脳転移のマウスモデルを生成するために頸動脈内癌細胞注入

サマリー

脳転移は、治療の選択肢が緩和的に残っているが、その発生率が増加しているとして緊急に満たされていない医療ニーズとなっています。癌細胞の頸動脈内動脈注射を介して脳転移の実験動物モデルを作成することは、疾患の生物学および新規介入計画の評価の機構研究を容易にします。

要約

転移は、患者の体内の二次部位での広がりと悪性細胞の増殖は、癌関連死亡率の> 90％を占めます。最近、新しい治療法で印象的な進歩は飛躍的に多くの癌患者の生存および生活の質の向上を延長しています。悲しいことに、脳転移再発の発生率が急上昇して、すべての現在の治療は、単なる姑息です。したがって、良好な実験動物モデルが緊急疾患生物学の詳細な研究を容易にし、前臨床評価のための新規な治療法を評価するために必要とされます。しかし、癌細胞の尾静脈注射を介して、 インビボ転移アッセイにおける標準は、主に肺転移病変を生成します。動物は通常、脳転移のいずれかの意味の伸長前に肺腫瘍負荷に屈します。腫瘍細胞の心臓内注射は、脳を含む複数の器官部位への転移病変を生成します。しかし、variabiこのモデルを用いて製造腫瘍増殖のリティは、治療効果を評価する際に、その有用性を減衰大きいです。脳転移の研究のための信頼性と一貫性の動物モデルを生成するには、ここでは、腫瘍細胞の頸動脈内注射を介して家のマウス（ ハツカネズミ ）における実験的脳転移を製造するための手順について説明します。このアプローチは、このように基本的な生物学的メカニズムを研究し、新規治療薬を評価するために研究努力を促進する、いずれかの同様の増殖率および死亡率の特性を有する脳転移担持マウスの大量生産を可能にします。

概要

中枢神経系（CNS）への癌の転移は壊滅的な疾患であり、脳実質または軟膜（「脳転移が「この資料の両方を意味する）のいずれかを含むことができます。 1 ^1、2：それは> 10で一次神経膠腫をより多かっ、支配的な頭蓋内悪性腫瘍です。肺癌、乳癌、および黒色腫は脳転移^3,4の高い発生率を生成トップ三大腫瘍性疾患です。近年では、新たな癌治療中の印象的な進歩は劇的に生存を延長し、多くの癌患者の生活の質を改善しています。しかし、再発時に、脳転移の発生率が急速に上昇しています。例えば、抗HER2抗体トラスツズマブ（ハーセプチン）は、HER2 +乳癌患者で有意な臨床効果を示しました。まだ不穏な傾向が出てきましたこれらの患者における：その頭蓋外全身性疾患最初に、後に脳転移^5、6、7を開発トラスツズマブ治療の恩恵を受けたものの1/3まで。悲しいことに、脳転移を有する患者は、通常、生活の質の外傷性劣化を経験し、ほとんどすべての現在の治療に対して難治性であり、診断後の彼らの1年生存率はわずか^〜20％8です。 （ステロイド、頭蓋放射線療法、および選択された患者における外科的切除を含む）脳転移のための現在の治療は、単に⁹治癒的ではなく、姑息されています。そのため、脳転移は、新規癌治療のこの時代の次の印象的な課題として浮上しています。患者が診療所に日々直面している満たされていない課題を解決するために、我々は早急に優れた脳転移の根底にあるメカニズムを理解し、新しい治療法を開発するためにこの知識を使用する必要があります。

転移性癌細胞による脳の成功したコロニー形成は、血液脳関門（BBB）のバイパスのような複数の生物学的な選手の複雑な相互作用によって媒介される一連の機能の性能を必要とし、脳の固有から逃れますex vivoでまたはin vitroシステムで再現されているいずれも免疫防御的なメカニズム^10、。したがって、in vivoモデル適切かつ忠実な脳転移の研究のために重要です。従来のインビボ転移アッセイは、肺から取り出すときにひっかかるする細胞の大部分をリードし、尾静脈注射を介してがん細胞を紹介します。脳転移病巣はほとんど肺¹¹内の腫瘍負荷によって引き起こされる、動物の死を前に、これらのモデルで生産されていません。癌細胞の直接脳内注射は、CNSにおける一貫した腫瘍の成長を生じ、一次神経膠腫の研究で広く用いられています。しかし、SUCH注射は、BBBを損なうし、このモデルの生理的関連性についての懸念の両方の主要なポイント、注射部位の外傷性損傷を引き起こします。別の頻繁に使用される癌細胞の導入路、心臓内注射、管理し、CNSへの実験的転移を生み出すん簡単です。しかし、CNS以外の臓器サイトへの同時転移は常に生成され、動物の死亡率^11を引き起こす可能性があり^ます 。従って、このモデルの可変性の高い、動物の限られた数の生物学的機構又は治療薬の定量的評価のために、それは不適切になります。

ここでは、総頸動脈への癌細胞の注射を介して実験的脳転移を生成する手順を説明します。我々は、脳転移の転移カスケードに個々の遺伝子の貢献を分析し、治療的介入の有効性を評価するために、このアプローチを使用していますS ^12、13。このアプローチの主な利点は、再現性の変動の低度の高度です。主な欠点は、顕微手術を実行するために必要な精巧さと器用さです。

プロトコル

倫理の声明：すべての動物実験は、テキサス大学MDアンダーソンがんセンターの施設内動物管理使用委員会（IACUC）によって承認されました。

1.注射用癌細胞を準備します

1. 1日か2日の注入前に癌細胞をシード。特殊媒体は、特定の細胞株について、文献に示されない限り、10％FBSを補充したDMEM / F12培地は、使用します。
2. 37℃で2分 - 1のためのトリプシン処理（0.25％）の前に一回無血清培地との最初の洗浄により80％コンフルエンス - 手術の日に、収穫細胞は、彼らが70に到達したとき。 DMEM / F12培地をFBSを含有する10％が0.25％トリプシンをクエンチするために細胞に加えます。
3. 3分間80×gで細胞を遠心分離します。細胞株に応じて、5×10 ⁶細胞/ ml -無血清培地で洗浄細胞を2回1にハンクス平衡塩溶液（HBSS）で、残存血清を除去し、血球計で細胞を計数し、再懸濁します。氷の上に保管してください注射時まで。
   注：MDA-MB-231乳癌細胞およびK1735メラノーマ細胞を本研究に使用した、両方の細胞株は、/ mlの濃度が2×10 ⁶個^の細胞で使用しました。過剰治療は転移アッセイの成果に影響を与える可能性があるとして、できるだけ短いトリプシン処理時間をおいてください。

2.腫瘍細胞注射のためにマウスを準備

1. 腹腔内ケタミン/キシラジンのカクテルの（IP）注射（ケタミンを100mg / kgを、キシラジン10mg / kgの）によってマウスを麻酔。
2. 動物の足をつまんで完全に麻酔を確認し、応答の欠如を観察します。
3. （タンパク質ゲルを鋳造するために使用される）ガラス板上にマウスを置き、ゴムバンドで固定します。
4. 必要に応じて、シェービングや脱毛製品の少量を適用し、紙タオルで髪を拭き取ることにより、首の毛を取り除きます。注：彼らは体毛を持っていないとして、ヌードマウスを使用している場合は、このステップをスキップします。
5. 適用することにより、首の皮膚をきれいにしてくださいポビドンヨードおよび70％のアルコール。
6. 解剖顕微鏡のステージ上にマウスを置き、
7. 手術用メスで約1センチの皮膚を切開してください。
8. ぶっきらぼう下に頸動脈を露出させるために歯付き鉗子で筋肉を解剖。
9. 手術用鉗子で隣接する迷走神経から頸動脈を分離します。
10. 手術用鉗子を使用して、より小さなコットンボールに、綿球からいくつかの綿を分離湿らせ、そしてファッション。注射の意図された部位の頸動脈の下にこのバッファ湿コットンボールを置きます。
11. コットンボールに縫合糸の遠位端と近位を置き、緩い結び目を作ります。注射部位への血流を遮断するために、近位結び目を締めます。
12. コットンボールに頚動脈が新鮮な赤い血と完全に加圧された表示された場合は、癌細胞の注射に進みます。

頚動脈に3癌細胞注入

1. ボルテックスし、100μlのOを描きますシリンジにF癌細胞。
2. 解剖顕微鏡下で、ゆっくりとコットンボールの上に座って頸動脈の内腔に（ベベルを上にして）31 G針を挿入します。
3. ゆっくりと頸動脈に注射器から細胞を注入します。緩衝癌細胞が循環中に押し込まれたときに成功した注射は、近くの血管や筋肉組織の変色によって、顕微鏡下で観察することができます。
4. ボリューム全体の注入が完了すると、逆流を防止するために穏やかに遠位頚動脈を持ち上げます。
5. 素早く注入プロセスを完了するために、遠位の結び目を締めます。
6. 注入が完了した後、合字を締めし、解剖顕微鏡下でマイクロはさみで余分な絹縫合糸をトリミング。創傷部位をカバーするために分離された筋肉を戻します。 2つのステープルで皮膚を閉じます。

4.外科回復

1. 加熱パッド上に操作動物を移動します回復のため。動物が意識を回復するために60分 - それは30を取ることができます。一方で、術後の鎮痛などの皮下注射を介して、ブプレノルフィン（0.05ミリグラム/キログラム）を管理。注：鎮痛はIACUCプロトコルを承認し、ローカルに応じて提供されるべきです。
2. 動物が目覚めると、自分の通常の動作を再開したら、彼らの住宅の場所にマウスを返します。数日後に手術のためのゲル食品でマウスを提供します。外科的な記録を維持し、部屋に保管してください。

5. in vivoイメージング非侵襲的

1. ルシフェラーゼレポーター構築物で標識された細胞は、in vivoイメージングシステム¹⁴ に用いた癌細胞の注入効率を測定します。
   注：イメージングは​​、研究動物に過度なストレスを回避するために、注射の日に実行されません。

結果

注射の質を評価することができる2つのポイントがあります。最初の可能性は、注入の間、血管の色を変化させる操作者の観察によるものです。貧しい注射からの漏れが簡単に解剖顕微鏡下で観察することができます。サポートコットンボールにマウス本体（ 図1A）とその頸動脈（ 図1B）の安定的かつ安全な配置は、頸動脈への円滑かつ成功した注射のための重要な要因です。注射の質を評価するための第二の点は、手術後の非侵襲的イメージングです。この目的のために、癌細胞は、典型的には、注射前に、ルシフェラーゼレポーターエクスビボで標識されます。 インビボイメージングにおいて 、動物のストレスを最小限に抑えるために、通常、24時間のポスト噴射を行います。強力な頭蓋内癌細胞の負荷、およびマウスの頭の中で成功した注射の結果が正のsの唯一の地域でありますignals（ 図2A）。

ディスカッション

癌細胞の成功した頸動脈注射のための最も重要な手順は次のとおりです。手術の準備のために、マウスの1）深い麻酔。 2）綿のサポートの上に頸動脈の安定した配置。成功した注入後の頸動脈の3）タイト結紮。

30分〜の深い麻酔を解剖顕微鏡下での安定した外科的なパフォーマンスのために通常必要です。我々は、マウスの麻酔のために商業的にすぐに使用できるケタミン/キシラジンのカクテルを使用します。麻酔のために使用される音量を調整する際に柔軟性を提供するために生理食塩水で2：1または1：潜在的な過剰摂取を避けるために、ケタミン/キシラジンのカクテルを1に希釈されてもよいです。あるいは、非制御薬物トリブロモエタノールで麻酔薬としても使用され得ます。しかし、我々は分解するトリブロモエタノールの傾向は、ケタミン/キシラジンのカクテルよりも効果的な麻酔薬などの物質が少なく信頼性を向上させていることを発見しました。

A着実に配置され、完全に加圧された頸動脈を大幅に癌細胞の注入を容易に。したがって、我々は非常に慎重に顕微鏡下ではなく次善の条件で注入を進める...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
ケタミン塩酸塩/キシラジン塩酸塩溶液	シグマ・アルドリッチ	K113
ルーチン実体顕微鏡 ライカM50	ライカ	M50	顕微鏡はモジュール式で、特定のスペース要件に合わせて高度に構成可能です。
皮膚を切開するための	外科用使い捨てスケープル	Integra Miltex	4-410
組織鉗子 - 1 x 2 歯	Fine Science Tools	11021-12	鈍く解剖する
Dumont #5 - 鏡面仕上げ鉗子	Fine Science Tools	11252-23	頸動脈を分離して注射用に準備する
Spring Scissors	Fine Science Tools	15025-10	縫合糸を切断する
EZクリップキット	Stoelting	59020	創傷閉鎖
用 BDインスリン注射器	ベクトン・ディキンソン		細胞注射用
328438 IVIS Spectrum In Vivo イメージングシステム	PerkinElmer	124262

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