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方法論記事

脂肪酸の同定で

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DOI:

10.3791/54960

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2016年12月5日

 ,  , 
1UMR408 SQPOV, Sécurité et Qualité des Produits d'Origine Végétale, INRA, Université d'Avignon, 2UMR1333 DGIMI, INRA, Université de Montpellier

この記事について

サマリー

私たちは、脂肪酸を精製する必要なしに、脂肪酸を特定するためのプロトコルを提案します。これは、保持時間に関する情報と、脂肪酸メチルエステル(FAME)、4,4-ジメチルオキサゾリン誘導体(DMOX)、および3-ピリジルカルビニルエステル(ピコリニル)の3種類の脂肪酸誘導体の質量スペクトルを組み合わせたものです。

要約

バチルス種は、メチル分岐（イソまたはアンテイソ）の二重結合の多様な位置で分枝鎖不飽和脂肪酸（FAS）を含みます。 FA組成の変化は、環境への細菌の適応において重要な役割を果たしています。これらの変更は、イソ対アンテイソの比率の変化を伴う特定の位置に作成された二重結合を有する、FAの分枝、飽和のFAへの不飽和のFAの割合インチFAプロファイルの正確な同定は、 バチルス種の適応メカニズムを理解する必要があります。

バチルスからのFAの多くは市販されていません。脂肪酸メチルエステル（FAME）、4,4-ジメチルオキサゾリン：本明細書で提案された戦略は、FA誘導体の3種類の質量スペクトルと保持時間（等価な鎖長（ECL）の計算によって）情報を組み合わせてのFAを識別するデリバティブ（DMOX）、および3 pyridylcarbinylエステル（ピコリニル）。この方法は、未知のFAを精製する必要なしのFAを識別することができます。

標準の商業用混合物とセレウス菌から調製したFAMEのクロマトグラフィープロファイルを比較すると、他のFAのアイデンティティにするFA、ECLの計算、および仮説を飽和直鎖の同定を可能にします。分岐飽和のFA、イソまたはアンテイソのFAMEを、同じ数の炭素を有する直鎖飽和のFAに比べECLに一定の負のシフトを、表示します。不飽和のFAのFAMEをその分子イオンの質量によって検出され、対応する飽和のFAに比べECLにおける正のシフトをもたらすことができます。

FAの分岐位置及び不飽和のFAの二重結合の位置は、それぞれ、ピコリニルとDMOX誘導体の電子イオン化マススペクトルによって同定することができます。このアプローチは、すべての未知飽和の分岐を識別するEDのFA、不飽和直鎖状のFAおよびセレウス菌の抽出物から不飽和分枝状のFA。

概要

脂肪酸メチルエステル（FAME）、ガスクロマトグラフィー（GC）は、脂質の特性評価に不可欠な方法です。それは急速に分離し、短い抽出工程後の試料の様々な脂肪酸（FAS）を定量化します。メチルエステルの誘導体は、クロマトグラフィーカラムに向かって高度に揮発性の安定かつ不活性であり、それによってテーリングピークを回避します。クロマトグラフィーのプロファイルはいずれかの公開や標準に比較されるため、サンプルは、周知のFAで構成されている場合、それらの識別はかなり簡単です。加えて、様々なのFAの定量化のための較正標準の反復注射は、炎イオン化検出器（FID）1へのほぼ一定の応答を考えると、必要とされません。

FIDに加えて、質量分析（MS）検出のFAMEを確認するために情報の補完的なセットを提供します。 FAMEは、電子イオン化（EI）を使用して充電されたときしかし、得られるスペクトルは、常に目のために許可されていませんFA微細構造の電子識別。診断イオンが1を検出することが困難であり、ターゲットイオン存在量の特性変化は、質量スペクトルライブラリー2を使用することを防止する、機械に依存するので、例えば、位置分岐（ すなわち、分岐したメチル基）を予測することは困難です。もう一つの課題は、EIは、二重結合の移動が発生するため、二重結合の位置を特定することにあります。このように、二重結合の位置を変化させたFA異性体は、その質量スペクトルによって区別することはできません。幸いなことに、他のツールは、FAの同定のために開発されています。例えば、存在およびFASにおける二重結合のまたは分岐の位置は、等価な鎖長（ECL）3を計算することによって推測することができます。

他の誘導体化方法は、二重結合または分枝鎖のメチル基の位置に依存する異なる質量スペクトルをもたらします。 4,4-ジメチルオキサゾリン誘導体（DMOX）4 EASを可能に一価不飽和脂肪酸の二重結合の位置のyの識別。 3-pyridylcarbinylエステル（ピコリニルエステル）誘導体は、Fas 5分枝鎖メチルの場所の明確な同定を可能にします。核磁気共鳴（NMR）スペクトルは、構造的特徴1争う余地のない方法の必要に応じて、精製の複雑な方法を使用することなく、クロマトグラフィーの保持（ECL）および質量スペクトル（DMOXとピコリニル）情報は、ほとんどのFAの同定を可能にする合成。

いくつかのヒトおよび動物の病原体を含むバチルス属の細菌は、非常に多様なニッチにコロニーを形成することが可能であるため、広く環境6に分布しています。 バチルス属の中でも、FA組成物は、環境の変化（ 例えば 、増殖培地、温度の広い範囲に適応するためにFAパターンの変調を有する種の生態的地位に影響されますpHは、 等 ）7-9。そのため標準化された条件で成長中のバチルス属の種間FAパターンの相対的な均質性、FA組成物の決意は、 バチルス種を定義するために使用される本質的な基準の一つです。 バチルス属のユニークな属性は、ISOおよび環境条件への適応の重要な決定要因であることアンテイソ異性体間の比で12-17個の炭素10-12を含む分岐鎖のFAの豊富さです。 バチルス種はまた、不飽和脂肪酸の比率を変えることにより、環境変動に適応します。このようなセレウス菌などのいくつかの種では、2脂肪酸デサチュラーゼは、適応9で異なる役割を持つアルキル鎖13の異なる位置に二重結合を作成します。 バチルス属の例は、正確に二重結合の位置を識別し、FAは、分岐の重要性を示しています。収集しますively、 バチルス FAパターンの同定は、いくつかの有用な用途を有します。ここで、我々は、古典的なGC-MS分析の固有の限界を克服するバチルス FAパターン識別のための新規なGC-MSの方法を提案します。

この革新的なアプローチは、生の生物学的物質に直接使用し、既存の技術の組み合わせで構成することができます。保持時間（ECL）の情報と異なるのFA誘導体（FAME、DMOXとピコリ - エステル）の質量スペクトル。

当社は、以下のFA命名法を使用しています。 I、およびnは、それぞれISO、アンテイソメチル分枝、直鎖脂肪酸を示します。不飽和のFAは、Cによって指定された：Cであり、Dは、脂肪酸およびD中の炭素原子の数は、二重結合の数です。 Δxは 、二重結合は、カルボン酸末端から数えて、x番目の炭素-炭素結合上に位置する二重結合の位置を示しています。

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プロトコル

1.細菌培養

  1. LB寒天培地のプレートの表面上に、LB（ルリア-ベルターニ培地）中で30℃でインキュベート株の一晩培養物100μlを広げることによって菌（ バチルス・セレウス菌株 ATCC 14579）の芝生を準備します。 30℃で一晩プレートをインキュベートします。

2. ECL：等価チェーンの長さ

  1. 次のようにECLを計算します。 figure-protocol-1と：
    私、興味のある溶質;
    nは、溶質の前に溶出し、直鎖飽和脂肪酸メチルエステルの炭素数I。
    N + 1、溶質の後に溶出する直鎖飽和脂肪酸メチルエステルの炭素数I。
    RTI、RTN、RT（N + 1）上述のFAMEピークの保持時間。
    注：（標準の混合物を注入することにより直鎖飽和脂肪酸メチルエステルの保持時間を得るBAME）。

3. FAMEの調製および分析

  1. 脂質の脂肪酸を得るために、寒天プレートからコロニーを掻き取りにより採取細菌細胞とスクリューキャップとPTFEシールを有する10mlのガラス管に細菌を40mg（10 9の生存細胞に相当する新鮮重量）移します。
  2. 以下に詳述エステル結合方法14,15を経由してエステル交換反応を行います。
    1. 新鮮な細菌細胞にメタノール中0.2M KOHの5ミリリットルを加え、37℃で1時間インキュベートします。この反応は、脂質中のエステル結合を破壊し、脂肪酸メチルエステルを生成する、アルカリ性メタノリシスから成ります。
    2. pHを7.0に低下させるために1 M酢酸を1ml加えます。 pH試験片を用いてpHを確認してください。
    3. FAMEを抽出するためにヘキサンの3ミリリットルを追加します。
    4. 約200μLを得るために、きれいなチューブに上清（有機相）を移し、窒素の連続気流下、室温で蒸発させることによって集中します抽出物。インサート付きGCバイアルにサンプルを転送します。
    5. ガスクロマトグラフィー - 質量分析（GC-MS）システムに抽出物を注入します。

4. GC / MS条件

  1. キャピラリカラムZB-WAX（;直径0.25mmで、膜厚0.25μmの長さ30メートル）を備えたGC-MS機器にFAMEサンプルを注入します。
  2. （スプリットレスモードでの）注入口250°Cまで温度を設定します。 37センチメートル/秒の線速度で、キャリアガスとしてヘリウムを使用してください。 20℃/分の速度で190℃まで上昇し、2℃/分の速度で230℃の最終温度までさらに増加、1分間50℃のオーブン温度を保持します。
  3. MSについては、70 eVでの電子イオン化（EI）の質量スペクトルを記録し、50〜400原子質量単位（AMU）（2スキャン/秒）の間の総イオン電流の取得を設定します。
  4. 必要な場合には、同じ条件EXCEP下DMOXとピコリニル誘導体を注入次のように温度プログラムオーブンT：
    DMOX：50℃（1分）、20℃/分で210℃から2℃/分まで、240°C（5分）まで。
    ピコリニル：6°C（1分）、220℃まで20℃/分で250℃（20分）まで2℃/分。

FAME 16から5ピコリニルエステル準備

  1. 窒素の流れ（少なくとも10mgの乾燥物質）と第3のFAME抽出物を蒸発させ、乾燥ジクロロメタン1ml中に溶解します。
  2. テトラヒドロフラン中のカリウムターt-ブトキシドの1.0M溶液を準備します。
  3. ステップ5.2で作られた溶液0.1 mlにFAMEエキス、0.2ミリリットル3ピリジンメタノールを追加します。
  4. 密閉バイアル中で30分間、40°Cで溶液を加熱します。
  5. 室温に冷却した後、精製された脱イオン水（2mL、 材料表を参照）、ヘキサン（4 ml）を加えます。相を分離させ、ボルテックスで混合し、有機相を収集します。
  6. 博士Yその有機相が完全に透明になるまで無水硫酸ナトリウムを添加することによって。きれいなチューブにそれを転送します。その後、200μlに蒸発させます。インサート付きGCバイアルにサンプルを転送します。

FAME 17から6 DMOX準備

  1. 窒素（少なくとも10mgの乾燥材料）の流れと第3のFAME抽出物を蒸発させます。
  2. FAME乾燥抽出物を、2-アミノ-2-メチル-1-プロパノールの250ミリグラムを加えます。 、窒素で容器をフラッシュストッパーを追加し、190℃で一晩加熱ブロックに配置します。
  3. 室温まで冷却した後、精製された脱イオン水を試験管に3ミリリットルのジクロロメタンを追加し、5ミリリットル（ 材料表を参照してください）。
  4. 相分離のためにシェイクした後、水相を除去します。
  5. 5ミリリットルの水で有機相を洗浄します。相分離のためにシェイクした後、水相を除去します。
  6. 有機相が完全に明確であるとまでは無水硫酸ナトリウムを添加することによって、乾燥きれいなチューブにそれを転送します。 200μlの容量に達するまで、窒素気流下で蒸発させます。インサート付きGCバイアルにサンプルを転送します。

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結果

細菌細胞からFA特定の戦略は、図1に示されています。各ステップは、補完的なスペクトル情報またはクロマトグラフィー保持に関する情報を提供します。ステップ1は、標準液を用いた予備FA識別で構成されています。ステップ2は、暫定的に製品を識別するために、FAME EIスペクトルとそのECLの解釈を可能にします。ステップ3は、分岐鎖-のFAで正確な分岐位置を特定します。最後に、ステップ4は、不飽和のFA中の二重結合の正確な位置を特定します。

FAMEとECL

BAME混合物は、私たちは、直鎖飽和脂肪酸（N17でN12）のシリーズを識別することができ、いくつかのメチル脂肪酸（I15、A15、I16、I17）を分枝状。しかし、 セレウス菌に特有の非常に少数のFAはdeveloを正当化する、私たちの...

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ディスカッション

表1に示したのFAクロマトグラムプロファイルは、寒天プレートの表面上に成長させたB.セレウス ATCC 14579に対応します。細菌が同じ温度8で通気し、液体培地中で増殖させた場合にも同様のプロファイルが得られました。液体培地中で増殖させた細菌の場合には、細菌バイオマスの増殖培地の遠心分離によって回収し、成長条件8,19によって以前に記載されたプロトコルに従って洗浄することができます。 B.セレウスによって生成種々のFAの同定は、低温7,9における成長のために必要ないくつかの遺伝子の変異した株で検出されるのFAの割合の微細な変化を可能にしました。

通常、ECLを（等温温度制御を有する炉を使用して）一定の温度20で決定された調整後の保持時間のログ値を使用して計算されます。ここでは、理由pまでの非等温オーブンの使用関心のFAMEの最適化された分離をermit、計算方法は、以前に線形保持指標

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開示事項

著者らは、競合する金銭的利益はないと宣言している。

謝辞

著者は原稿の改訂のための彼の技術サポートのために、とレイチェルKopecにトーマスMisonに感謝しています。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
GC/MS島津QP2010
キャピラリーカラム ZB WAXPhenomenex7HG-G007-1130 m x 0.25 mm x 0.25  &マイクロ;m
メタノール LichrosolvVWR1.06018.2500
水酸化カリウムAldrich P1767
THFHipersolv Chromanorm28559.320
ジクロロメタンHipersolv Chromanorm23373.320
ヘキサンHipersolv Chromanorm24575.320
3-ピリジネメタノールAldrichP6-680-7
カリウム tertiobutoxideAldrich156671
2-アミノ-2-メチル-1-プロパノールA-9879
MilliQ アカデミックミリポアZMQS50001
バクテリア酸メチルエステル (BAME) ミックスSigma-Aldrich47080-U Supelco
製作所

参考文献

  1. Christie, W. W., Han, X. Lipid Analysis 4th Edition. , Oily press. (2010).
  2. HÜbschmann, H. -J. Handbook of GC-MS: fundamental and application. Third edition. , Wiley-vch. (2015).
  3. Sasser, M. Identification of Bacteria by Gas Chromatography of Cellular Fatty Acids. MIDI Technical note. 101, 1-6 (1990).
  4. Spitzer, V. Structure analysis of fatty acids by gas chromatography - Low resolution electron impact mass spectrometry of their 4,4-dimethyloxazoline derivatives - A review. Prog Lipid Res. 35 (4), 387-408 (1996).
  5. Harvey, D. J. Advances in lipid methodology. Volume 1. Christie, W. W. , Oily press. Dundee. 19-80 (1992).
  6. Diomande, S. E., Nguyen-The, C., Guinebretière, M. -H., Broussolle, V., Brillard, J. Role of fatty acids in Bacillus environmental adaptation. Front Microbiol. 6, (2015).
  7. Brillard, J., et al. Identification of Bacillus cereus Genes Specifically Expressed during Growth at Low Temperatures. Appl Environ Microbiol. 76 (8), 2562-2573 (2010).
  8. de Sarrau, B., et al. Influence of Anaerobiosis and Low Temperature on Bacillus cereus Growth, Metabolism, and Membrane Properties. Appl Environ Microbiol. 78 (6), 1715-1723 (2012).
  9. Diomandé, S. E., et al. Involvement of the CasK/R two-component system in optimal unsaturation of the Bacillus cereus fatty acids during low-temperature growth. Int J Food Microbiol. 213, 110-117 (2015).
  10. Berkeley, R. C. W., Heyndrickx, M., Logan, N., De Vos, P. Applications and Systematics of Bacillus and Relatives. Berkeley, R. C. W. , Blackwell Science Publ. 1-7 (2002).
  11. Kämpfer, P. Limits and Possibilities of Total Fatty Acid Analysis for Classification and Identification of Bacillus Species. System. Appl. Microbiol. 17 (1), 86-98 (1994).
  12. Kaneda, T. Fatty-acids of genus bacillus - example of branched-chain preference. Bacteriol Rev. 41 (2), 391-418 (1977).
  13. Chazarreta Cifre, L., Alemany, M., de Mendoza, D., Altabe, S. Exploring the Biosynthesis of Unsaturated Fatty Acids in Bacillus cereus ATCC 14579 and Functional Characterization of Novel Acyl-Lipid Desaturases. Appl Environ Microbiol. 79 (20), 6271-6279 (2013).
  14. Sasser, M., et al. Identification of Bacillus anthracis from culture using gas chromatographic analysis of fatty acid methyl esters. J AOAC Int. 88 (1), 178-181 (2005).
  15. Schutter, M. E., Dick, R. P. Comparison of fatty acid methyl ester (FAME) methods for characterizing microbial communities. Soil Sci Soc Am J. 64 (5), 1659-1668 (2000).
  16. Destaillats, F., Angers, P. One-step methodology for the synthesis of FA picolinyl esters from intact lipids. J Am Oil Chem Soc. 79 (3), 253-256 (2002).
  17. Fay, L., Richli, U. Location of double-bonds in polyunsaturated fatty-acids by gas-chromatography mass-spectrometry after 4,4-dimethyloxazoline derivatization. J Chromatogr. 541 (1-2), 89-98 (1991).
  18. Zhang, J. Y., Yu, Q. T., Liu, B. N., Huang, Z. H. Chemical modification in mass spectrometry IV-2-alkenyl-4,4-dimethyloxazolines as derivatives for the double bond location of long-chain olefinic acids. Biol Mass Spect. 15 (1), 33-44 (1988).
  19. de Sarrau, B., et al. Unsaturated fatty acids from food and in the growth medium improve growth of Bacillus cereus under cold and anaerobic conditions. Food Microbiol. 36 (2), 113-122 (2013).
  20. Miwa, T. K., Mikolajczak, K. L., Earle, F. R., Wolff, I. A. Gas chromatographic characterization of fatty acids.Identification constants for mono- and dicarboxylic methyl esters. Anal Chem. 32 (13), 1739-1742 (1960).
  21. van Den Dool, H., Kratz, P. A generalization of the retention index system including linear temperature programmed gas-liquid partition chromatography. J Chromatogr A. 11, 463-471 (1963).
  22. Stransky, K., Jursik, T., Vitek, A. Standard equivalent chain length values of monoenic and polyenic (methylene interrupted) fatty acids. J High Res Chromatogr. 20 (3), 143-158 (1997).

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