透過処理と無傷の細胞でミトコンドリア機能を評価するために高解像度呼吸計測

Summary

高解像度の呼吸計測は、ミトコンドリアの酸素消費量を決定するために使用されます。これは、ミトコンドリア呼吸鎖複合体」（I-IV）呼吸数、最大のミトコンドリアの電子伝達系の能力、およびミトコンドリア外膜の完全性を決定するための簡単な技術です。

Abstract

高分解能オキシグラフは、生体サンプル(無傷および透過処理された細胞、組織、または単離されたミトコンドリア)において、非常に高い分解能と感度を持つ密閉チャンバーシステムにおける細胞の酸素消費量を測定するための装置です。高解像度のオキシグラフ装置には2つのチャンバーが装備されており、ポーラログラフ式酸素センサーを使用して酸素濃度を測定し、各チャンバー内の酸素消費量を計算します。酸素消費率はソフトウェアを使用して計算され、細胞数あたりのピコモル/秒で表されます。各高分解能オキシグラフチャンバーには注入ポート付きのストッパーが含まれているため、原形質膜透過化の効果的かつ最適な濃度を決定するための基質アンカプラー阻害剤滴定や界面活性剤滴定プロトコルに最適です。この技術は、さまざまな細胞タイプの呼吸の測定に適用でき、ミトコンドリアの品質と完全性、およびミトコンドリアの呼吸電子伝達システムの最大容量に関する情報も提供します。

Introduction

ミトコンドリアは、特に、アデノシン三リン酸（ATP）を生成するために酸素を使用することにより、細胞エネルギー代謝において重要な役割を果たす。それらは、細胞死を、いくつかのヒト疾患に関与しています。ミトコンドリアの酸化的リン酸化（OXPHOS）の酸素消費量とATP合成に電子伝達鎖に沿った電子の移動を組み合わせます。ミトコンドリアのトリカルボン酸（TCA）サイクルは、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（NADH）およびフラビンアデニンジヌクレオチドなどのエネルギーの豊富な化合物（FADH _2）へのタンパク質、炭水化物と脂肪の変換に関与しています。ミトコンドリア内膜に位置NADH及びFADH ₂の電子その後（私はIVに）呼吸電子伝達鎖のタンパク質複合体に転写されます。また、他の二つの酸化還元経路は、トランスポート・チェーンを電子するために電子を転送することができた：i）ミトコンドリアの電子伝達フラビンタンパク質（ETF）の内側水戸のマトリックス面に配置されています脂肪酸β酸化からchondrial膜、および消耗品の電子;及びii）ジヒドロキシアセトンリン酸とグリセロホスフェートを酸化及びミトコンドリアの電子伝達鎖に電子を供給するミトコンドリアグリセロリン酸デヒドロゲナーゼ。複合体IV（​​最終的な電子受容体）は、水2分子に酸素を変換し、一つの酸素分子に電子を転送します。私はIVに呼吸電子伝達鎖複合体からの電子の移動は、ミトコンドリア内膜を横切る電気化学的勾配を確立する間腔へのミトコンドリアマトリックスからのプロトンの流れに結合されています。その後、ミトコンドリア複合体V（ATP合成酵素）が戻ってミトコンドリアマトリックスへの水素イオンを往復し、ATP分子を合成します。 OXPHOS機能を得ることができる種々の技術および種々のミトコンドリアの呼吸状態を用いて、in vivoおよびin vitroで評価することができます。単離ミトコンドリアにおける次respiratoRYの状態を測定することができた：i）基底ミトコンドリア呼吸（状態1）ミトコンドリア呼吸鎖複合体の特異的基質を添加した後、ii）の酸素消費量（状態2）、iii）の最大のミトコンドリアの酸素消費の飽和濃度の添加後アデノシン二リン酸（ADP）（状態3）と、ATPに変換ADP消費（後iv）の安静時の呼吸）（状態4）。無傷の細胞では、次の呼吸の状態を測定することができた：i）基底細胞性酸素消費内在性基質及びADPの存在下で、ⅱ）オリゴマイシンの存在下での基底の細胞の酸素消費量（オリゴマイシン非感受性呼吸）とオリゴマイシン感受性の呼吸（ATPターンオーバー）アンチマイシンAおよびロテノンを添加した後、III）FCCP脱共役呼吸、およびiv）非ミトコンドリア呼吸。透過性細胞、電子伝達系複合体およびADPを添加することができ、最大の複雑な依存性呼吸数秒の特異的基質でUCHのような複雑なI-は、II-およびIV-依存呼吸数を測定することができます。

細胞呼吸の測定は、複合体I-IV、ミトコンドリアの完全性およびエネルギー代謝^1、2、3に固有のミトコンドリア呼吸容量重要な洞察を提供しています。高精度、分解能と感度のミトコンドリアの酸素消費量の測定を可能にする装置の一つは、高解像度oxygraph ⁴です。高解像度oxygraph装置は、注入ポートを有する2つのチャンバを含み、各チャンバはポーラログラフ酸素センサを備えています。携帯電話または単離されたミトコンドリア懸濁液は、呼吸計で連続的に攪拌されています。ミトコンドリア機能を評価するために、ミトコンドリア複合体活性の基質および阻害剤は、標準的なプロトコールに従って添加することができます。基質および阻害剤は、注射INTにより滴定することができますoxygraphのチャンバーO、および酸素消費速度は、ソフトウェアを用いて計算し、細胞数当たり毎秒ピコモルとして表されます。高解像度の呼吸計測は、感受性の増加や、無傷または透過性細胞のような生物学的サンプル数が少ないと連携する機能など、伝統的な従来のポーラログラフ酸素電極装置に比べていくつかの利点を提供しています。さらに、各デバイスは、2つのチャンバを含み、呼吸数、酸素濃度の比較のために同時に記録することができます。高解像度oxygraphは、従来のポーラログラフィー酸素電極装置に比べ機器室からの酸素の減少漏れの利点を有します。最近、細胞の酸素消費量を測定するために開発された他の装置は、96ウェルの細胞外フラックス分析器⁵です。細胞外フラックスアナライザーは、蛍光の代わりにポーラログラフセンサーが装備されています。細胞外の利点高解像度oxygraph Iである）は、II）は、24とハイスループットスクリーニングのために96ウェルプレート中に酸素消費量を測定することが可能であり、大部分が自動化されたデバイスであると比べてフラックス分析器は、従って、生物学的サンプルの低い量を必要とします及びiii）細胞の解糖フラックスの追加の測定が可能です。高解像度oxygraphと比較して細胞外フラックスアナライザーの欠点は、i）は、非再利用可能であり、装置のと、蛍光プレートなどの消耗品のコスト高、であり、およびii）アッセイ/ウェル当たりのみ4つの化合物は、注射可能です、したがって、システムは、基板脱共役剤 - 阻害剤滴定プロトコルのための現実的ではありません。

本研究では、我々は、ミトコンドリア呼吸を決定するために、高解像度の呼吸計測を使用します。細胞の酸素消費量の実験のために、細胞をCOMPLEXEに電子を供給するための外因性ADPおよび被酸化性ミトコンドリア基質の進入を可能にするために透過処理されています呼吸器系のS。このアプローチは、無傷の細胞（多くの基質が細胞非透過性である）に比べて明確な利点である個々のミトコンドリア複合体の呼吸能力の解剖を可能にします。しかし、細胞膜の透過性は、細胞外培地で平衡化され、サイトゾルおよび細胞外空間とメディア（サイトゾル溶質から洗い出さ）と細胞内空間の組成物との間の障壁を破壊します。無傷の細胞上の透過性細胞の欠点の一つは、洗浄剤の過剰量は、細胞透過の際に使用される場合、ミトコンドリア外膜が損傷することができることです。無傷細胞において、基礎、結合および無傷の細胞の脱共役呼吸を測定することができます。この方法は、統合された細胞中の呼吸機能を再現し、また、最大のミトコンドリア電子transpoに関する情報を提供する、外因性の基質およびADPを添加せずに無傷の細胞の酸素消費量を評価しますRT容量^6、7。透過性細胞上無傷の細胞の利点の一つは、細胞環境が破壊されておらず、ミトコンドリアは、細胞の全構成要素に接触していることです。細胞の原形質膜を透過するために、例えば、ジギトニンなどの界面活性剤は^、8使用されています。ジギトニンの過剰な量が使用される場合は、ミトコンドリア外膜の完全性が損なわれる可能性があります。透過性細胞で損なわれないミトコンドリア外膜の完全性を確認するために、ジギトニン滴定は、細胞透過性のための最適濃度を決定するために行われます。これらの実験のために、細胞を、呼吸培地中に再懸濁し、ジギトニン濃度は、ミトコンドリアの基質及びADPの存在下での呼吸計測により滴定され、呼吸速度を測定します。無傷の、非透過性細胞の呼吸はmitochoの存在下で刺激されていませんndrial基板とADP。しかし、その後の段階的なジギトニン滴定は、原形質膜の漸進的な透過性をもたらすであろうし、最適なジギトニン濃度が得られます。これは、完全な透過への呼吸までの増加により示されています。ミトコンドリアの品質と外膜の完全性は、外因性のシトクロムc ^2,9を追加することによって確認することができます。シトクロムcは、ミトコンドリア電子伝達系^10、11、12の12 kDaの電子運搬タンパク質です。これは、複合体IVへの複合体IIIから電子を運ぶ、ミトコンドリアの膜間空間に局在し、酸素消費に関与しています。ミトコンドリアの外膜が損傷されると、シトクロムcが放出され、ミトコンドリアの酸素消費量が低減されます。外因性のシトクロムcの添加時に、ミトコンドリアの呼吸の任意の増強は、指標となりますミトコンドリア外膜を破壊しました。

透過処理した細胞では、ミトコンドリア複合体活性の基質および阻害剤は、さまざまなプロトコル^3、9以下の追加されます。例えば、ミトコンドリア複合駆動型呼吸率を調べるために、以下のプロトコルを使用することができます。細胞の透過処理した後、最初の複合体Iは呼吸鎖の基質としてNADHを生成し、その後、ADPがATP（状態3、アクティブに変換するために追加された複雑なIの活性化を引き起こす基板リンゴ酸およびグルタミン酸によって刺激され、複合体I-依存呼吸）。安定した信号が到達した後、ロテノンは、（ミトコンドリア複合体I阻害剤）ロテノンはFADH ₂にコハク酸が続いている複雑なIを阻害するために、複雑なII（状態3、活性複合体II依存呼吸）を活性化するために投与されます。複雑なIV-依存呼吸を測定するために、最初の複合体III依存性呼吸は、アンチマイシンA（ミトコンドリア複合体III阻害剤）を添加することにより阻害されます。その後、複雑なIV-依存呼吸はアスコルビン酸とtetramethylphenylendiamine（TMPD）を投与することにより刺激されます。 TMPDは、呼吸バッファーで自動酸化することができ、したがって、最大錯体IV依存性の呼吸速度（状態3）のアジ化ナトリウム、ミトコンドリア複合体IVの阻害剤の添加前および後の呼吸速度を減算することにより計算されます。呼吸実験は、コントロール（非刺激細胞）としてパラレル一oxygraphの二つのチャンバ、刺激された細胞を含む、他の中で行うことができます。明らかに、細胞は、それらの酸素消費はoxygraph室で測定される前に薬剤が、ミトコンドリアの機能に影響を与えて、 例えば 、様々な方法で前処理することができます。このプロトコルは、個々のミトコンドリア呼吸鎖複合体の機能的な検査を可能にします。また、一方が最大のADP刺激性を測定することができます透過性細胞の呼吸（状態3）、パルミチン酸の形で外因性の脂肪酸を用いて。 （1：1のモル比のパルミテート：BSA 6）このプロトコルでは、パルミチン酸ナトリウムの濃縮ストックを超脂肪酸フリーのウシ血清アルブミン（BSA）と結合しています。その後、最初のジギトニンとミトコンドリアの呼吸で浸透している細胞はカルニチンを添加することによって評価され、ADP（状態3、最大呼吸）を添加したパルミチン酸。そして、オリゴマイシン、状態4（状態40）を模倣するために追加され、呼吸調節比（RCR値）状態3 /状態40のように計算されます。 β酸化が（TCAサイクルに入る）アセチル-CoAの産生およびFADH ₂及びNADHの生成を促進するの電子は、電子伝達フラビンタンパク質及びβヒドロキシアシル-CoAデヒドロゲナーゼによって電子伝達鎖に渡されます。ミトコンドリア脂肪酸代謝の中心であり、パルミチン酸-BSAプロトコルを記載する脂肪を調べる研究者によって使用することができTY酸酸化。無傷細胞において、活性化剤およびミトコンドリア複合体活性の阻害剤は、異なるプロトコル^6、9以下を添加します。これらの実験のために、外因性基質の非存在下での非透過性細胞の第1の酸素消費量は、（呼吸速度をリン酸化）を測定します。そして、非リン酸化呼吸数は、ミトコンドリアATP合成酵素の阻害剤であるオリゴマイシンの添加後に測定します。その後、プロトノフォアカルボニルシアニドp型trifluoromethoxyphenylhydrazone（FCCP）を種々の濃度で投与され、最大のミトコンドリアの脱共役呼吸数を測定します。例えば、FCCPとしてProtonophoresは化学浸透勾配を放散するプロトンの受動的な動きを可能にする、内膜のプロトン透過性の増大を誘導することができます。プロトン透過性の増加は、酸化呼吸（無ATP産生）を脱共役し、Oの増加を誘導しxygen消費。その後、ロテノン及びアンチマイシンAは、ミトコンドリア呼吸を阻害するために添加され、そして非ミトコンドリア呼吸は、他のすべての呼吸数から減算されます。

酸素消費速度は、IO ₂ [ピコモルX秒^{-1×10 -6}細胞（閉酸素室で）体積固有の酸素フラックスを割ることによって計算される（細胞百万個当たりの酸素の流れ）、JV、Oのように表すことができます。細胞チャンバ内の細胞濃度（体積当たりの細胞数[10 ⁶細胞∙ミリリットル^1]）15によって₂ [ピコモルのx秒^-1のxミリリットル^-1]。細胞質量固有の酸素フラックス、JO ₂ [X秒ピコモル^-1 Xミリグラム^-1]は、セル当たりの流れ、IO ₂ [ピコモルのx秒^{-1×10 -6}細胞】細胞当たりの質量で割った、[MG∙10 ⁶セル];または体積固有フラックス、JV、O ₂ [ピコモルのx秒^-1のxミリリットル^-1]、体積当たりの質量で割った値梅【MG∙ミリリットル^1]。 JO _2は、細胞タンパク質、乾燥重量または細胞体積あたりの酸素流量です。

高解像度の呼吸計測を用いた本研究では、我々は私を決定するためのプロトコルを記述）は、完全な携帯形質膜透過性（ジギトニン滴定アッセイ）のための最適なジギトニン濃度、外因性のシトクロムcを用いて、ⅱ）ミトコンドリア外膜の完全性、iii）はミトコンドリア呼吸鎖複合体I外因性基質を添加することなく、外因性ADPとミトコンドリア呼吸鎖基質、および無傷の細胞のiv）の基礎、結合され、最大の脱共役呼吸（最大電子輸送容量）の存在下でのジギトニン透過処理HepG2細胞における、IIおよびIV最大呼吸数そしてADPは、統合された細胞内の呼吸機能を再現します。

Protocol

1.細胞培養

1. 培養ヒト肝癌のHepG2セル⁶から25cmでインキュベーター（5％CO 2中37℃で10％熱不活化ウシ胎児血清（FBS）および1％ペニシリン-ストレプトマイシンを含有するダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）中で²細胞培養フラスコ_2、95％空気）（播種密度：1×10 ⁶細胞あたり25 cm ²の細胞培養フラスコ、37℃インキュベーター中でのインキュベーション時間：48時間、密集度でセル密度：25センチメートルあたり4-5×10 ⁶細胞²細胞培養フラスコ）。
2. 細胞は、90％〜95％コンフルエントである場合に実験を行います。

ポーラログラフ酸素センサーの2.高解像度の呼吸計測キャリブレーション

1. ピペット2.1 oxygraph室に呼吸バッファーmlの安定酸素フラックス信号まで1時間37℃でチャンバー内に存在する磁気撹拌棒（700 rpm）を用いて連続的にバッファをかき混ぜますポーラログラフ酸素センサが得られます。
   注：各oxygraph室対策の酸素濃度内のポーラログラフ酸素電極と各チャンバ内の酸素消費量（フラックス）を計算します。酸素濃度と酸素消費速度（フラックス）は、データ収集および分析のためのソフトウェアを使用してコンピュータにオンラインでリアルタイムに表示されます。
2. 製造業者のプロトコル¹⁴に従ってポーラログラフ酸素センサのエアキャリブレーションを実行します。
   注意：空気飽和実験温度で培地中の呼吸媒体と酸素濃度のポーラログラフの酸素センサーの較正は一度だけ、毎日午前中に行われます。その後、培地を新鮮な呼吸培地に再懸濁チャンバ、細胞から除去することができるoxygraphチャンバーに添加し、呼吸数を測定します。最初の実験の後、チャンバを洗浄することができ、実験の付加的な一連のTで行うことができますさらに校正せずに彼と同じチャンバー。

細胞を計数する接着細胞の3トリプシン処理、

1. 実験の日に、25cm ²の細胞培養フラスコからDMEMを吸引します。
2. リン酸緩衝生理食塩水（PBS）5mlで培養フラスコにおける細胞培養単層をすすぎます。
3. ピペット0.5培養フラスコ中の細胞単層に（37℃の水浴中で37℃に予熱）トリプシン溶液を25mg / mlのmlのインキュベーター（5％CO ₂中で37℃で5分間インキュベート、95％空気）。
4. DMEMは、細胞培養フラスコ中で剥離した細胞に10％FBSを含有し、ピペッティングにより細胞を懸濁するピペット5 mlです。
5. 室温で350×gで5分間、15mlの遠心チューブと遠心分離機に再懸濁した細胞を移し、上清をデカント。
6. 呼吸バッファ^13（T できる1）1mlに細胞ペレットを再懸濁します。
I>細胞カウンターを用いて細胞をカウントし、1×10 ⁶細胞/ mlの最終濃度に呼吸バッファに再懸濁。細胞呼吸率は細胞数に正規化されますので、正確かつ精密な細胞カウンターで細胞を数えます。

4.高解像度呼吸計測

1. 空気校正（2.1~2.2ステップ、一度だけ、毎日行われる）後、oxygraphのチャンバーから呼吸培地を吸引し、チャンバーにステップ3.7から細胞懸濁液（1×10 ⁶細胞/ ml）の2.1ミリリットルを追加します。
2. ストッパーの挿入によってoxygraph室を閉じます。
3. 連続的に37℃のチャンバー内に存在する磁気撹拌棒（700 rpm）を用いて細胞を攪拌し、安定した酸素流量信号が達成されるまで、5〜10分間、細胞呼吸を記録します。
   注：酸素濃度と酸素流量信号は、データ収集および分析のためのソフトウェアを用いてコンピュータでオンラインリアルタイムで表示されていますS = "外部参照"> 14。
4. その後、次のプロトコルを使用して、ストッパのチタン注入ポートを介してミトコンドリアの呼吸のための基質と阻害剤を注入します。

呼吸計測によって無傷の細胞における5ジギトニン滴定

1. 手順プロトコルの4.3から4.1に記載の手順に従ってoxygraph室含む細胞懸濁液（1×10 ⁶ / ml）を準備します。
2. 注射器を用いてチャンバストッパーのチタン注入ポートを介して細胞懸濁液を含むoxygraph室に0.2 mMのロテノン（0.2μM）「注意」の2μLを注入し、安定した酸素フラックス信号が達成されるまで5〜10分間、細胞呼吸を記録。
   注：以下の手順のすべての注射は注射器を使用してストッパーのチタン注入ポートを介して実行されます。ロテノンの添加は任意である（これは、逆電子流を阻止する）およびジギトニン滴定実験のために省略することができ、参照ステップ6.3。
3. oxygraph室に1 Mコハク酸（10 mM）の20μlのを注入し、安定した酸素フラックス信号が達成されるまで5〜10分間、細胞呼吸を記録。
4. oxygraph室に0.5 M ADP（2.5 mM）の10μlのを注入し、安定した酸素フラックス信号が達成されるまで5〜10分間、細胞呼吸を記録。
5. oxygraph室に2mMのジギトニン（2μM）の2μLを注入し、安定した酸素信号が達成されるまで2-5分間細胞呼吸を記録。
6. 再びジギトニンoxygraph室に2 mMと2μLを注入し、安定した酸素信号が達成されるまで2-5分間細胞呼吸を記録。
   注：細胞へのジギトニンの段階的添加は、細胞の酸素消費量の増加を誘発し、酸素流量信号が増大します。
7. 室内への2mMのジギトニン段階的に（2-4μM各ステップ）の2-4μLを注入し続けます。各ステップの後2〜5メートル細胞呼吸を記録安定した酸素流量信号が達成されるまでです。
   注：酸素流量信号が最大レベルに到達し、ジギトニンのさらなる注射が呼吸速度を増加させないときジギトニン注入を停止します。読者は自分の試薬および使用を使用して、自分の研究室で最適なジギトニン濃度を決定する必要がありますステップ6.2と彼らの実験のために、以下のプロトコルの7.2で最適なジギトニン濃度を得ました。

シトクロムC：ミトコンドリア外膜インテグリティの6評価

1. 手順プロトコルの4.3から4.1に記載の手順に従ってoxygraph室含む細胞懸濁液（1×10 ⁶ / ml）を準備します。
2. 細胞懸濁液（1×10 ⁶ / ml）を含むoxygraph室に8 mMのジギトニン（8μM）の2μLを注入し、5分間、細胞を透過性。
3. oxygraph室に1 Mコハク酸（10 mM）の20μlのを注入し、携帯respiratを記録安定した酸素フラックス信号が達成されるまで、5〜10分間イオン。
4. oxygraph室に0.5 M ADP（2.5 mM）の10μlのを注入し、安定した酸素フラックス信号が達成されるまで5〜10分間、細胞呼吸を記録。
   注：細胞へのADPの添加は、複合体Iを刺激し、酸素消費量の増加を誘発し、酸素流量信号が増加し、安定化するであろう。
5. oxygraph室に4mMのシトクロムc（10μM）の5μLを注入し、安定した酸素フラックス信号が達成されるまで5〜10分間、細胞呼吸を記録。
6. 最後に、4 mg / mlでオリゴマイシン（2 / mlの）の1μLを注入し、安定した酸素フラックス信号が達成されるまで、細胞呼吸を記録。

透過処理したHepG2細胞の7最大ADP-刺激呼吸（状態3）

1. 手順プロトコルの4.3から4.1に記載の手順に従ってoxygraph室含む細胞懸濁液（1×10 ⁶ / ml）を準備します。
2. 細胞懸濁液を含むoxygraph室に8 mMのジギトニン（8μM）の2μLを注入し、5分間、細胞を透過性。
3. リンゴ酸の0.8 M（5ミリモル）の12.5μlのとoxygraph室へのグルタミン酸の2 M（10 mM）の10μlのを注入します。レコードの細胞呼吸安定した酸素流量信号が達成されるまで。
4. oxygraph室に0.5 M ADP（2.5 mM）の10μlのを注入し、酸素フラックス信号が増加するまで、細胞呼吸を記録し、安定化させます。
   注：細胞へのADPの添加は、酸素消費量の増加と増加する酸素フラックスシグナルを誘発します。
5. oxygraph室に0.2 mMのロテノン（0.2μM）「注意」の2μLを注入し、酸素フラックス信号が減少するまで、細胞呼吸を記録し、安定化させます。
6. その後、oxygraph室に1 Mコハク酸（10 mM）の20μlのを注入し、酸素フラックス信号が増加するまで、細胞呼吸を記録そして、安定します。
7. そして、oxygraph室に5 mMのアンチマイシンA（5μM）「注意」の2μLを注入し、酸素フラックス信号が減少するまで、細胞呼吸を記録し、安定化させます。
8. その後、0.8 mMのアスコルビン酸（1ミリモル）の2.5μLを注入し、直後oxygraph室に0.2 mMのTMPD（0.25ミリモル）の2.5μLを注入し、酸素フラックス信号が増加するまで、細胞呼吸を記録し、安定化させます。
9. 最後にoxygraph室に1 Mアジ化ナトリウム（5 mM）の「警告」の10μLを注入し、酸素フラックス信号が減少するまで、細胞呼吸を記録し、安定化させます。

無傷の細胞の8酸素消費量

1. 手順プロトコルの4.3から4.1に記載の手順に従ってoxygraph室含む細胞懸濁液（1×10 ⁶ / ml）を準備します。
2. 細胞懸濁液のANを含むoxygraph室に4 mg / mlでオリゴマイシン（2 / mlの）の1μLを注入します安定した酸素フラックス信号が達成されるまで、細胞呼吸を記録dは。
3. その後oxygraph室にFCCPの0.2 mMの（0.1μM）「注意」の1μLを注入し、酸素フラックス信号が増加するまで、細胞呼吸を記録し、安定化させます。
4. oxygraph室にFCCPの0.2 mMの（0.4μM）の3μLを注入し、さらに酸素フラックス信号が増加するまで、細胞呼吸を記録し、安定化させます。
5. その後、酸素流量信号がその最大レベルであり、更なる増加に達するまでoxygraph室に0.2〜1 mMのFCCP（チャンバー内の0.1μM2への最終濃度）の1-3μLを注入することにより、0.1〜0.3μmでステップでFCCPを滴定し、減少を開始します。
   注：酸素信号が最大レベルに達すると減少開始時にFCCPを注入停止します。
6. その後、チャンバー内に0.2 mMのロテノンの2μL（0.2μM）および5 mMのアンチマイシンA（5μM）の2μLを注入します。レコード呼吸トンまで彼酸素フラックス信号が減少し、安定化します。

Results

ジギトニン滴定実験：携帯透過処理のための最適なジギトニン濃度の決意

ジギトニン滴定は、HepG2細胞の透過化のための最適濃度を決定するために行われます。これらの実験のために、ジギトニンがロテノン、コハク酸（ミトコンドリア複合体II基板）とADPの飽和量の存在下で無傷の細胞中で滴定され、呼吸数、ベースライン時とそれぞれの後に測定された（複合体II-依存状態3を誘導します）滴定（ 図1Aおよび1B）。この実験の結果は、ジギトニンの非存在下で、細胞の呼吸が非常に低く、無傷の非透過性細胞の呼吸は、ミトコンドリアの基質及びADPの存在下で刺激されていないことを示しています。しかし、ジギトニンの段階的添加の際に、携帯原形質膜は、透過性とmitochonされますコハク酸とADPが細胞に入るときdrial呼吸（複合体II-依存状態3）が完全な透過性にまで増加します。結果は8-12μMのジギトニン濃度の透過性は...

Discussion

本プロトコルの目的は、ミトコンドリア呼吸鎖複合体」（I-IV）呼吸数、最大のミトコンドリアの電子伝達系の能力およびミトコンドリア外膜の完全性を測定するための高解像度呼吸計測を使用することでした。

現在のプロトコル内のいくつかの重要なステップがあります。まず、細胞の酸素消費速度は、通常、細胞の数に正規化される（ピコモル/ [セルの秒x個]）。したがって、細胞の酸素消費量を監視する前に、細胞数の正確で信頼性の高い測定を可能にする装置を使用することが重要です。現在のプロトコルでは、自動セルカウンターは、（材料のプロトコルとテーブルのステップ3.7）を使用されてきました。特に透過性細胞における第二の重要なステップは、細胞を透過処理した呼吸バッファの選択は（プロトコルのステップ3.6）に再懸濁されています。携帯透過性はintracellulaの損失を誘導することができるので、r個のイオンが、透過性の間に使用される培地は、細胞内環境と互換性があることが非常に重要です。したがって、呼吸バッファは、細胞内および細胞外環境（ 表^1）13...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
ADP	Sigma	A 4386	Chemical
Antimycin A	Sigma	A 8674	Chemical, dissolve in ethanol
Ascorbate	Merck	1.00127	Chemical
BSA	Sigma	A 6003	Chemical
FCCP	Sigma	C 2920	Chemical, dissolve in ethanol
Countess automated cell counter	サーモフィッシャーサイエンティフィック	n/a	自動細胞計数装置
シトクローム c	シグマ	c 7752	化学
Digitonin		Σ D 5628	化学、DMSO に溶解
DMEM	Gibco	31966021	中
EGTA	fluka	3779	化学
FBS	Gibco	26010-074	中成分
グルタミン酸	シグマ	G 1626	ケミカル
HEPES	シグマ	H 7523	ケミカル
KCl	メルク	1.04936	ケミカル
KH2PO4	>Merck	1.04873	ケミカル
K-ラクトビオネート	Σ	L 2398	ケミカル
MgCl2	シグマ	M 9272	ケミカル
O2k-コア: オキシグラフ-2k	Oroboros Instruments	10000-02	高解像度呼吸測定器
オリゴマイシン		Sigma O 4876	化学、エタノールに溶解
ペニシリン-ストレプトマイシン	Gibco	15140122	化学
アジ化ナトリウム		Σ S2002	化学
ロテノン	ΣR	8875	化学、エタノール
に溶解コハク酸	シグマ	S 2378	化学
タウリン	シグマ T	8691	化学
TMPD	シグマ	T 3134	化学
トリプシン	シグマ	T 4674	化学