する方法、および乳がん転移の実験モデルに標識PDXを使用することが説明されています。 このプロトコルは、転移カスケードの臓器コロニー形成プロセスを研究するための実験的転移モデルで標識PDXを使用することも示しています。さまざまな臓器への転移は、生きた動物での生物発光イメージング、または解剖中および切除された臓器でのGFP発現を使用して、簡単に視覚化および定量化できます。これらの方法は、複数のタイプのPDXの使用を転移研究に拡張するための強力なツールを提供します。

概要

外科的に切除腫瘍サンプルは、直接免疫不全マウスに移植された患者由来の腫瘍異種移植片（PDXs）の開発は、標準的な細胞株の異種移植モデルに比べていくつかの利点を提供し、癌研究1,2における大きな進歩を表しています。 PDXsは最初の継代で増殖させ、腫瘍の遺伝的および生物学的特性の最小の変化で連続継代により維持及び拡張することができます。そしてより正確にヒト癌細胞株3-8由来の異種移植片よりも腫瘍の不均一性を反映しています。これらのモデルは、現在広く医薬品開発6,11における前臨床プラットフォームとしておよび癌生物学4,12を研究するための実験的なツールとして、癌治療9,10をパーソナライズするためのプラットフォームとして使用されています。

ほとんどのPDXsは、移植され、実行可能にキャリパーを使用して、時間をかけて腫瘍増殖の測定を可能にする、皮下に伝播されます。しかしながら、転移性疾患はPDXsを使用してモデル化することはより困難でした。具体的には乳癌のために、別の器官への転移能力を有する異種移植片3,5,13を説明したが、転移部位への自発的な普及の頻度が極めて低いです。報告された場合には、転移性の負担の同定および定量は、死後標的臓器の面倒な組織学的検査に依存しています。生物発光を発現する癌細胞株（ルシフェラーゼ、リュック）または蛍光（緑色蛍光タンパク質、GFP）の遺伝子レポーターは、一般的に、脳、肺、心臓内の後の骨、肝臓、尾静脈、大腿骨内および脾臓注射乳癌転移の実験モデルに使用されています14-16。これらのモデルは、原発腫瘍から播種をバイパスするが、それらは臓器向性および転移性のコロニー形成のメカニズムを研究する価値があります。しかし、一次患者の腫瘍とPDXs由来の細胞は、低トランスフェクションまたは形質導入率usinを持つことができますグラム標準的な手順。一つの代替案は、その後、従来の組織培養プロトコルを用いて標識することができ、インビトロ 17 に PDX由来細胞株を確立することです。このアプローチは、しかしながら、細胞株の誘導が困難であり、細胞の表現型を変更することができるため、最もPDXsを標識するのに適していません。ここでは、in vivoイメージングに適したレンチウイルスベクターを用いたPDX-解離腫瘍細胞の形質導入のためのプロトコルを提示します。加えて、我々は、免疫不全マウスにおいて、解離したLUC-GFP標識されたPDX細胞の心臓内注射を使用して実験的転移を説明します。

遺伝子レポーターを発現するレンチウイルスとPDX-解離オルガノイドの形質導入のための基本的なプロトコルは、以前に18を説明してきました。現在のプロトコルでは、ヒト腫瘍細胞を濃縮し、100％の導入効率の近くに取得するために追加の方法を説明するだけでなく、実験的な乳癌を検出するための標識PDXsの使用転移。このプロトコルは、様々な発光と蛍光マーカーと同様に、遺伝子発現（目的の遺伝子の、すなわち 、のshRNAノックダウン）の調節にPDXsの複数の癌種を標識するために適合させることができます。

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

プロトコル

このプロトコルで動物の使用が必要なすべての手順は、コロラド大学動物研究倫理委員会(IACUC)のガイドラインに準拠しています。

1. 器具、培地、その他の試薬の調製

  1. ダルベッコの改変イーグル培地とハンのF-12培地(DMEM/F12)(1:1)、塩基性線維芽細胞成長因子(bFGF、20 ng/ml)、上皮成長因子(EGF、10 ng/ml)、ヘパリン(4 μg/ml)、1x B27、ペニシリン(100 U/ml)、ストレプトマイシン(100 μg/ml)を含む100 mlのマンモスフィア培地を調製します。培地は無菌状態で調製し、4°Cで最大3ヶ月間保存してください。
  2. PBS pH 7.2、0.5% ウシ血清アルブミン(BSA)、2 mM EDTAを含む上皮濃縮緩衝液(EEB)を調製します。フィルター滅菌し、4°Cで最大6か月間保存します。
  3. 滅菌済みの15 mLコニカルチューブに5 mLの消化緩衝液を調製し、-20°Cで数か月間保存します。腫瘍消化の前夜、消化バッファー(腫瘍500mgあたり5ml)を氷上で4°Cで解凍し、使用前に抗生物質-抗真菌剤ミックスを1倍加えます。
  4. オートクレーブ(121°Cで30分間)少なくとも2つの鉗子、メス、およびPDXの解剖用ハサミ。
  5. DMEM:F12と5%ウシ胎児血清(FBS)を含む500mlの洗浄バッファーを作製します。4°Cで数ヶ月間保存してください。腫瘍解剖の日に腫瘍あたり10mlを分注します。
  6. ポリブレンストックを滅菌水で4 μg/μlで調製します。ろ過して分注し、それぞれ100 μlの入った1.5 mLの微量遠心チューブに入れ、-20°Cで保存します。

2. トレーサブルマーカーを保有する高力価レンチウイルス粒子の生成

  1. レポーター遺伝子(すなわち、腫瘍増殖のin vivo追跡のためのGFPおよびLuc)を有する高力価レンチウイルス粒子を購入または生成する 18,19.
    注:PDXの形質導入を成功させるには、> 108 TU/ml(形質導入単位/ミリリットル)のレンチウイルス力価が推奨されます。レンチウイルス粒子は、水疱性口内炎ウイルス(VSV-G)由来のエンベロープG糖タンパク質でシュードタイプ化され、さまざまな哺乳動物細胞の形質導入を可能にする必要があります
    注:高力価レンチウイルス粒子の生成および滴定にここで使用したプロトコールは、www.kottonlab.com で入手できます。このプロトコルで使用されるベクターは、pSIH1-H1-copGFP-T2A-puro とデュアルプロモーター pHAGE-EF1aL-luciferase-UBC-GFP-W です。このベクターは、ボストン大学のDarrell Kotton氏のご厚意により、pHAGE-EF1aL-dsRed-UBC-GFP-WベクターのdsRedをEF1aLプロモーターの下流のルシフェラーゼ遺伝子に置き換えることによって生成されました。

3. 患者由来の異種移植片の生成

  1. 免疫不全マウスの乳腺脂肪パッドに原発性または転移性乳房腫瘍を移植することにより、乳がんから患者由来異種移植片(PDX)を生成します3,4。大きな腫瘍には壊死性コアが含まれている可能性が高いため、直径1cmの最大推奨サイズで腫瘍を生成します.
    注:異種移植片を確立および移植するための詳細な方法は、DeRoseらに記載されています。 18.確立された移植可能なPDXの直径>1cmの腫瘍への成長は、免疫不全のNOD / SCID / ILIIrg-/-(NSG)への移植後4〜24週間かかります 内因性腫瘍の増殖速度にもよりますが。このプロトコルは乳がんPDXの形質導入を説明していますが、短期間のin vitro通過に適した任意の腫瘍のウイルス形質導入に使用できます。PDXの短期(24〜96時間)in vitro生存に対する感受性は、各腫瘍に固有のものであり、実験的に決定する必要があります。

4. PDX由来腫瘍細胞の腫瘍解剖と解離

  1. PDX を保有するマウスを CO2 吸入とそれに続く子宮頸部脱臼を使用して安楽死させます (動物研究倫理委員会の制度ガイドラインに従います)。マウスを0.2%クロルヘキシジン溶液に1分間浸します。解剖ボードの上の仰臥位にマウスを置き、ピンを使用して伸ばされた上肢と下肢をボードに固定します。
  2. 無菌技術を使用して、メスを使用して腫瘍の周りの皮膚を切断します。鉗子のセットで皮膚を引っ張り、腫瘍が完全に露出するまで清潔なメスを使用して腫瘍から分離します。清潔な鉗子とメスのセットを使用して、腫瘍を切除し、氷上の5mlの洗浄培地に入れます。
  3. 解剖した腫瘍をBLS2キャビネットに取り込み、さらなる処理を行います。培地を取り除き、10 mlのHank's Balanced Salt Sodium Modified with 10 mM Hepes(HBSS / Hepes)で腫瘍を2回すすぎます。.
  4. 腫瘍を滅菌済みの予備計量60cm組織培養プレートに落とします。腫瘍を含むプレートの重量を量り、腫瘍の質量を推定します。
  5. メスを使用して、腫瘍を半分に切断し、次に半分から3 mmのディスクを切り取り、10%ホルマリンの入った容器に24時間置きます。この組織を使用して、腫瘍サンプル(親PDX)の不均一性を確認します。200μlのHBSS/Hepes(組織が乾燥するのを防ぐのに十分)を加え、鉗子と清潔なメスを使用して、残りの腫瘍をできるだけ小さく刻みます。
  6. ミンチした腫瘍を滅菌済みの50ml円錐管に移します。腫瘍100 mgあたり1x抗真菌薬-抗生物質を含む消化緩衝液を少なくとも1 ml追加します.
    注:抗生物質/抗真菌薬の添加は、in vitroでの腫瘍細胞の汚染を防ぎます。
  7. 腫瘍を30°Cで3時間消化し、125〜200rpmで振とうします
    注:温度を37°Cまで上げると、消化効率が向上します(時間の経過とともに単一細胞が増えます)が、通常は細胞死が増加します。ほとんどの腫瘍では、30°Cで3時間消化すると、標識ステップに進むのに十分な数の生存細胞が解離します。
  8. 35 mLの洗浄培地(DMEM / F12と5%FBS)を追加して消化を停止します。70 μmのナイロンメッシュを通して、清潔な50 mLのコニカルチューブにろ過し、未消化の組織を取り除きます。消化細胞を含むろ過培地を400 x gで5分間遠心分離します。
  9. 上清を吸引し、ペレットを1 mLの赤血球溶解バッファーに再懸濁します。室温で5分間インキュベートします。
  10. 10 mLのWash buffer(DMEM:F12、5% FBS)を加えて溶解を停止します。細胞を40 μMナイロンメッシュに通して、凝集体を除去します。400 x gで5分間遠心分離し、上清を取り除き、氷の上に置きます。
  11. 消化した細胞を5 mLの洗浄バッファーに再懸濁し、トリパンブルー排除を使用して生細胞と非生細胞の両方をカウントします。簡単に言うと、50μlの細胞と50μlのトリパンブルーを混合し、血球計算盤を使用してトリパンブルーを除く細胞をカウントします
    注:この粗消化製品には、PDXに由来するヒト腫瘍細胞とマウス間質細胞(線維芽細胞、血球など)が含まれます。これで、消化された細胞を標識のために処理したり(ステップ6)、参考文献5に記載されている手順のいずれかを使用してヒトがん細胞を濃縮することができます。

5. ヒト上皮がん細胞の濃縮

  1. 系統(Lin+)細胞枯渇キット20.
    を使用してマウス間質細胞を枯渇させます 注: 高度に血管新生された腫瘍および/または EpCAM 発現が不明または失われている間質含有量の高い腫瘍に推奨されます)。
    1. 清潔な5mlポリプロピレンチューブに最大10個の7生細胞を取り込み、2mlのEEBを加え、300 x gで5分間遠心分離します。
    2. 細胞ペレットを氷冷EEB40 μlに再懸濁し、10 7細胞あたり
      3. 。
    3. 107細胞あたり10 μlのビオチン抗体カクテルを加え、ピペッティングで穏やかに混合し、4°Cで10分間インキュベートします(カクテルにはLin+マウス細胞に対する抗体が含まれています)。
    4. 107細胞あたり30 μlの冷EEBを加え、ピペッティングで穏やかに混合します。
      5. 7
    5. 細胞10個あたり20μlの抗ビオチンマイクロビーズを加え、穏やかにピペッティングして混合し、4°Cで15分間インキュベー
      6. トします。
    6. 細胞を3 mLの冷EEBで洗浄し、300 x gで4°Cで5分間遠心分離します。ペレットを500 μlのEEBに再懸濁し、氷上に置きます。
    7. カラムを磁気セパレーターの磁場に置きます。カラムを0.5 mLの上皮濃縮バッファーですすぎ、滴下させます。カラムを乾かさないでください。
    8. 新しいポリプロピレン製収集チューブをカラムの下に置きます。標識細胞を含む500 μlをカラム上までゆっくりと加えます(Lin+標識細胞は磁気カラムに保持されます)。廃液を標識されていない細胞を持つ画分として収集し、濃縮された系統陰性(腫瘍)細胞画分を表します。
    9. カラムを500 μlのEBBで3回すすぎ、ステップ5.1.8の廃液と同じチューブに廃液を回収します。廃液を氷上に保管し、ラベリングステップ(6)に進みます。
    10. オプション:カラムを磁場の外側に持っていきます。新しいポリプロピレンチューブを下に置き、500 μlのEEBを3回加え、付属のプランジャーを使用してLIN+画分を溶出します。
  2. ヒトEpCAM+上皮がん細胞の濃縮(CD326+を発現し、マウス間質含有量が高いことが知られている腫瘍に推奨)。
    1. きれいな5 mlポリプロピレンチューブに最大10個の7生細胞を取り、2 mlの冷たいEEBを加え、300 x gで5分間遠心分離します。
    2. 細胞ペレットを氷冷EBB60 μlに再懸濁し、10/ 7細胞あたり
      3. 。
    3. 7細胞10個あたり20μlのEpCAMマイクロビーズを加え、ピペッティングで穏やかに混合し、4°Cで30分間インキュベートします。
    4. 細胞を3 mLの冷EEBで洗浄し、300 x gで4°Cで5分間遠心分離します。ペレットを500 μlのEEBに再懸濁し、氷上に置きます。
    5. ミニセパレーターの磁場にカラムを置きます。カラムを0.5 mLのEEBですすぎ、滴下します。カラムを乾かさないでください。
    6. 新しいポリプロピレン製収集チューブをカラムの下に置きます。標識細胞を含む500 μlをカラム上にゆっくりと加えます(EpCAM+標識細胞は磁気カラムに保持されます)。廃液を、マウス間質細胞を表す標識されていない細胞を持つ画分として収集します。
    7. カラムを500 μlのME Bufferで4回すすぎ、ステップ5.1.8の廃液と同じチューブに廃液を回収します。
    8. カラムを磁場の外側に持っていきます。新しいポリプロピレンチューブを下に置き、500 μlのMEバッファーを3回加えて、EpCAM+フラクションを溶出します。プランジャーをカラムにしっかりと押し込むことにより、磁気的に標識されたセルを洗い流します。濃縮されたEpCAM+腫瘍細胞画分を含む廃液を回収し、氷上に保管します。手順 6 に進みます。

6. PDX由来腫瘍細胞の形質導入

  1. 解離した腫瘍細胞を300 g x 5分で遠心分離し、2 mLのマンモスフィア培地に再懸濁します。4.11のようにトリパンブルー排除を使用して生細胞をカウントします。
  2. 8 μg/ml ポリブレン (培地 1 ml あたり 2 μl のストックポリブレン) を含む 10 ml のマンモスフィア培地を調製します。
  3. 2 x 105 の生存腫瘍細胞に必要な容量を決定します。細胞を300 x gで5分間遠心分離し、ペレットをポリブレン含有培地2 mLに再懸濁します。プレート 2 x 10 ウェルあたり5 個の生存腫瘍細胞を 6 ウェル超低接着組織培養プレートに入れます。.
    注:これは、1つのレンチウイルスベクターによる形質導入に必要な細胞の最適な数です.
    注意！レンチウイルス粒子およびレンチウイルス粒子とともに使用されるすべての消耗品は、組換えDNAバイオハザードの制度的手順に従って取り扱われるべきである
    注:初代乳房細胞のレンチウイルス形質導入は、筋上皮細胞を強く支持するため、標識中に管腔細胞の標識が不十分になり、腫瘍細胞の亜集団が選択される可能性があります21。
  4. 形質導入前にウイルスを200 mU/mlのノイラミニダーゼと37°Cで1時間インキュベートして、ウイルス粒子の異なる初代細胞亜集団への結合を増やし、この潜在的なバイアスを修正します21。
  5. PDX解離細胞がLin+マウス細胞から枯渇した場合、またはEpCam+細胞が濃縮されている場合は、10 MOI(2 x 106 TU、2 x 10 6 TU)でレンチウイルス粒子を添加します。非濃縮PDX解離細胞を使用する場合は、30 MOI(2 x 105生細胞に対して6 x 10 6 TU)でレンチウイルス粒子を添加します
    注:MOIの増加により、粗抽出物中に大量の破片や死細胞が存在する場合でも効率的な形質導入が可能になります。1つのウェルを標識されていない細胞で保持し、生存率と形質導入効率のコントロールとして機能します。
  6. 渦巻き状に回転させてウイルスと細胞を混合します。37°C、5%CO2で最大96時間インキュベートします。トランスフェクションの24時間後に、新鮮なマンモスフィア培地500 μlを添加します。細胞はプレートに付着せず、培地を吸引しません。

7. 免疫不全マウスにおける標識細胞の形質導入効率と再移植の評価

  1. 蛍光顕微鏡を使用して24時間ごとにトレーサブルマーカー(GFP)の発現を10倍の倍率でモニターします.
    注:GFPの発現は感染後24時間という早い時期に観察されますが、ほとんどのPDXでは、GFPの発現は72時間後にはっきりと見えます(図1)。
  2. 全ウェル内のGFP+細胞の割合を評価することにより、形質導入の効率を推定します.
    注:培養物には腫瘍細胞、残存間質細胞、および死細胞がさまざまな程度で含まれているため、GFP+細胞が10%と低いウェルを宿主マウスに移植できます。
  3. 形質導入した細胞を6ウェルプレートから15 mLのコニカルチューブに移します。1 mLのマンモスフィア培地をウェルに加えて、残されたすべての細胞を収集します。氷の上に置きます。
  4. 形質導入細胞にHBSS/hepes 10 mLを加え、300 x gで5分間、4 °Cで遠心分離します。上清を慎重に吸引し、氷上の50 μlのベースメントマトリックス抽出物(BME)に再懸濁します。
    注:BMEアリコートは、使用の1〜2時間前に氷上で解凍する必要があります。BMEは室温で固化します。常に氷の上に置いてください。
  5. BMEに包埋した細胞を0.5mlのインスリン注射器にロードし、氷上に保管し、動物施設に持ち込んでNSGマウスに再移植します。
  6. 5% イソフルラン/95% 酸素を 5 分間使用し、続いて 2% イソフルラン/98% 酸素を使用するか、承認された動物研究倫理承認プロトコルに従って、4 週齢の NSG マウスを麻酔します。
  7. 動物が痛みの刺激に反応しない場合(つま先をつまむ)、ベタジンとエタノールワイプで注射部位を洗浄し、50μlの細胞を4番目の乳房脂肪パッドに注入します。承認されたプロトコルに示されているように、注射の不快感を軽減するためにマウスに鎮痛剤を提供します。
  8. 細胞が腫瘍を形成するのを待ち(2〜12週間)、調整可能な光システムおよび/またはin vivoルシフェラーゼイメージングシステムを使用してGFPおよび/またはルシフェラーゼ活性をモニターします(図2).
    注:麻酔、鎮痛、腫瘍負荷の測定、および施設の動物研究倫理委員会によって承認された安楽死基準のガイドラインに従ってください。

8. ラベル付きPDXの品質管理

  1. 標識腫瘍におけるルシフェラーゼとGFPの発現を評価することにより、標識の効率を決定します.
    注:in vivo生物発光イメージングについては、機関の動物研究倫理委員会が承認した手順に従ってください(図2、3)。
    1. 腫瘍のサイズが直径1.0〜1.5cmに達した場合(または、4で説明されているように承認されたプロトコルに従ってそれ以前)に安楽死マウスから腫瘍を解剖します。解剖は、調整可能な光システム(またはGFP蛍光評価を可能にする同等のシステム)の下で実行する必要があります。
    2. 各腫瘍から、顕微鏡法を用いてGFP+腫瘍の割合を定性的に推定します。100%未満の場合は、GFP +部分のみを解剖します。3 mmのディスクを解剖し、パラフィン包埋および組織学的分析のために10%ホルマリンに固定し、RNAまたはその他の必要な分析のために小片を保存し、凍結保存のために90%FBS/10%DMSOを含む個々の1.5 mlクライオチューブにできるだけ多くの腫瘍を保存します。
  2. 標識腫瘍の断片を新しいレシピエントNSGマウス18に再移植して、実験的転移研究で拡張して使用します。
  3. 形質導入前およびその後の各世代で腫瘍から得られたパラフィン包埋組織の標準的な免疫組織化学染色を実施して、標識されたPDXが元のPDXと組織学的に類似していることを確認します
    注:品質管理に使用されるマーカーは、PDXごとに異なります。乳がんのPDXでは、初期スクリーニングにエストロゲン受容体、プロゲステロン受容体、上皮成長因子受容体2(HER2)、上皮成長因子受容体1(HER1またはEGFR)、汎サイトケラチン(pan-CK)の発現が推奨されます。

9. 標識付きPDXを用いた実験的転移モデル

  1. セクション4に記載されている手順に従って、標識されたPDXから腫瘍細胞を解離します。腫瘍が高度に血管新生されているか、マウス間質が豊富である場合は、4.5または4.6に記載されているようにがん細胞の濃縮を行います。
  2. トリパンブルー排除法を用いて生細胞をカウントし、マウス1匹あたり100 μl PBS(Ca2+、Mg2+フリー)で250,000個の細胞を希釈します。細胞を氷の上に保ちます。複数のマウスを注入する場合は、それに応じて数を調整します(ピペッティングエラーを考慮して、少なくとも1回余分に注入を準備します)。
  3. 氷上の細胞を適切な動物処置室に持ち込み、承認されたIACUCプロトコルに従って心臓内注射に進みます.
    注:癌細胞の心臓内注射のための詳細なプロトコルは、他の場所22,23に記載されています。
  4. 生物発光イメージングを使用して、経時的な転移の広がりを追跡し、定量化します。剖検24で孤立した臓器の生物発光および/またはGFPイメージングを使用して、さまざまな臓器での巨視的転移を視覚化します(図6)。

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

結果

本手法では、高タイターのレンチウイルスベクターpSIH1-H1-copGFP-T2A-puroおよびpHAGE-EF1aL-luciferase-UBC-GFP-Wを用い、PDXから解離させた乳がん細胞に導入（トランスダクション）する方法について説明します。これらのベクターは蛍光マーカーを発現するため、導入効率の推定が可能です。 in vitro、感染後早ければ24時間で（図1a）。ほとんどのPDXでは、GFPの発現は感染後最大72時間まで遅延します（図1b）、この時点で細胞凝集体の形成が一般的に観察されます。形質導入は、ヒトがん細胞を濃縮した後に実施することが可能です（すなわち、 Lin+細胞除去法を用いて、 図1a) または未精製 PDX 解離細胞（図1bマウスの血球細胞が生細胞の総数に対して大きな割合を占める血管新生が盛んな腫瘍では、腫瘍上皮細胞の濃縮が推奨されます。

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

ディスカッション

プロトコル内の重要なステップ:

高力価レンチウイルス粒子(>108 TU/ml)の使用は、 in vitro 形質導入中の培地組成の慎重な制御を可能にするため、このプロトコルの成功における重要なステップです。高力価ウイルス粒子を製造するための複数の方法が十分に説明されていますが、18,19;このプロトコルは、 www.kottonlab.com で詳細に説明されているように生成されたレンチウイルス粒子を使用します。腫瘍の消化とがん細胞の解離のための穏やかな方法は、標識腫瘍の標識と増殖を成功させるために重要です。消化時間を3時間以上延長するか、消化温度を37°Cに上げると、解離細胞の数は増加しますが、ほとんどの腫瘍で細胞の生存率と標識の成功率が低下します。

変更とトラブルシューティング:

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

開示事項

著者らは開示するものは何もない。

謝辞

著者らは、これらの研究で使用された高力価レンチウイルス産生のためのpHAGE-EF1aL-dsRed-UBC-GFP-Wベクターとプロトコルを提供してくれたボストン大学のDarrel Cotton博士に感謝します。この作業は、DOD BCRP W81XWH-11-1-0101 (DMC)、ACS IRG # 57-001-53 (DMC)、NCI K22CA181250 (DMC)、R01 CA140985 (CAS) によって資金提供されました。NCI P30CA046934 Centerの助成金は、コロラド大学AMCのin vivoイメージングおよび組織培養コアを支援しました。

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
DMEM/F12 (1:1)HycloneSH30023.01
bFGFBD Biosciences354060
EGFBD Biosciences354001
HeparinSigmaH4784
B27Gibco/Thermo Fisher17504-44
抗真菌抗生物質HycloneSV30010
Accumaxの革新的な細胞技術AM-105-500消化緩衝液
FBSアトランタの生物製剤S11550
HBSSの赤いCa2+/Mg2+自由なHycloneのSH30031.02
Hepes
10x PBSのHycloneのSH30258.01
CultrexCultrex3433-005-01地下マトリックス抽出物(BME)
30°CシェーカーNewBrunswick Scientific CO. INCSeries 25 Incubator Shaker
70 μmフィルターファルコン7352350
メスフィッシャー22079690
クロレキシジン消毒剤デュルベット NDC# 30798-624-35
赤血球  細胞溶解試薬SigmaR7757
ノイラミニダーゼΣN7885-1UN
EpCAM (CD326+) マイクロビーズ*Miltenyil Biotec130-061-101
系統細胞枯渇キット、マウス*Miltenyil Biotec130-090-858
MiniMACS Separator Miltenyil Biotec130-042-102
Mini MACS Magnetic StandMiltenyil Biotec130-042-303
MS カラムMiltenyil Biotec130-042-201MS または LS カラムは、セルの数に合わせて調整して使用できます。
Illumatool チューナブルライトシステムライトツールズの研究各種in vivo蛍光イメージング
Xenogen IVIS200イメージングデバイスXenogen各種in vivo 発光イメージング
ヒトサイトケラチンクローン MNF116 モノクローナル抗体DAKOM0821汎サイトケラチン 
上皮成長因子受容体抗体細胞シグナル伝達4267SEGFR

参考文献

  1. Jin, K., et al. Patient-derived human tumour tissue xenografts in immunodeficient mice: a systematic review. Clin Transl Oncol. 12 (7), 473-480 (2010).
  2. Siolas, D., Hannon, G. J. Patient-derived tumor xenografts: transforming clinical samples into mouse models. Cancer Res. 73 (17), 5315-5319 (2013).
  3. DeRose, Y. S., et al. Tumor grafts derived from women with breast cancer authentically reflect tumor pathology, growth, metastasis and disease outcomes. Nat Med. 17 (11), 1514-1520 (2011).
  4. Kabos, P., et al. Patient-derived luminal breast cancer xenografts retain hormone receptor heterogeneity and help define unique estrogen-dependent gene signatures. Breast cancer research and treatment. 135 (2), 415-432 (2012).
  5. Zhang, X., et al. A renewable tissue resource of phenotypically stable, biologically and ethnically diverse, patient-derived human breast cancer xenograft models. Cancer Res. 73 (15), 4885-4897 (2013).
  6. Lum, D. H., Matsen, C., Welm, A. L., Welm, B. E. Overview of human primary tumorgraft models: comparisons with traditional oncology preclinical models and the clinical relevance and utility of primary tumorgrafts in basic and translational oncology research. Curr Protoc Pharmacol. , (2012).
  7. Marangoni, E., et al. A new model of patient tumor-derived breast cancer xenografts for preclinical assays. Clin Cancer Res. 13 (13), 3989-3998 (2007).
  8. Garrido-Laguna, I., et al. Tumor engraftment in nude mice and enrichment in stroma- related gene pathways predict poor survival and resistance to gemcitabine in patients with pancreatic cancer. Clin Cancer Res. 17 (17), 5793-5800 (2011).
  9. Landis, M. D., Lehmann, B. D., Pietenpol, J. A., Chang, J. C. Patient-derived breast tumor xenografts facilitating personalized cancer therapy. Breast Cancer Res. 15 (1), 201(2013).
  10. Norum, J. H., Andersen, K., Sorlie, T. Lessons learned from the intrinsic subtypes of breast cancer in the quest for precision therapy. Br J Surg. 101 (8), 925-938 (2014).
  11. Tentler, J. J., et al. Patient-derived tumour xenografts as models for oncology drug development. Nat Rev Clin Oncol. 9 (6), 338-350 (2012).
  12. Zhang, H., et al. Patient-derived xenografts of triple-negative breast cancer reproduce molecular features of patient tumors and respond to mTOR inhibition. Breast Cancer Res. 16 (2), R36(2014).
  13. Liu, H., et al. Cancer stem cells from human breast tumors are involved in spontaneous metastases in orthotopic mouse models. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (42), 18115-18120 (2010).
  14. Kang, Y. Analysis of cancer stem cell metastasis in xenograft animal models. Methods Mol Biol. 568, 7-19 (2009).
  15. Thibaudeau, L., et al. Mimicking breast cancer-induced bone metastasis in vivo: current transplantation models and advanced humanized strategies. Cancer Metastasis Rev. 33 (2-3), 721-735 (2014).
  16. Francia, G., Cruz-Munoz, W., Man, S., Xu, P., Kerbel, R. S. Mouse models of advanced spontaneous metastasis for experimental therapeutics. Nat Rev Cancer. 11 (2), 135-141 (2011).
  17. Powell, E., et al. p53 deficiency linked to B cell translocation gene 2 (BTG2) loss enhances metastatic potential by promoting tumor growth in primary and metastatic sites in patient-derived xenograft (PDX) models of triple-negative breast cancer. Breast Cancer Res. 18 (1), (2016).
  18. DeRose, Y. S., et al. Patient-derived models of human breast cancer: protocols for in vitro and in vivo applications in tumor biology and translational medicine. Curr Protoc Pharmacol. , (2013).
  19. Wang, X., McManus, M. Lentivirus production. J Vis Exp. (32), (2009).
  20. Indumathi, S., et al. Lineage depletion of stromal vascular fractions isolated from human adipose tissue: a novel approach towards cell enrichment technology. Cytotechnology. 66 (2), 219-228 (2014).
  21. Hines, W. C., Yaswen, P., Bissell, M. J. Modelling breast cancer requires identification and correction of a critical cell lineage-dependent transduction bias. Nat Commun. 6, 6927(2015).
  22. Campbell, J. P., Merkel, A. R., Masood-Campbell, S. K., Elefteriou, F., Sterling, J. A. Models of bone metastasis. J Vis Exp. (67), e4260(2012).
  23. Kang, Y. Imaging TGFbeta Signaling in Mouse Models of Cancer Metastasis. Methods Mol Biol. 1344, 219-232 (2016).
  24. Jenkins, D. E., Hornig, Y. S., Oei, Y., Dusich, J., Purchio, T. Bioluminescent human breast cancer cell lines that permit rapid and sensitive in vivo detection of mammary tumors and multiple metastases in immune deficient mice. Breast Cancer Res. 7 (4), R444-R454 (2005).
  25. Lawson, D. A., et al. Single-cell analysis reveals a stem-cell program in human metastatic breast cancer cells. Nature. 526 (7571), 131-135 (2015).

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

再版と許可

タグ

乳がんPDXレンチウイルス導入腫瘍細胞標識生物発光イメージングGFP発現腫瘍解離上皮細胞濃縮in vivoイメージング
腫瘍の増殖と転移研究のためのトレーサブル記者との乳癌患者由来の異種移植片の標識
お問い合わせ
図書館に推薦する

プライバシー

利用規約

ポリシー

著作権 © 2026 MyJoVE Corporation. 無断転載を禁じます。