ウイルスまたは細胞外小胞は、表面抗原を認識する抗体に結合した15nmの磁性ナノ粒子で免疫捕捉されました。捕捉されたビリオンまたは小胞は、他の表面抗原に対する蛍光抗体で標識されました。得られた複合体を高磁場中で分離し、蛍光でトリガーされる従来のフローサイトメーターで分析しました。
この記事について
サマリー
要約
細胞は小さな細胞外小胞(EV)を周囲の培地に放出します。ウイルスに感染すると、細胞は一部のEVと同じサイズのビリオンも放出します。ビリオンとEVはどちらも、それらを生成した細胞のタンパク質を運び、抗原的に不均一です。その多様性にもかかわらず、ウイルスとEVはどちらも主にバルク分析によって特徴付けられました。ここでは、通常のフローサイトメーターを使用して個々の小さな粒子上の抗原を特性評価できる、独自のナノテクノロジーベースのハイスループット法について説明します。ウイルスまたは細胞外小胞は、表面抗原の1つを認識する抗体と結合した15 nmの磁性ナノ粒子(MNP)によって免疫捕捉されました。捕捉されたビリオンまたは小胞は、他の表面抗原に対する蛍光抗体とインキュベートされました。得られた複合体を非結合抗体から磁気カラム上で分離し、蛍光でトリガーされる従来のフローサイトメーターで分析しました。この方法は幅広い用途があり、in vivoおよびin vitroの細胞によって生成されたあらゆるウイルス性および非ウイルス性の小粒子の抗原組成を特徴付けるために使用できます。ここでは、この方法を使用して、個々のHIV-1粒子上の宿主細胞マーカーの分布を評価し、個々のデング熱ウイルス(DENV)の成熟を研究し、血流に放出される細胞外小胞を調査する例を示します。
概要
多細胞生物の細胞は、細胞のユニークなグループに属する特定のセルのためのユニークなまたは少なくともいずれかであり得る多くの個々の特徴を持っています。偶数培養クローン化された細胞は、その多様な形態によって証明されるように、個々の特性を示します。また、細胞の個性は、それが分泌する製品に反映されています。ウイルス感染の場合、ウイルス粒子は、それらを生成する細胞からタンパク質を運ぶことができます。例えば、HIVのための多くの宿主細胞タンパク質は、ウイルスエンベロープに埋め込まれており、別の細胞によって生成されたウイルスは、これらの特性のタンパク質1、2または「細胞シグネチャー」を有していてもよいです。
でも感染することなく、細胞が周囲の媒体小細胞外ベシクル（電気自動車）への放出します。多くの場合、これらの小胞とその構造の生合成は、ウイルス、特にレトロウイルスのそれに似ています。近年では、それは明らかになってきました最初に、「血小板ダスト」3であると考えられた電気自動車では、細胞間コミュニケーションの重要な生理的なシステムを構成しています。一緒に細胞間コミュニケーションの二つの他のシステム、すなわち、細胞-細胞接触相互作用および放出される可溶性分子と、電気自動車は、正常な生理機能を調整し、ウイルス感染6,7を含む様々な病状4,5に変更されます。
両方の放出ウイルス粒子と細胞外小胞は非常に多様であるが、それらは、それらの個々の特性が失われたバルク分析によって主に特徴づけられます。それらの異なる表面抗原に基づいて細胞表現型フローサイトメトリーに類似した方法は、個々のウイルスおよびウイルス様粒子を特徴付けるために必要とされます。残念ながら、電気自動車や小さなビリオンは、標準的なフローのインサイトを使用して分析することができませんメトリ法は、それらがほとんどのサイトメーターをトリガするために依存している光散乱信号を生成するには小さすぎるからです。この制限を回避するために、蛍光トリガーを適用することができます。電気自動車またはビリオンを蛍光抗体で染色されている場合は、その類似した蛍光と同等の大きさの自由な抗体およびその凝集体と区別することは困難です。
最近、我々は、通常のフローサイトメーター8,9を使用して、個々の小粒子上の抗原の特徴付けを可能にするナノテクノロジーベースの高スループットの方法を開発しました。多様なアプリケーション10、11、12、13のために他のグループによって記載されているように、我々は、関心対象の免疫捕捉粒子へのMNPを使用します。しかし、私たちの新しい技術は、個々の具体の捕獲を可能にしますFICの目標は、フリーフローティング抗体からの干渉を受けることなく、光の散乱ではなく、トリガー蛍光を用いてフローサイトメトリーによりこれらの捕捉された粒子の表現型解析を行いました。この方法は、広い用途を有し、 インビボで細胞によって生成されたウイルス-および非ウイルス小粒子の抗原性組成物を特徴付けるために使用され、in vitroでの表面抗原に対する特異的な蛍光抗体の利用可能性を提供することができます。我々はすでにいくつかの生物学的問題を研究するためにこの技術を適用しています。
特に、我々は個々のHIV-1粒子9で宿主細胞マーカーの分布を評価し、我々は彼らの表面タンパク質14の分析に基づいて個々のデング熱ウイルス（DENV）の成熟を研究し、健康なボランティアと患者の血流中に放出電気自動車を調査しました急性冠症候群（ACS）を持ちます。同様の原理に基づいているが、新しい技術の適用は、以下に記載されている特定のプロトコルの開発を必要としました。
プロトコル
磁性ナノ粒子の1カップリング（のMNP）
- 抗体（ABS）（典型的には1mg）でカップルのMNPに商用結合手順および試薬を使用してください。カルボン酸のような反応性基を有する酸化鉄ナノ粒子が使用されます。
- 抗体は、体積で高い0.5 mlの場合には、100Kの集光器を用いて濃縮します。 3-5分間、2000×gでスピン。
- 手順の最後に、クエンチング緩衝液10μlを加えた後、12ミリメートル×75ミリメートルチューブにのMNPを転送し、3ミリリットルの洗浄/貯蔵緩衝液を追加します。磁気分離器の中央の穴にチューブを置き、4℃で一晩おきます。
- MNPは、すべてのチューブの側面に集め、その後、慎重にすべての液体をピペットていることを確認します。新鮮な洗浄/保存バッファーの3ミリリットルを追加し、磁石に戻って置きます。
- MNPは、チューブの側面に集め、次いで液体をオフにピペットしている場合、いくつかの時間後、確認してください。に洗浄/保存緩衝液の2ミリリットルを使用しますMNPを再懸濁し、4℃で保存します。
- （セクション2で説明したように、キャプチャ用のマウスモノクローナル抗体を使用している場合例えばヤギ抗マウス）をAbは、関連する蛍光のFab抗体フラグメントでそれらを標識することによってのMNPに結合されていることを確認し、フローサイトメーター上で実行されます。
MNPに結合2.標識化抗体
- （条件当たり）のMNPを60μl（3.9×10 12粒子）を結合し、（200 / mlの商用ソリューションの）5μlを1.5 mlのマイクロ遠心チューブ内の捕獲抗体のアイソタイプに特異的なFab断片を標識しました。
- 連続的に混合しながら30分間室温（RT）でインキュベートします。
- 5分間、1500×gで微量でリン酸緩衝生理食塩水（PBS）とスピン300μlのとプリウェット100Kコンセントレータ。
- 100K列に標識複合体を精製します。 200μlのPBSで洗浄し、5分間、1500×gで微量のステップ2.2からの混合物をスピン、とに回復最初のボリューム。
関心の粒子（ウイルスや電気自動車）をキャプチャするための標識のAb-MNP錯体の3.
- HIV（60μL）やEV製剤（100μl）を用いて予め標識のMNPを60μl（3.9×10 12粒子）をインキュベートします。
- 様々な方法を用いてEVの準備を準備します。ここでは、ショ糖勾配上で電気自動車を精製エキソソームの沈殿試薬を使用して、乏血小板血漿からそれらを収集または血漿から直接単離します 8。
注：最適な比率は、各実験のために決定する必要があり、準備中のウイルス/ EVの濃度に依存しています。 MNP-ABの画分は、ウイルス/ EV画分の濃度と比較して過剰に〜10 6であるべきです。
- 様々な方法を用いてEVの準備を準備します。ここでは、ショ糖勾配上で電気自動車を精製エキソソームの沈殿試薬を使用して、乏血小板血漿からそれらを収集または血漿から直接単離します 8。
- ウイルスの穏やかに混合しながら37℃で40分、またはEV用、4℃で1時間インキュベートします。
- 2.5％のマウスIgG / Fc結合をブロックするヒトIgG、軽くボルテックスを追加し、室温で3〜5分間インキュベートします。
- 各検出Abのメーカー推奨または力価測定濃度を追加し、室温でさらに20分間インキュベートします。
磁気カラムを使用して未結合抗体からMNP捕捉ビリオン（または電気自動車）の4分離
- セパレーターの磁石に置くことで使用するための磁気分離カラムを準備します。
- （PBS中の2mMのエチレンジアミン四酢酸（EDTA）、0.5％ウシ血清アルブミン（BSA））洗浄緩衝液500μlでカラムを予め濡らします。洗浄緩衝液がカラムを通って流れることができるようにします。
- 列にMNPウイルス/ MNP-EV複合体を追加し、すべての液体が流れることを可能にします。ボリューム全体を通過させる、カラムに洗浄緩衝液500μlを追加します。
- 2回以上を洗浄緩衝液で洗浄を繰り返します。
- 保持MNP-ウイルス/ MNP-EV複合体の収集のためのx 75mmのチューブ12ミリメートルで、磁石と場所から列を削除します。カラムを3分間磁石からチューブに立ってみましょう。 200μlのPBSを加えるとletビーズはPBSの別の200μlのを追加し、重力によって流下し、溶出後200μlの4％パラホルムアルデヒドで固定します。
注：パラホルムアルデヒドが疑われる発がん性物質であり、換気フード内で処理する必要があり、手袋を着用してください。 - 単一ビリオン/電気自動車は、ハイスループットサンプラー（HTS）の容積設定を使用するか、直前に取得に定量化するためには、十分に混合されたフローサイトメトリーカウントビーズを追加します。
フローサイトメーターでのMNP-捕捉したウイルス/電気自動車の5.分析
- 30分間のフローサイトメーターをウォームアップ。
- 実行品質管理ビーズ。
- MNPまたは標識されたウイルス/電気自動車のいずれかの蛍光に設定されたしきい値。背景「ノイズ」を減少させるためにしきい値をPBSフィルタリングを0.22μmを使用してください。フィルタリング場所レベルでのPMT電圧を調整することにより、しきい値を設定し、PBSには与えていない、または非常に少ない、イベント。
- 低で実行したサンプル。 （後ろに直列に配置されたシース液のための追加の0.04μmのインラインフィルターを使用しますさらに偽のイベントを排除するために、標準的な0.2μmのシースフィルター）。
捕捉効率の6評価
- 3.1、3.2で説明したように、蛍光標識された電気自動車やMNP-ABSでHIVをキャプチャします。 （電気自動車は、膜色素またはその貨物のいずれかを介して標識することができます 15; HIVは、遺伝子コードの色素16を介して、または膜色素12、17）のいずれかで標識することができます。
- （4.1から4.2）に記載されているように、磁気分離カラムを準備します。
- 列にMNPウイルス/ MNP-EV複合体を追加し、すべての液体が（フロースルー画分）を通って流れることを可能にします。チューブ内のフロースルー画分を収集します。
- （4.4から4.5）に記載されているようにカラムに保持画分と進みます。
- その後の分離（4.1から4.5）と6.3からのフロースルー画分にキャプチャ手順を繰り返します。
- 最初のCAから保持された画分を分析電気自動車やHIVの蛍光標識でのトリガに設定されているサイトメーター上でそれらを実行してpture及び第二の捕捉。効率性を評価するために、両方の画分内のイベント数を比較します。
特定のタスクのためのプロトコルの7の適応
注：上記のように、プロトコルは、HIVと電気自動車の分析に適用することができるが、DENVの分析のために以下の変更が導入されるべきです。
- 室温で30分間、暗所で1μMのDiIでビリオンをインキュベートします。インキュベーション後ブレーキなしで4℃で1.5時間24万×gでの密度勾配媒体中での遠心分離（10％、20％、25％及び35％）で染色されたウイルスを精製します。 20％と25％の密度勾配媒質層14との間の割合を収集します。
- DiIは、メーカーにDENV 1×10 7（60μl）を標識したインキュベート推奨またはRTで20分間、2.5％のマウスIgGの存在下で検出抗体の濃度を力価測定。
- Incub穏やかに混合しながら37℃で40分間プレ標識された60μlの（3.9×10 12粒子）MNP捕捉抗体複合体との混合物を食べました。
- 上記のフローサイトメーター上で分析するように磁気カラムに結合していないABSから独立した、得られた複合体。
結果
HIV-1ビリオンによる細胞の抗原の選択的捕獲
「フローvirometry」で、個々のウイルス粒子の細胞抗原を可視化することが可能になりました。一例として、我々は、HIV-1、LFA-1およびHLA-DRによって運ばれる2つの細胞の抗原に焦点を当てました。以前、これらの2つの抗原バルク1で分析し、HIV-1の調製において同定されました。我々は、のMNPは、EnvのHIVタンパク質、VRC01に対する抗体のいずれかと結合して調製し、これらのMNP HIV-1ビリオン（HIV-1 LAI.04または末梢血単核細胞（PBMC）中で産生されたHIV-1 SF162）で撮影します。さらに、我々は2G12、別の抗Envの抗体を用いて、これらのビリオンを染色しました。フローvirometryは、LFA-1およびHLA-DRの存在に関するHIV-1ビリオンの高い不均一性を示しました。平均16.7±2.0％で（N = 6）および8.6±0.3％（n = 3）は、LFA-1およびHLA-DRを実施し、HIV-1 LAI.04ビリオンの、それぞれ。唯一の4.8±0.6％（n = 3）をすべてのビリオンのは、両方の抗原に対して陽性でした。両方の抗原が6.5±によって運ばれたのに対し、他のHIV-1株、HIV-1 SF162では、これらの抗原は、20.0±4.4％に存在した（n = 6）がそれぞれ10.8±1.3％（n = 6）がビリオンの、 0.4％（ 図1）。
細胞タンパク質の分布は、ウイルスを複製する細胞に依存していました。感染したPBMCによって生成されたものとは抗原的に異なるビリオンを生産HIV感染Jurkat細胞。 Jurkat細胞によって産生されるHIV-1 LAI 0.4のビリオンは、それぞれ1.6±1.4％を担持（N = 3）および1.6±0.7％（n = 4）は、LFA-1およびHLA-DR。 Jurkat細胞において産生さHIV-1 SF162ビリオンについては、これらのパラメータは、7.2±2.5％であった（N = 3）および5.6±2.7％（N = 4）。このように、（少なくともHLA-DRおよびLFA-1用）の抗原性メーキャップは、HIV-1 LAI.04 2つの異なる細胞によって産生されるために異なっていましたタイプ（p <0.02）。
デングウイルスの評価に適用されるvirometry流れ
DENVの成熟は、ビリオン上のprM蛋白質の発現と関連しています。私たちは、BHK-1で製造DENVの何分率を評価するためにフローvirometryを適用し、LoVo細胞に成熟したウイルスを構成しています。ビリオンは、脂質、色素のDiIで染色しました。個々の捕捉されたビリオンの分析は、48.2±5.3％でのprMを明らかにした（n = 8）DENVsの。対照的に、84.5±3.4％（n = 4）はDENVの実施のprM LoVo細胞で産生さ。ビリオンの残りの部分、それぞれ51.8±5.3％（N = 8）および15.5±3.4％（n = 4）があったのPRM負（ 図2）。したがって、フローvirometryは、未成熟（または部分的に成熟した）DENVビリオンから完全に成熟した個々のDENVを区別するために使用することができます。
健康の血流中に放出細胞外ベシクル急性冠症候群（ACS）とボランティアと患者
ACSおよび健常対照の患者で異なるEVのサブセットを調べるために、我々は蛍光CD31、CD41a、またはCD63に対する抗体でのMNP結合により乏血小板血漿（PPP）から電気自動車を捕獲しました。 CD31-のMNPによって捕捉電気自動車は、CD41a-のMNPによって捕獲電気自動車は、CD31およびCD63について染色した、CD41a及びCD63について染色した、およびCD63-のMNPによって捕捉電気自動車は、CD31とCD41a（ 図3）について染色しました。
ACS患者における検出抗体の1または2のために正のCD31-のMNPによって捕捉さ電気自動車の量は3359 [2328でした。 5472] 1272 [714と比較して、電気自動車/μlの。 2157]電気自動車/健康なボランティア（P = 0.001）でμlの。健康なボランティアと比較してACS患者にCD63によって捕捉電気自動車の総量は3541 [1318でした。 5173]電気自動車/μlの対806 [488; 2112]電気自動車/μlの（P = 0.007）。 4752 [3238ありました。 7173]電気自動車/健康なボランティアの血漿中にこの数は有意に低かったのに対し、CD41a-たMNPによって捕獲ACS患者の血漿中μL、2623 [1927; 4188]電気自動車/μLた（p = 0.015）。一般的に、我々の結果は、EVの量は、主にACS患者で増加した一方で、増加の大きさは、電気自動車の異なるサブ集団で異なっていた、ことを示しています。
図1：異なる細胞型で複製するHIV-1ビリオンにおける細胞抗原の選択的取り込み。 PBMCを、またはジャーカット細胞によって放出されたHIV（HIV-1 LAI.04またはHIV-1 SF162）ビリオンはVRC01-のMNPで捕獲され、第二の抗gp120抗体2G12とし、HLA-DRおよびLFA-1に対する特異的抗体で染色しました。染色された製剤は、HLA-DR（白バー）およびLFA-1（黒BAのための分析を流れるように行きましたRS）。 3〜6の実験9の±SEMを意味します。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図2：DENVビリオンの成熟状態。で製造DENV BHK-21細胞（A、B）またはLoVo細胞（C、D）における2H2抗体（A、C）またはでprM蛋白質のために染色し、密度勾配媒体中で超遠心分離した後、脂質色素のDiIで標識しましたアイソタイプ対照のIgG2a（B、D）を持ちます。標識されたウイルス粒子は、次いで、3H5-1-のMNPで捕捉し、分析14を流れるように行きました。 このの拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。図。
図3：ACS 患者と健常対照からのEVの分析。プラズマ電気自動車は、CD31-のMNP、CD63-たMNPまたはCD41a-のMNPで捕獲され、CD31とCD41aに対するCD41a及びCD63に対するそれぞれCD31およびCD63に対する抗体で染色しました。検出Abの少なくとも一つで染色した捕捉さ電気自動車は、フロー分析で可視化し、計数しました。データは、中央値と四分位範囲（IQR）とドットプロットとして提示しました。緑のシンボル：健康なボランティア（対照）、茶色の記号：ACS患者。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図4：Evaluati個々のビリオンを表すフロー・イベントの一部の上に。 （A）HIV-1。ビリオンの懸濁液を、二つの部分に分け、どちらなかった（左パネル）またはDIO（ 中央のパネル ）で染色しました。混合した後二差次的に染色されたビリオンを含有懸濁液を、VRC01-のMNPで捕捉し、virometry（ 右パネル）を流れるようにしました。凝集体（二重色のイベント）は、全イベントの10％未満を構成します。 （B - D）DENV。 1：2：たDiI染色したビリオンの懸濁液を、連続1から2倍に希釈し、256フローサイトメーター（B）上のHTSで取得します。 DiI-DENVsは2H2抗体（C）で標識したかのDiI-DENVsは3H5-1-のMNP（D）で撮影しました。 1：2：製剤CおよびDは、次いで連続1から2倍に希釈した256およびHTS 14で取得しました。ビリオンはそこにすべてのケースで以来、凝集していないようです希釈係数とイベントの数との間の線形相関があります。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図5： フローサイトメーターにより、単一粒子の検出。 1：2：DiIで染色DENV懸濁液を連続的に1から2倍に希釈し、2048およびフローサイトメーター上でHTSを用いて取得しました。 （A）希釈率の関数として検出されたウイルスの数。 （B）の中央値蛍光強度（MFI）のDiIのは、DENV 14標識 。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図6：ビリオンと特異的な抗体に結合するMNPで撮影した細胞外小胞の割合の評価。標識されたHIV-1ビリオンまたは電気自動車に特異的な抗体に結合さのMNPで捕捉し、virometry流れに供しました。磁気カラム上で分離した後、フロースルー（保持されません）画分を、最初の実行中に失われた関心のビリオンまたは電気自動車の存在について分析しました。 （A）標識HIV-1 BALビリオンは、2G12-のMNP（ 左パネル）で撮影しました。フロースルー画分を再捕捉及びvirometry（ 右パネル）を流れるようにしました。最初のサイクルでは、関心のビリオンの約95％が捕捉しました。 （B）標識のEVは、抗CD81のMNPで捕獲され、磁気カラム（左パネル）で単離しました。フロースルー画分を再捕捉し、分析した（ 右パネル）でした 。最初に関心の小胞のサイクルは約99％が8を捕捉しました。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
ディスカッション
従来のフローサイトメーターは、個々のレベル18上の物理的および化学的特性に基づいて細胞を分析するための主要なツールのまま。流れの基本的な原理は、フローサイトメトリーの開発以来、変更されていない：レーザービームを通過した光を散乱させる細胞は、細胞に結合した蛍光抗体により放射された蛍光スペクトルの記録をトリガするイベントを構成しています。彼らはほとんどが光18を収集することはありませんフローサイトメーターれる大きな角度の下でより多くの光を散乱として300 nm以下の小さな粒子は、サイトメーターの側方散乱によって検出することができません。ここに記載された技術は、蛍光がトリガーで、従来のフローサイトメーターにより、多数の個々のウィルスや電気自動車の識別および複数の抗原の分析を可能にします。
プロトコル内の重要なステップはのMNPに対する抗体のカップリングです。我々の実験はperforましたMED反応基としてカルボン酸を有する15nmの酸化鉄ナノ粒子を使用して前述のように 9。製造業者によると、それぞれ15nmのMNPは20の抗体の最大結合することができます。我々は、約15 nmのMNPあたり10抗体に結合します。この推定は、結合前後の抗体の量及びナノ粒子特性評価およびサイジング計器によって測定されたビーズ/ mLの数に基づいています。原理的には、結合は、粒子の凝集を引き起こし、望ましくないことができます。その凝集が私たちのプロトコルで起きていないかを確認するには、我々は、ナノ粒子の特性評価およびサイジング計装でこれを確認しました。この機器は、コーティングおよび抗体層だけではなく15 nmのコアを含む粒子のための流体力学的直径を測定します。私たちは、結合されたビーズの大部分は単一のピークに位置していること（73±7.3 nm以下のすべてのイベントの90％と64.7±4.2 nmにピークを意味する）が見つかりました。 AB-MNPの共同の混合MNPは、電気自動車/ビリオンよりも数オーダーの濃度になるように、右の割合でビリオンまたは電気自動車とmplexesが重要です。これは、単一の電気自動車/ビリオンが分析されていることを確認することが重要です。低流量でサイトメーター実行することにより、イベントの偶然の一致を避けます。蛍光の獲得をトリガし、捕捉した事業体の濃度を測定する体積のコントロールを使用するようにしてください。
しかし、のMNPは、架橋することによって、または同じナノ粒子に二つ以上のビリオンの結合によって電気自動車またはビリオンを集約することができます。これを確認するために、 図4で説明したように、凝集のためにテストが実行されなければなりません。個別に撮影したビリオンまたは電気自動車であっても、同時に、フローサイトメーターのレーザービームを入力することができます。これは、2つの異なる抗原に対して偽陽性を作成します。これを避けるために、説明したようにフローサイトメーターは、設定されるべきであるとの製剤は、希釈してください。一つは、一致がそれを用いて発生しているかどうかを確認することができ前のポイントで説明したように戦略。また、一致の欠如は、調製物の連続希釈液を分析し、蛍光染色された抗原の平均蛍光強度は、全ての希釈（ 図5）に一定のままイベントの数は、希釈して直線的に減少することを証明することによって確認することができます。別の問題は、あまりにも少ないウイルス/電気自動車を捕捉することができることです。これは、それらが特定のMNPによって捕捉され、それを通して抗原を運ぶウイルス/電気自動車の真の不足であることができます。また、捕獲の効率は様々な理由により低い（ 例えば 、MNPの、このプロトコルのために開発されたビリオン/電気自動車へのMNPの比からのずれなどに対する抗体の非効率的なカップリング）。後者の可能性を回避するために、捕獲の効率を具体的に評価されるべきです。一般的に、効率は、図6のように、約90％であるべきです。
異なる抗体が原因に干渉することができます互いの又はのMNPに結合された抗体を用いた立体障害。確認するにはセクション7簡潔に言えばで説明したように、これは（逆キャプチャプロトコルをテストする必要があり実現しなかったことを、ビリオンまたは電気自動車は、第一の蛍光検出のAbで染色した後、上のフリーフローティングABSからその後の分離とのAb-MNP複合体によって捕捉されるべきです磁気カラム。
フローvirometryは、ビリオンまたは電気自動車の抗原性組成物の分析の既存の方法に関して重要な利点を有しています。ルーチン生化学的方法は、調製物中の特定のタンパク質の一般的な存在に報告するが、ビリオンまたは電気自動車の異質性についての情報を提供しません。これは、大規模な商業的に入手可能な粒子にビリオンまたは電気自動車の免疫捕捉が含まれています。そのような粒子は直径数ミクロンの、一般的であり、それらのそれぞれは、ビリオンまたは電気自動車の数百または数千をキャプチャすることができます。したがって、任意の後続の分析平均ビリオン/電気自動車の特性一つの粒子によって捕獲しました。対照的に、フローvirometryは、直径10~15 nmでのMNPを使用して記述されたプロトコルを用いてイベントの少なくとも90％が単一ビリオンまたは単一EVを表します。
主な制限は、準備中のビリオンまたは電気自動車の集団全体が分析されない可能性があることですが、のみキャプチャされています。このように、ビリオンまたは電気自動車が捕獲されるときに通過する抗原の選択が重要になります。また、異なる抗原の数（異なる抗原に対する蛍光抗体の数）サイトメトリーとは異なり、流れはビリオンまたは電気自動車の小さな表面によって制限されています。最後に、別の抗体が立体的に小さいため（細胞と比較して）表面に再び互いに干渉することができます。
現在のプロトコルは、任意の起源の任意のウイルスまたはEVの分析に適合させることができ、それらを捕捉することができるを通じて特異的抗体が利用可能であることを条件とします。個々のビリオン許可証上の抗原の分析ウイルス集団の異なる画分の病因に対処するための研究者。また、血漿中の個々の電気自動車の同定は、それが可能な特定の細胞に電気自動車の起源をトレースすると、正常または病的これらの細胞の状況とそれらが存在する臓器について報告することがあります。
開示事項
著者は利益相反を宣言しません。
謝辞
AA, SZ, WF, J-C.G、LMはNICHD学内プログラムの支援を受けました。MVの作業は、ロシア連邦政府の助成金#14.B25.31.0016によって支援されました。
材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| Materials | |||
| カルボキシル磁性酸化鉄ナノ粒子結合キットオーシャン | ナノテック | ICK-15-005 | |
| ミコンウルトラ4遠心フィルターユニット、Ultracel-100メンブレン | ミリポア | UFC810024 | |
| 5ml丸底PP試験管、キャップ | ファルコン | 352002 | |
| DEPC処理なし水 | 質生物学的 | 351-068-131 | |
| SuperMAG-01 マグネティックセパレーター | オーシャンナノテク | SuperMAG-01 | |
| ゼノンR-フィコエリトリンマウスIgG1 ラベリングキット | サーモフィッシャーサイエンティフィック | Z25055 | |
| ナノセップ遠心装置、オメガメンブレン付き 100k | ポールコーポレーション | OD100C34 | |
| EDTA 0.5 M | コーニング セルグロ | 46-034-CI | |
| ウシ血清アルブミン溶液 | シグマ-アルドリッチ | A9576-50ML | |
| PBS | ギブコ | 10010-23 | |
| パラホルムアルデヒド、EM グレード、精製 | されたEMS | 15710 | |
| 123カウントのeBeads | eBioscience | 01-1234-42 | |
| CytoCount ビーズ | Dako | S2366 | |
| AccuCheck count beads | Invitrogen | PCB100 | |
| Cytometer Setup &トラッキングビーズキット(CST) | BD Bioscience | 642412 | |
| Vybrant DiI細胞ラベリングソリューション | サーモフィッシャーサイエンティフィック | V22885 | |
| Name | Company | カタログ番号 | コメント |
| Equipment | |||
| &マイクロ;MACSコラム | Miltenyi Biotec | 130-042-701 | |
| OctoMACS セパレーターマグネット | Miltenyi Biotec | 130-042-108 | |
| Nanodrop | ThermoFisher | none | |
| NanoSight NS300 | Malvern | none | |
| BD LSRII flow cytometer | BD Bioscience | none | |
| Name | Company | カタログ番号 | コメント< |
| strong>ソフトウェア | |||
| Flowjoソフトウェア | Flowjo | ||
| BD FACSDiva software | BD |
参考文献
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