我々は、LC-MS / MSシステムを使用して共調節相互作用タンパク質の精製のための方法を確立しました。
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方法論記事
LC-MS / MS分析を用いた核補因子と相互作用するタンパク質のハイスループット同定のためのタンパク質調製方法
* These authors contributed equally
この記事について
サマリー
要約
転写補助因子は、核クロマチン構造の効率的な転写調節に不可欠です。共調節因子は、転写の調節においてさまざまな役割を果たします。これには、転写因子との直接的な相互作用、ヒストンや他のタンパク質の共有結合修飾、時折のクロマチンコンフォメーション変化などが含まれます。したがって、このネットワーク内で相互作用するタンパク質を比較的迅速に同定する方法を確立することは、根底にある調節メカニズムの理解を深めるために重要です。LC-MS/MS を介したタンパク質結合パートナーの同定は、タンパク質間相互作用の解析に使用される検証済みの手法です。以前に同定されたタンパク質複合体のメンバーを抗体(場合によってはタグ付きタンパク質の抗体)で免疫沈降させることにより、質量分析によって未知のタンパク質相互作用を同定することができます。ここでは、核補因子とその結合パートナーが関与するタンパク質相互作用の LC-MS/MS を介したハイスループット同定のためのタンパク質調製法を紹介します。この方法により、標的核因子の転写制御メカニズムをより深く理解することができます。
概要
タンパク質 - タンパク質相互作用は、多くの生物学的機能において重要な役割を果たしています。このように、これらの相互作用は、シグナル伝達に関与しています。細胞膜を横切るタンパク質輸送;細胞代謝; DNA複製、DNA損傷修復、組換え、および転写1、2、3、4を含む、いくつかの核プロセス。これらの相互作用に関与するタンパク質を同定することは、これらの細胞プロセスの理解を進めることが重要です。
免疫沈降（IP）は、タンパク質 - タンパク質相互作用を分析するために使用される検証技法です。共免疫沈降したタンパク質の同定を容易にするために、質量分析がしばしば利用されて5、6、7、8、9。抗体とタンパク質複合体の既知のメンバーを標的とすることにより、タンパク質複合体を単離するために、続いて質量分析を介して、その未....
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プロトコル
1.トランスフェクション
- 100 mmの培養プレートでHEK293細胞を播種（2×10 6細胞/皿）。培養10％ウシ胎児血清、100μg/ mlのストレプトマイシン、および100単位/ mlのペニシリンを補充したダルベッコ改変イーグル培地中の細胞。 5％CO 2、37℃の加湿インキュベーター中で細胞をインキュベートします。
- 翌日、製造業者の指示11に従ってトランスフェクション試薬を40μlを用いて、FLAGタグ付きARIP4プラスミド10μgの細胞をトランスフェクト。
2.タンパク質抽出
- 約36時間のトランスフェクション後、氷冷PBSで細胞を洗浄し、スクレーパーを用いて細胞を採取します。 1.5 mltubeに細胞を移し、4℃で2分間、8,000×gで、それを遠心します。吸引した上清と5倍に細胞ペレットを再懸濁し、0.4MのKClバッファーのペレット体積（高塩緩衝液：20mMのトリスHCl（pH8.0）、0.4 MのKCl、5mMのMgCl 2、10％グリセロール、0.1％NP-40、10mMのB -メルカプトエタノール、1×プロテアーゼ阻害剤カクテル）。 4℃で20分間、混合物を回転させます。
- 4℃で10分間、17,700×gでチューブを遠心。
- 新しい2....
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結果
私たちは、160 KDaの周りに、強いARIP4信号を識別し、同様にモックサンプル制御および他のいくつかの未知のタンパク質（ 図1）のもの。 LC-MS / MS分析は、FLAGビーズ（ 表1）の画分内ARIP4複合ペプチド及び潜在的なペプチド補因子の両方を同定しました。 P62（Sequestosome1）、既知ARIP4補因子11は、このシステム11の有効性を確認する、分析（ 表1）において同定されました。また、ARIP4と対話する他の多くの以前に報告されているタンパク質を同定しました。このようにして、SUMO2 10とDryK 13は、LC-MS / MS分析によって検出しました。 ARIP4ペプチドはまた、IPは、高品質であったことを示唆してLC-MS / MS分析を用いて同.......
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ディスカッション
効率的なトランスフェクションは、このプロトコルで成功した結果を得ることが不可欠です。したがって、我々は免疫沈降FLAGタグ付きタンパク質レベルを決定するために、ウェスタンブロット分析を使用することをお勧めします。このステップでは、IPが正常に実行されたこと、また、興味のあるタンパク質が適切に過剰発現していることを確認し、することができます。 FLAG標識タンパク質レベルはまた、質量分析の前にチェックする必要があります。
モックサンプルは、偽陽性の結果を得ることを避けるために、真の相互作用から背景を区別するため、陰性対照として使用されるべきです。ヒトタンパク質を研究するときにまた、実験では、汚染を避けるために、比較的クリーンな環境（ 例えば、クリーンルーム）で行われるべきです。高塩濃度（0.3〜0.4 M）を有するタンパク質抽出緩衝液は、時折核タンパク質を抽出するために使用することができるが、0.1〜0.15 Mの塩濃度を有するIP緩衝液は、最もあり10お勧めします。これは、IP手順は、タンパク質 - タンパク質相互作用を中断することなく続行することができます。さら.......
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開示事項
著者らは開示するものは何もない。
謝辞
この研究は、アステラス代謝障害研究財団(HT)、武田科学振興財団(HT)、および日本学術振興会科学研究費補助金若手研究者(B)の支援を受けて行われました。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | Thermo Fisher Scientific | 11668019 | |
| Protease Inhibitor Cocktail (EDTA free) (100x) | nacalai tesque | 03969-21 | |
| ANTI-FLAG M2 Affinity Gel | Sigma-Aldrich | A2220 | |
| Micro Bio-Spin Columns | BIO-RAD | 732-6204 |
参考文献
- De Las Rivas, J., Fontanillo, C. Protein-protein interactions essentials: key concepts to building and analyzing interactome networks. PLoS Comput.Biol. 6 (6), e1000807(2010).
- Westermarck, J., Ivaska, J., Corthals, G. L. Identification....
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再版と許可
