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方法論記事

デキストランは、マウスとヒト NK 細胞のレンチ ウイルスの伝達効率を向上します。

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DOI：

10.3791/55063

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2018年1月15日

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1Laboratory of Molecular Immunology and Immunotherapy, Blood Research Institute, The Blood Center of Wisconsin, 2Vector Core Lab, Blood Research Institute, The Blood Center of Wisconsin, 3Laboratory of Lymphocyte Biology, Blood Research Institute, The Blood Center of Wisconsin, 4Laboratory of Stem Cell Transcriptional Regulation, Blood Research Institute, The Blood Center of Wisconsin, 5Department of Microbiology and Immunology, The Medical College of Wisconsin, 6Department of Pediatrics, The Medical College of Wisconsin, 7Department of Medicine, The Medical College of Wisconsin

この記事について

サマリー

本研究の目的は、自然なキラー (NK) 細胞の正常な遺伝子伝達を可能にする技術を策定することでした。人間のデキストランを介したレンチ ウイルス伝達や遺伝子発現効率の向上でマウスの主な NK 細胞実験結果。遺伝子伝達のこのメソッドは、NK 細胞の遺伝的操作を大幅に向上させます。

要約

ナチュラル キラー (NK) 細胞に特定の遺伝子の効率的な伝達は、主要な挑戦をされています。成功した伝達は、分化と NK 細胞の機能に関する研究の興味の遺伝子の役割を定義するのに重要です。がん免疫療法におけるキメラ抗原受容体 (自動車) に関連する最近の進歩は、エフェクター細胞に遺伝子を提供する効率的な方法の必要性を強調します。主な人間またはマウスの NK 細胞にレンチ ウイルス媒介性遺伝子伝達の効率は、主要な制限要因である大幅低いまま。Polybrene などのカチオン性ポリマーによる最近の進歩は、T 細胞で改善された遺伝子伝達効率を表示します。ただし、これらの製品は、NK 細胞の情報伝達効率を改善するために失敗しました。人間の伝達効率とマウスの NK 細胞が大幅に向上作業、デキストラン、分岐グルカンの多糖を示しています。この再現性の高い情報伝達方法臨床遺伝子配信アプリケーションとこのように NK 細胞を用いたがん免疫療法.を大幅に改善することができます人間プライマリ NK 細胞の伝達の有能なツールを提供します。

概要

ナチュラル キラー (NK) 細胞は、生得の免疫組織の1の主要なリンパ球人口です。NK 細胞は、腫瘍や感染症の2,3,4に対する宿主の免疫応答の最初の行の擁護者として機能します。NK 細胞はまた強力なサイトカインとケモカイン5の分泌を通じて耐性の開発で中心的な役割を再生します。ターゲットし、腫瘍細胞を排除する強力な能力、がん6、7の養子免疫療法としてドナー由来ヒト NK 細胞を評価する複数の臨床試験を行っています。T 細胞と対照をなして NK 細胞の発生生物学を特徴8となりますが。知識のこの欠乏は部分的にマウスやヒト NK 細胞に興味の遺伝子を提供する効率的な技術の不在のため。これらの理由から、NK 細胞研究のほとんどは、初代培養細胞ではなく細胞株で行われています。したがって、信頼性と効率的なプロトコルへと興味の遺伝子を持つ NK 細胞を変換するための必要性は重要です。

本研究の全体的な目標は、人間またはマウス NK 細胞でした遺伝子導入やレトロ ウイルスで導入する一貫性のある、信頼性の高い方法を策定します。

主として NK 細胞の一時的な変換を使用して、この問題に対処しようとした以前の研究が行われています。これはプラスミッド トランスフェクション9,10、エプスタインバー ウイルス (EBV) が含まれています/レトロ ハイブリッド ベクトル11, ワクシニア ベクトル12,13、および Ad5/F35 キメラ アデノ14。これらのテクニックのささやかな効率にもかかわらず、伝達の過渡的な性質に、遺伝子組み換えの NK 細胞の長期的な利用には不向きになります。いくつかの最近の研究は、NK 細胞、遺伝子発現11,15の許容可能なレベルを達成するために感染症の複数のサイクルを必要とする変換にレトロウイルスベクターを使用しています。レンチウイルスベクターは retroviral ベクトルと対照をなして宿主細胞核輸入機械を使用して、ウイルスの事前統合複合体を核に若しできます。これは、NK 細胞を含む非分裂細胞にウイルスの複製の主要な制限要因です。

異なった細胞表面受容体とウイルス粒子の相互作用は、セルにウイルスの取り込みを許可します。ウイルスのエンベロープタンパク質と同種のホスト受容体の初期の契約は、既存の 2 つの潜在的な負電荷のために限ることができます。多くの伝達技術の背後にある理論的根拠は, デキストラン投与やプロタミン硫酸塩 (PS)、polybrene (Pb) などのカチオン性ポリマー添加が細胞表面の受容体に正電荷を与えるでき、それによりウイルスの封筒の結合を強化蛋白質。これはセル16融合効率とウイルス粒子の吸収を高めます。Pb や PS が T 細胞17遺伝子伝達を改善できることは報告されて、応用は NK 細胞の伝達効率で任意の効果を持っていなかった。また、NK 細胞を使用してこれらの試薬の比較分析は実行されていません。この研究では、3 つのカチオン性ポリマーの伝達効率を比較しました。結果は、これら 3 つのカチオン性ポリマーの中でのみデキストラン大幅に向上マウスとヒト NK 細胞の両方に効率的なウイルス伝達を示します。

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プロトコル

動物のすべてのプロトコルは、動物の人道的・倫理的扱いに従い、機関動物ケアおよび使用委員会 (IACUC)、ウィスコンシン医科大学 (MCW)、ミルウォーキー、ウィスコンシンの医学研究センター (BRC) 内で承認されました。ひと末梢血単核球 (Pbmc) の使用は、ウィスコンシン州ミルウォーキー、ウィスコンシンの血液センターの血液研究所の制度的レビュー委員会 (IRB) によってを承認されました。

1. マウス、細胞株およびベクトル

  1. 商用ベンダーから c57bl/6 マウスを取得します。病原体フリーの条件でマウス コロニーを維持し、6 および 12 週の年齢間の女性と男性のマウスを使用します。IRB 承認ソースから匿名化した人間の PBMCs を取得します。
  2. プロピレング リコール (1, 2-プロパンジ オール、USP の等級)、マウスを麻酔するの 20-30 %v/v イソフルランの混合物と動物を麻酔します。マウスは麻酔下で、乾燥を防ぐため目に獣医軟膏を適用されます。
  3. 安楽死、麻酔導入後頚部転位を実行します。
    1. 片方の手で尾の基本をしっかりとつかんでマウスを抑制します。頭蓋底に丈夫な棒型ペンまたは親指と、首の背部に対してもう一方の手の最初の指を置きます。
    2. 転位を作り出す、動物の頭を転送し、尾のベースを持っている手と後方に引きながら押し手の拘束を押してください。頸部組織の分離感によって転位の効果を検証する.
  4. 少なくとも 5 分商工会議所/檻の中の動物を維持し、呼吸活性が存在しない場合にのみ、または検出ハートビートの欠如がある場合、それらを削除します。
  5. 商用ベンダーから YAC 1 および K562 細胞を取得、メンテナンスを RPMI1640 培 10% 熱不活化政府短期証券。マイコ プラズマ汚染の可能性を排除するために定期的にこれらの細胞をテストします。

2. 準備中とレンチウイルスベクターの滴定

  1. 7.5% 重炭酸ナトリウム溶液の 0.001% 5% 10 %fbs、100 U/mL ペニシリン、100 μ g/mL ストレプトマイシン、1 mM ピルビン酸ナトリウム、RPMI1640 培地 20 mL の溶液が入ったコート t75 フラスコ cm2フラスコで一晩培養 5 × 106 293 t 細胞Β-メルカプトエタノール。5.2% CO2を流し込んで 37 ° C の定温器にフラスコを配置します。
  2. トリプシン (リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) で 0.025%)/EDTA (1 mM) を使用して 293 t 細胞を収穫.PBS でトリプシン EDTA/5 mL を追加し、37 ° C T75 cm2フラスコから 293 t 細胞の剥離を許可するインキュベーターで 10 分間フラスコを孵化させなさい。
    1. 戸建の細胞を収集し、トリプシンの痕跡を削除する PBS と EDTA で二度洗い。診断とセルをカウントし、mL あたり 100 万セルにセル数を調整します。
  3. PsPAX2 の 3.95 μ g、pMD2G、1.32 μ g (社内 BRI ので生成 pLenti CMV GFP プーロの CMV プロモーターの代わりに pWPI から EF1alpha のプロモーターをクローニング) pLEP GFP プーロの 5.26 μ g と 293 t 細胞18 transfect19。
    1. 150 mM の NaCl の 1 mL プラス 0.6 mg/mL ポリエチレンイミンの 63 μ L を準備 (PEI; 25,000 kD、線形)。よく混ぜると、プラスミドを追加し、混ぜます。室温で 20 分間インキュベートし、セルに追加します。
    2. 16 時間後トランスフェクション、置換新鮮な培地でトランスフェクション ミディアム プラス 4.5 mM 酪。ウイルス 48 時間後トランスフェクションを含む上清を収穫し、5,000 × g で遠心を一晩で集中。材料表を参照してください。
  4. シリアル希薄を行い 293 t 細胞を用いたウイルスの抗体価を決定し、流れ cytometry 72 h 後伝達20試金。ウイルス抗体価を定量化するのに措置として緑色蛍光タンパク質 (GFP) の式を使用します。

3. 精製とマウス NK 細胞の拡大

  1. マウスのプライマリ NK 細胞21を浄化します。簡単に言えば、B 細胞とマクロファージから成る付着性の人口を破壊するナイロン ウール列を単一細胞の脾臓の懸濁液を渡します。
  2. 文化非付着個体数が 1,000 U/mL インターロイキン (IL)-2 RPMI1640 培地で 10 %fbs、100 U/mL ペニシリン、100 μ g/mL ストレプトマイシン、1 mM ピルビン酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム 7.5% の 5% とマウスの NK 細胞を含むナイロン ウール列から溶出ソリューション、および 0.001% β-メルカプトエタノール (RPMI1640 完全培地)。
  3. 非付着 T と NKT 細胞を削除するこの文化の 4 日目、フラスコから媒体を変更します。まま、フラスコに付着細胞は主として NK 細胞です。新鮮な RPMI1640 完全培地 20 mL、1,000 U/mL のフラスコを補充するために IL-2 を追加します。
  4. フローサイトメトリーによる 7 日 NK 細胞特異的マーカー20 CD3 の 95% 以上の製剤を使用してマウスの NK 細胞培養の純度を確認してください-NK1.1+の人口。

4. 精製とヒト NK 細胞の拡大

  1. 健康な人間のボランティアのバフィー コートからの密度勾配によって PBMCs を分離します。簡単に、慎重にはレイヤー (HBSS) で半分希釈細胞 15 mL 以上 50 mL の標準的な管の密度勾配の 35 mL です。ブレーキなしスイング バケツ ローターで 20 ° C で 30 分間 400 × g で遠心分離機します。
  2. 製造元のプロトコルに従って人間 NK 細胞を浄化するために抗体を用いた負の淘汰の商業キットを使用します。
  3. 次の分離、蛍光抗体法によって NK 細胞製剤の純度を決定します。CD3 の不在そして細胞表面に cd56 陽性細胞の存在によって決定されます PBS NK 細胞集団で 2 回 20 分洗浄 2 μ g/mL 抗 CD3、4 ° C で 2 μ G/ml アンチ CD56 抗体と NK 細胞製剤、細胞を染色します。
  4. 4 ° C で 20 分の抗体と細胞製剤を孵化させなさい、PBS で洗浄し、流れの cytometer で分析します。NK 細胞製剤を使用遺伝子伝達の純度 85% 以上20の試金。

5. レンチ ウイルスとマウスと人間の一次 NK 細胞の情報伝達

  1. GFP レンチ ウイルス感染 (MOI) の 5、10、そして 20 の多様性で上清及び Pb の存在下における媒体の 0.5 × 105/mL でマウスまたは 24 ウェル プレートのヒト NK 細胞を中断 (8 μ g/mL)、PS (8 μ g/mL) またはデキストラン (8 μ g/mL)。
  2. 60 分の 1,000 × g でプレートを遠心します。
  3. 上清をデカントすることがなく細胞の培養、一晩 (16-18 h) 5.2% を流し込んで 37 ° C の定温器で CO2.
  4. 10 mL の PBS で洗浄し、IL-2 の存在下で完全な RPMI1640 培地の 2 mL で再懸濁します (300 U/mL)。
  5. 人間をテストし、それぞれ51クロム (Cr) を実行することにより K562 と YAC-1 主な NK 細胞性活性をマウス-リリース試金で様々 なエフェクターをターゲット細胞比22。
    1. 簡単に言えば、radiolabeled ナトリウム クロム酸51Cr の 100 万のターゲット細胞 50 µCi を与えます。4 時間培養時間の間に彼ら吸収細胞蛋白質に Cr 51。孵化の最後に、任意の個人のラベルを削除するセルを洗ってください。
    2. 特定の腫瘍の細胞の換散を標的細胞から51Cr の絶対、自発、および実験的リリースの量によって計算します。
      注: pentaplicate の実験から特定の換散の割合の計算が行われていた次の式を使用して: % 特定換散 = ((51Cr 意味する実験的リリース - 51Cr 平均自然リリース)/(51Cr の意味最大 release - 51Cr は、自発的なリリース)) х 100、「51Cr 平均自発的な解放」は51Cr は、NK 細胞の標的細胞から解放、「51Cr 平均最大リリース」は51Cr2 N 塩酸 (HCl) によるターゲット細胞換散からリリース。
  6. 7 日目に、フラスコをやさしくタッピングによって導入された NK 細胞を収穫します。
    1. アンチ NKG2D mAb の 2.5 μ g/mL の濃度 96 ウェル、高いタンパク質吸収ポリスチレン板を一晩コーティング プレート バインド対策 NKG2D (A10) mAb の滴定された濃度で収穫されたセルをアクティブにします。
    2. それぞれを洗って 3 回 NK 細胞添加前に 100 μ L の PBS とも。
  7. 16 と 18 h ライセンス認証後 IFN-γ などのサイトカインを定量化する間マルチ チャンネル ピペットを使用して培養上清を収集します。酵素免疫測定法 (ELISA) キット付属組換えサイトカインを使用して標準的な曲線を生成します。
  8. アネキシン-V/7-アミノ-アクチノマイシン D (7 AAD) 染色23を使用して NK 細胞の生存率をテストし、流れの cytometer を使用して変換された NK 細胞壊死細胞の割合を決定します。
    1. この分析を実行するマウスおよび人間の NK 細胞の導入後、4 日間の収穫 (500 g) × 5 分ごとに、冷たい PBS の 10 mL で 2 回洗浄し、インキュベートする Annexin V (PE) と/7 AAD キット。
  9. 適切な流れの cytometry のソフトウェアを使用して、データを分析します。生きている細胞集団を選択し、ウイルス伝達24の指標として GFP (FITC チャンネル) の表現を分析します。

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結果

デキストラン誘導レンチウイルスベクター主の人間およびマウスの NK 細胞の効率的な遺伝子導入

ヒト NK 細胞分離 PBMC (純度 85% 以上) の精製し、リライアンス 2 300 U/mL で夜通し孵化します。これら NK 細胞が、感染症の様々 な多重度で GFP レンチ増殖型 (MOI; 3、10、およびセルあたり 20 の IU) 8 μ G/ml Pb や PS、デキストランの存在下で 24 ウェル プレートで。細胞 60 分 1,000 × g で遠心分離, 37 ° c CO2インキュベーターで一晩培養 (ウイルス) の存在下で.細胞洗浄, 7 日間新鮮な rIL 2 300 U/ml RPMI1640 完全培地で再停止されます。伝達効率は導入後 7 日 GFP 発現をフローサイトメトリーによって評価されました。そのデキストラン ヒト NK 細胞のレンチ ウイルス伝達の効率向上し、導入された NK 細胞 (

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ディスカッション

本研究は、カチオン性ポリマー剤はマウスとヒト NK 細胞のレンチ ウイルスの伝達効率を向上、デキストランの使用を示します。また、Pb や PS などの他のカチオン性エージェントあるウイルスのベクトルの配信で目に見える効果ヒト NK 細胞に以前は、Pb が人間の T 細胞17の遺伝子伝達を強化できます実証されています。これらの結果はしかし、Pb も PS ひと NK 細胞に似たような効率があることをお勧めします。本研究では、Pb 改善伝達効果は緩やかでマウスの NK 細胞。それは、エンハンサーとして TBK1/IKKɛ、および PS の阻害剤 BX795 を用いた細胞内抗ウイルス防衛機構の抑制がレンチ ウイルス伝達効率25を増やすことが示されています。それにもかかわらず、この抑制剤がマウスかヒト NK 細胞 (データは示されていない) に伝達効果に及ぼす影響を持っていないことがわかった。

結果を示す PS や Pb に効果はないそのデキストランが主な人間とマウスの NK 細胞の効率的な伝達...

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開示事項

著者は金融利害を主張できません。

謝辞

ルチア着きましたと彼女のルルのレモネード スタンド、インスピレーション、動機、サポートに感謝しますこの作品は、NIH R01 AI102893 と NCI R01 CA179363 (スウェン); によって一部で支持されました。NHLBI HL087951 (レジスタ)。NIH-CA151893-K08 (M.J.R.);NCI 1R01CA164225 (L.W);アレックスのレモネード スタンド財団 (スウェン);MACC 基金 (スウェン; の HRHM プログラムレジスタ;M.S.T);ニコラス ・ ファミリー基金 (スウェン);Gardetto 家族 (スウェン);現代学者はプログラム (M.S.T.);現代車輪 (レジスタ); 希望MACC の資金 (M.S.T. ・ スウェン);子どもの研究所、MCW (レジスタ)。キャシー ダフェイ ・ フォガティ賞 (M.J.R.)。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
デキストランSigma-Aldrich90-64-91-9
ポリブレン (Pb)Sigma-AldrichTR-1003
プロタミン硫酸塩 (PS)Sigma-Aldrichp3369
トリプシンCorning25-052-CI
RPMI1640Corning10-040-CV
ウシ胎児血清ATALANTAS11150
ペニシリンコーニング30-001-CI
B-メルカプトエタノールSIGMAM3148
ピルビン酸ナトリウムコーニングMT25000CI
インターフェロン ガンマ (IFN-&γ; )eBioscience14-7311-85
プロピジウム下宿染色液BD51-66211E
リポフェクタミン 3000サーモフィッシャーL3000015
イソフルランPHOENIXNDC 57319-559-05
NK 細胞ネガティブ選択キット幹細胞19855
Yac-1ATCCTIB-160
K562ATCCCCL-243
マウスJakson664
293T cellsATCCCRL-3216
T75 フラスコCornnig430641U
抗体ベースのネガティブセレクションキット幹細胞19055
51Chromium (Cr)-release assaysperkin elmer'sNEZ030
ELISAキットEbioscience00-4201-56
酪酸ナトリウムSigma5887-5G
リニアポリエチレンイミンpolysciences23966-2
FicollGE Life Science17-1440-03
HBSSCorning21-022-CV

参考文献

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