Method Article

頭蓋冠欠損治癒モデルで使用するためのBMPR-IB +脂肪由来間質細胞の迅速な単離

DOI:

10.3791/55120

⸱

February 24th, 2017

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1Hagey Laboratory for Pediatric Regenerative Medicine, Division of Plastic and Reconstructive Surgery, Department of Surgery, Stanford University School of Medicine

In This Article

Summary

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脂肪由来の間質細胞は、患者自身の細胞から新しい組織を改変するのに役立つかもしれません。骨形成能力が増加したヒト脂肪由来間質細胞(ASC)の亜集団を単離し、続いてin vivo calvarial healalアッセイで細胞を適用するためのプロトコルを提示します。

Abstract

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浸潤性の癌、大怪我、および感染症は、患者自身の体から既存の骨で再建するには大きすぎる骨の欠陥を引き起こす可能性があります。患者自身の細胞を使用して骨をde novoで成長させる能力があれば、天然の骨を採取する罹患率なしに、骨の欠損を適切な組織で埋めることができます。脂肪由来間質細胞(ASC)は、患者自身の脂肪組織という豊富な供給源から得られるため、組織工学の供給源としての利用に関心が集まっています。ただし、ASCは不均一な集団であり、一部の亜集団は他の亜集団よりもこのアプリケーションでより効果的である可能性があります。ASCの最も骨形成性の高い集団を分離することで、骨工学プロセスの効率と有効性を向上させることができる。このプロトコルでは、ASCはヒトドナーの皮下脂肪組織から得られます。マーカーBMPR-IBを発現するASCの亜集団は、FACSを用いて単離されます。次に、これらの細胞をin vivoの頭蓋骨欠損治癒アッセイに適用し、未分類の細胞と比較して骨形成再生能が改善されていることがわかりました。

Introduction

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傷害、感染症、または浸潤がんに起因する主な骨欠損は患者の回復と生活の質に大きな影響を与えます。技術は、他の場所で、患者自身の体内でより健康な骨でこれらの欠陥を埋めるために存在するが、この転送は、独自の罹患率および合併症の1、2、3のリスクを伴います。さらに、いくつかの欠陥が十分なドナー骨が欠損を埋めるために使用できないほど大規模または複雑です。補綴デバイスは、骨欠損を充填するための潜在的なオプションですが、これらは、感染リスク、ハードウェア障害、および異物反応4を含むいくつかの欠点と関連しています。

これらの理由のために患者自身の細胞5を用いて、生物学的代用骨を操作する可能性に大きな関心があります。脂肪由来間質細胞（ASCに）彼らは、患者自身の脂肪組織で豊富に入手可能であり、それらは新しい骨組織6,7を生成することにより骨欠損を治癒する能力が実証されているため、このアプリケーションの可能性を有しています。 ASCを、細胞の多様な集団であり、いくつかの研究は、特定の細胞表面マーカーに....

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Protocol

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注：サンプルは、インフォームドコンセントを与えた患者から得ました。すべてのプロトコルを見直し、適切なスタンフォード大学の治験審査委員会によって承認されました。ヒト組織および細胞を処理している間、常にあなたの機関が指定されているように、バイオセーフティレベル2（BSL2）の注意事項に準拠しています。

試薬の調製

  1. FACS緩衝液を準備します。500 mLに滅菌リン酸緩衝生理食塩水（PBS）を10 mLのFBS、5 mLのポロクサマー188と5 mLのペニシリン - ストレプトマイシンを追加します。
  2. 混合物を消化する準備：0.375グラムC. hemolyticumコラゲナーゼII型粉末と5 mLのポロクサマー188〜500 mLの滅菌199 / EBSS媒体を追加します。
  3. 標準培地を準備します：500mLのダルベッコ改変イーグル培地に50 mLのFBSおよび5mLのペニシリン - ストレプトマイシンを追加します。

2.収穫とのASCの単離

注：適切な機関の承認がヒト組織の使用時や、時間を単離するための場所であることを確認してくださいUMAN幹細胞。人間の腹部、脇腹を取得するか、または選択科目脂肪吸引を受けた健康なドナーからの皮下脂肪を太もも。プラスチック製の吸引キャニスターに脂肪をしてくだ....

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Results

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手術の日に行われたマイクロCTスキャンは明らかに頭蓋骨の欠陥が表示されます。この時点で4ミリメートルの欠陥に何の内部成長はありません。後続のスキャンをベースラインと比較して時間をかけて欠陥の大きさを定量化するために時間をかけて得られます。 BMPR-IB +細胞を播種欠陥は、BMPR-IB-と未整理の細胞（ 図5）と比較して、欠陥のより迅速な閉鎖を実証する必要があります。また、欠陥を含む頭蓋骨の一部を脱灰することができ、標準的な方法12を用いて、組織学のために処理しました。 Movatのペンタクロム染色で染色された切片は、他の細胞集団（ 図6）と比較してBMPR-IBの細胞で処理された欠陥に大きな骨の再生を明らかにします。

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Discussion

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プロトコル内の重要なステップ

ASCの収穫時には、重要なステップは、コラゲナーゼと脂肪の適切な消化です。不十分な消化は、ASCを低収量になります。 BMPR-IB +細胞のFACSソーティングの際には、慎重に陽性のためのゲートを定義することが重要です。あまりにも緩くゲートを定義すると、純粋ではないソートされた集団になることがあります。頭蓋冠欠損の作成時に、頭蓋骨の骨を通して欠陥をドリルダウンするが、硬膜に進出しないことが重要です。これは、多量の出血や動物の安楽死が必要となる脳の露出が発生します。

修正およびトラブルシューティング

頭蓋冠欠陥手術麻酔について、我々の研究室は、吸入イソフルランを使用することを好むが、他のオプションは、腹腔内ケタミン10 mg / mlで、正常なSA内キシラジンの1mg / mLの最終濃度を含む混合物を注入することですライン。この混合物の標準用量は、30グラムのマウスのための300μLです。これは、手術中にイソフルランノーズコーンにあるように、マウスを必要と.......

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Disclosures

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著者らは開示すべきことはない。

Acknowledgements

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C.D.M. は、American College of Surgeons (ACS) Resident Research Scholarship によって支援されました。M.S.H. は、California Institute for Regenerative Medicine (CIRM) Clinical Fellow training grant TG2-01159 によって支援されました。M.S.H.、H.P.L.、M.T.L.は、米国顎顔面外科学会(ASMS)/顎顔面外科財団(MSF)研究助成賞の支援を受けました。H.P.L.は、NIHの助成金R01 GM087609と、アンソニー・シュウに敬意を表してイングリッド・ライとビル・シュウからの贈り物によって支援されました。H.P.L.とM.T.L.は、Hagey Laboratory for Pediatric Regenerative MedicineとThe Oak Foundationの支援を受けました。M.T.L.は、NIHの助成金U01 HL099776、R01 DE021683-01、およびRC2 DE020771の支援を受けました。D.C.W.は、NIHの助成金1K08DE024269、Hagey Laboratory for Pediatric Regenerative Medicine、およびStanford University Child Health Research Institute Faculty Scholar Awardの支援を受けまし....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
100ミクロンセルストレーナーFalcon352360
15ブレードメスMiltex4-515
24ウェルプレートCorning3524
40ミクロンセルストレーナーFalcon352340
50 mL円錐形遠心チューブファルコン352098
6-0エチロンナイロン縫合糸、18インチ、P-3針、 Ethicon1698G
抗 BMPR-IB 一次抗体R&DシステムFAB5051A
BioGel PI手術用手袋Mölnlycke ヘルスケアALA42675Z
Buprenorphine SRZooPharm
Castro-Viejo ニードル ドライバーファイン サイエンス ツール12565-14
CD1 ヌード マウスチャールズ リバー086
コラゲナーゼ タイプ II 粉末Gibco17101-015
DMEM mediumGibco10564-011
ドリル:円形ナイフ 4.0 mmXemax サージカルCK40
ドリル:Z500 ブラシレス マイクロモーターNSKNSKZ500
FBSGicbo10437-077
フィッシャーブランド吸収性アンダーパッド、20インチ x 24インチフィッシャーサイエンティフィック14-206-62
フィッシャーブランド滅菌綿ガーゼパッド、4インチ x 4インチフィッシャーサイエンティフィック22-415-469
ケント・サイエンティフィックDCT-20
ハイクロン 199/EBSS 中型GE ライフサイエンスSH30253.01
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PBSGibco10010-023
Pen-StrepGibco15140-122
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RBC 溶解バッファーSigma11814389001
Webcol アルコール調製スワブCovidien6818
します

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Silber, J. S., et al. Donor site morbidity after anterior iliac crest bone harvest for single-level anterior cervical discectomy and fusion. Spine (Phila Pa 1976). 28 (2), 134-139 (2003).
  2. Giannoudis, P. V., Dinopoulos, H., Tsiridis, E. Bone substitutes: a....

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