Method Article

LC-MS / MS分析を用いた核補因子と相互作用するタンパク質のハイスループット同定のためのタンパク質調製方法

DOI:

10.3791/55077

⸱

January 24th, 2017

 ,  ,  ,  , 
1Graduate School of Frontier Biosciences, Osaka University, 2Department of Biotechnology and Genetic Engineering, Jahangirnagar University, 3Division of Cell Regeneration and Transplantation, School of Medicine, Nihon University, 4Institute of Genetics and Animal Breeding of the Polish Academy of Sciences, 5Graduate School of Life and Medical Sciences, Doshisha University

* These authors contributed equally

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

我々は、LC-MS / MSシステムを使用して共調節相互作用タンパク質の精製のための方法を確立しました。

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

転写補助因子は、核クロマチン構造の効率的な転写調節に不可欠です。共調節因子は、転写の調節においてさまざまな役割を果たします。これには、転写因子との直接的な相互作用、ヒストンや他のタンパク質の共有結合修飾、時折のクロマチンコンフォメーション変化などが含まれます。したがって、このネットワーク内で相互作用するタンパク質を比較的迅速に同定する方法を確立することは、根底にある調節メカニズムの理解を深めるために重要です。LC-MS/MS を介したタンパク質結合パートナーの同定は、タンパク質間相互作用の解析に使用される検証済みの手法です。以前に同定されたタンパク質複合体のメンバーを抗体(場合によってはタグ付きタンパク質の抗体)で免疫沈降させることにより、質量分析によって未知のタンパク質相互作用を同定することができます。ここでは、核補因子とその結合パートナーが関与するタンパク質相互作用の LC-MS/MS を介したハイスループット同定のためのタンパク質調製法を紹介します。この方法により、標的核因子の転写制御メカニズムをより深く理解することができます。

Introduction

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タンパク質 - タンパク質相互作用は、多くの生物学的機能において重要な役割を果たしています。このように、これらの相互作用は、シグナル伝達に関与しています。細胞膜を横切るタンパク質輸送;細胞代謝; DNA複製、DNA損傷修復、組換え、および転写1、2、3、4を含む、いくつかの核プロセス。これらの相互作用に関与するタンパク質を同定することは、これらの細胞プロセスの理解を進めることが重要です。

免疫沈降（IP）は、タンパク質 - タンパク質相互作用を分析するために使用される検証技法です。共免疫沈降したタンパク質の同定を容易にするために、質量分析がしばしば利用されて5、6、7、8、9。抗体とタンパク質複合体の既知のメンバーを標的とすることにより、タンパク質複合体を単離するために、続いて質量分析を介して、その未知の成分を同定することが可能です。 ARIP4（アンドロゲン受容体相互作用タンパク質4）、転写補調節因子は、文脈に依存した方法9、10でその標的プロモーターを活性化または抑制するために、核内受容体タンパク質と相互作用します。より良いこれらの核因子を支配する転写調節機構を理解するために、我々は、精製し、LC-MS / MSシステムを使用してARIP4相互作用するタンパク質を同定するための包括的方法を記載しています。

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Protocol

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1.トランスフェクション

  1. 100 mmの培養プレートでHEK293細胞を播種（2×10 6細胞/皿）。培養10％ウシ胎児血清、100μg/ mlのストレプトマイシン、および100単位/ mlのペニシリンを補充したダルベッコ改変イーグル培地中の細胞。 5％CO 2、37℃の加湿インキュベーター中で細胞をインキュベートします。
  2. 翌日、製造業者の指示11に従ってトランスフェクション試薬を40μlを用いて、FLAGタグ付きARIP4プラスミド10μgの細胞をトランスフェクト。

2.タンパク質抽出

  1. 約36時間のトランスフェクション後、氷冷PBSで細胞を洗浄し、スクレーパーを用いて細胞を採取します。 1.5 mltubeに細胞を移し、4℃で2分間、8,000×gで、それを遠心します。吸引した上清と5倍に細胞ペレットを再懸濁し、0.4MのKClバッファーのペレット体積（高塩緩衝液：20mMのトリスHCl（pH8.0）、0.4 MのKCl、5mMのMgCl 2、10％グリセロール、0.1％NP-40、10mMのB -メルカプトエタノール、1×プロテアーゼ阻害剤カクテル）。 4℃で20分間、混合物を回転させます。
  2. 4℃で10分間、17,700×gでチューブを遠心。
  3. 新しい2 mLのチューブに上清（全細胞抽出物）を転送し、3×0 MのKCl緩衝液（希釈緩衝液の初期容量追加：20mMのトリス-HCl（pH8.0）に、5mMのMgCl 2、10％グリセロール、 0.1％NP-40、10mMのβメルカプトエタノール、1×プロテアーゼ阻害剤カクテル）。
  4. 別の遠心分離（4℃で10分間、17,700×gで）を実行し、新しい2 mlチューブに上清（全細胞抽出物）を転送。

3.免疫沈降

  1. 遠心分離（2.4）中、0.1MのKCl緩衝液（低塩緩衝液で2回洗浄し、続いてPBSで抗FLAGビーズ、0.1 Mグリシン - 塩酸、次いで1 Mトリス塩酸、50μlの洗浄：20mMのトリスを塩酸液（pH 8.0）、0.1 MのKCl、5mMのMgCl 2を、10％グリセロール、0.1％NP-40 10 m個Mβ-メルカプトエタノール、1×プロテアーゼ阻害剤カクテル）。この洗浄工程の遠心分離を4℃で1分間、2,000×gで行われます。
  2. 全細胞抽出物でFLAGビーズの50μLを混合し、穏やかに2-4°C（全細胞抽出物を1％ステップ2.4からは、将来の使用のために-80℃で維持されるべきで4時間混合物を回転させます）を入力として。
  3. マイクロスピンカラム（重力落下）にサンプルを転送します。 （入力フロースルーウェスタンブロット分析を使用して、両方のタンパク質レベルをチェック）、1.5mlチューブにフロースルーを保つ液体窒素を用いて凍結し、-80℃で保管します。
  4. FLAGビーズ（重力落下）を洗浄するために、0.1MのKCl緩衝液（低塩緩衝液）の1ミリリットルを追加します。
  5. 3.4少なくとも4回（5回の洗浄の合計のための）手順を繰り返し。

4.溶出

  1. それは1分間2,000×gで1.5ミリリットルチューブと遠心分離機に列を配置します。ビーズが乾燥します。
  2. の底部キャップ列。
  3. 0.1 Mグリシン-HCl（pH2.5）の（FLAGビーズの容積に等しい）50μLを加えます。
  4. 穏やかに室温で10分間混合物を振ります。
  5. 新しい1.5 mlチューブにカラムを置き、1分間2000×gでそれを遠心します。
  6. 溶出した溶液を1 Mトリス-HCl（pH8.0）10μlので中和します。ピペッティングによりまたは渦機を用いてよく混ぜます。

5.アルキル化し、トリプシン処理

  1. 混合物（112μlの総容量）に100mMのNH 4 HCO 350μlの、CH 3 CN10μlの、及びジチオスレイトールの2μLを加えます。
  2. 56℃で30分間、試料をインキュベートします。
  3. 10分間、室温でサンプルを配置します。
  4. ヨードアセトアミドサンプルに333 mMと10μlを添加して、37℃で30分間、暗所でそれをインキュベートします。
  5. 混合物にトリプシン10μlの（33 ngの/μl）を加え、37℃で一晩静置します。

6。 LC-MS / MS分析

  1. 一晩のトリプシン処理後、LC-MS / MS機能または分析12のためにサードパーティの質量分析研究所に、最終製品を輸送します。

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Results

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私たちは、160 KDaの周りに、強いARIP4信号を識別し、同様にモックサンプル制御および他のいくつかの未知のタンパク質（ 図1）のもの。 LC-MS / MS分析は、FLAGビーズ（ 表1）の画分内ARIP4複合ペプチド及び潜在的なペプチド補因子の両方を同定しました。 P62（Sequestosome1）、既知ARIP4補因子11は、このシステム11の有効性を確認する、分析（ 表1）において同定されました。また、ARIP4と対話する他の多くの以前に報告されているタンパク質を同定しました。このようにして、SUMO2 10とDryK 13は、LC-MS / MS分析によって検出しました。 ARIP4ペプチドはまた、IPは、高品質であったことを示唆してLC-MS / MS分析を用いて同...

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Discussion

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効率的なトランスフェクションは、このプロトコルで成功した結果を得ることが不可欠です。したがって、我々は免疫沈降FLAGタグ付きタンパク質レベルを決定するために、ウェスタンブロット分析を使用することをお勧めします。このステップでは、IPが正常に実行されたこと、また、興味のあるタンパク質が適切に過剰発現していることを確認し、することができます。 FLAG標識タンパク質レベルはまた、質量分析の前にチェックする必要があります。

モックサンプルは、偽陽性の結果を得ることを避けるために、真の相互作用から背景を区別するため、陰性対照として使用されるべきです。ヒトタンパク質を研究するときにまた、実験では、汚染を避けるために、比較的クリーンな環境（ 例えば、クリーンルーム）で行われるべきです。高塩濃度（0.3〜0.4 M）を有するタンパク質抽出緩衝液は、時折核タンパク質を抽出するために使用することができるが、0.1〜0.15 Mの塩濃度を有するIP緩衝液は、最もあり10お勧めします。これは、IP手順は、タンパク質 - タンパク質相互作用を中断することなく続行することができます。さら...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

著者らは開示するものは何もない。

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

この研究は、アステラス代謝障害研究財団(HT)、武田科学振興財団(HT)、および日本学術振興会科学研究費補助金若手研究者(B)の支援を受けて行われました。

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Lipofectamine 2000 Transfection ReagentThermo Fisher Scientific11668019
Protease Inhibitor Cocktail (EDTA free) (100x)nacalai tesque03969-21
ANTI-FLAG M2 Affinity GelSigma-AldrichA2220
Micro Bio-Spin ColumnsBIO-RAD732-6204

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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