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方法論記事

頭蓋冠欠損治癒モデルで使用するためのBMPR-IB +脂肪由来間質細胞の迅速な単離

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DOI：

10.3791/55120

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2017年2月24日

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1Hagey Laboratory for Pediatric Regenerative Medicine, Division of Plastic and Reconstructive Surgery, Department of Surgery, Stanford University School of Medicine

この記事について

サマリー

脂肪由来の間質細胞は、患者自身の細胞から新しい組織を改変するのに役立つかもしれません。骨形成能力が増加したヒト脂肪由来間質細胞(ASC)の亜集団を単離し、続いてin vivo calvarial healalアッセイで細胞を適用するためのプロトコルを提示します。

要約

浸潤性の癌、大怪我、および感染症は、患者自身の体から既存の骨で再建するには大きすぎる骨の欠陥を引き起こす可能性があります。患者自身の細胞を使用して骨をde novoで成長させる能力があれば、天然の骨を採取する罹患率なしに、骨の欠損を適切な組織で埋めることができます。脂肪由来間質細胞(ASC)は、患者自身の脂肪組織という豊富な供給源から得られるため、組織工学の供給源としての利用に関心が集まっています。ただし、ASCは不均一な集団であり、一部の亜集団は他の亜集団よりもこのアプリケーションでより効果的である可能性があります。ASCの最も骨形成性の高い集団を分離することで、骨工学プロセスの効率と有効性を向上させることができる。このプロトコルでは、ASCはヒトドナーの皮下脂肪組織から得られます。マーカーBMPR-IBを発現するASCの亜集団は、FACSを用いて単離されます。次に、これらの細胞をin vivoの頭蓋骨欠損治癒アッセイに適用し、未分類の細胞と比較して骨形成再生能が改善されていることがわかりました。

概要

傷害、感染症、または浸潤がんに起因する主な骨欠損は患者の回復と生活の質に大きな影響を与えます。技術は、他の場所で、患者自身の体内でより健康な骨でこれらの欠陥を埋めるために存在するが、この転送は、独自の罹患率および合併症の1、2、3のリスクを伴います。さらに、いくつかの欠陥が十分なドナー骨が欠損を埋めるために使用できないほど大規模または複雑です。補綴デバイスは、骨欠損を充填するための潜在的なオプションですが、これらは、感染リスク、ハードウェア障害、および異物反応4を含むいくつかの欠点と関連しています。

これらの理由のために患者自身の細胞5を用いて、生物学的代用骨を操作する可能性に大きな関心があります。脂肪由来間質細胞（ASCに）彼らは、患者自身の脂肪組織で豊富に入手可能であり、それらは新しい骨組織6,7を生成することにより骨欠損を治癒する能力が実証されているため、このアプリケーションの可能性を有しています。 ASCを、細胞の多様な集団であり、いくつかの研究は、特定の細胞表面マーカーについて選択する強化骨形成活性8,9で細胞集団を生成することができることを示しています。最も高い骨形成能とのASCを選択するこれらの細胞を播種した足場は、大きな骨欠損を再生することができると可能性を増加させます。

骨形成タンパク質（BMP）シグナル伝達は骨分化と形成10及びBMPレセプタータイプIB（BMPR-IB）を調節するために重要であるが、ASCを11で骨形成に重要であることが知られています。最近、我々は、BMPR-IBの発現をbができることを示していますeは強化された骨形成活性12とのASCを選択するために使用します。ここでは、in vivoでの頭蓋冠欠損モデルを用いて、それらの骨形成活性のアッセイが続く人間の脂肪からBMPR-IB発現のASCを単離するためのプロトコルを示しています。

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プロトコル

注：サンプルは、インフォームドコンセントを与えた患者から得ました。すべてのプロトコルを見直し、適切なスタンフォード大学の治験審査委員会によって承認されました。ヒト組織および細胞を処理している間、常にあなたの機関が指定されているように、バイオセーフティレベル2（BSL2）の注意事項に準拠しています。

試薬の調製

  1. FACS緩衝液を準備します。500 mLに滅菌リン酸緩衝生理食塩水（PBS）を10 mLのFBS、5 mLのポロクサマー188と5 mLのペニシリン - ストレプトマイシンを追加します。
  2. 混合物を消化する準備：0.375グラムC. hemolyticumコラゲナーゼII型粉末と5 mLのポロクサマー188〜500 mLの滅菌199 / EBSS媒体を追加します。
  3. 標準培地を準備します：500mLのダルベッコ改変イーグル培地に50 mLのFBSおよび5mLのペニシリン - ストレプトマイシンを追加します。

2.収穫とのASCの単離

注：適切な機関の承認がヒト組織の使用時や、時間を単離するための場所であることを確認してくださいUMAN幹細胞。人間の腹部、脇腹を取得するか、または選択科目脂肪吸引を受けた健康なドナーからの皮下脂肪を太もも。プラスチック製の吸引キャニスターに脂肪をしてください。

  1. オリジナルのプラスチック製のキャニスターに脂肪に1：1の比率で滅菌PBSを追加します。 （500 mLの脂肪が存在する場合には、500mLのPBSを加えます）。 30秒間穏やかに撹拌することによって混合します。水性の底に沈殿する層（ 図1）した後、吸引を可能にし、吸引に取り付けられた10mLのプラスチックピペットで水層を捨てます。
  2. 大きなプラスチック容器に脂肪をデカントし、1で混合物を消化追加：1の比率。容器を閉じ、70％エタノールで外側を清掃します。パラフィンフィルムでキャップを封印。
  3. 37℃で30分間180rpmでオービタルシェーカーでこのコンテナを攪拌します。
  4. 1：1の比率で標準培地を追加することにより、消化を中和します。 （千ミリリットル脂肪混合物がある場合は、千ミリリットルを標準培地を追加します）。
  5. 均等に25の偶数に混合物を配布0 mLのプラスチック製コニカル遠心チューブと遠心分離機4℃で20分間、300×gで混合
  6. 上清を吸引し、そのままペレットを残すように注意してください。各コニカルチューブのための5 mLの標準培地中で再懸濁ペレット。
  7. 1 50mLのコニカル遠心チューブに100ミクロンのフィルターを通してサスペンションをフィルタリングします。その後、4℃で15分間、300×gで遠心。
  8. 上清を吸引し、5mLの室温RBC溶解緩衝液中にペレットを再懸濁します。混合物を室温（RT）で15分間300×gで遠心分離後、室温で5分間静置します。
  9. 上清を吸引除去し、15 mLの標準培地でペレットを再懸濁。再び50mLのコニカル遠心チューブに100ミクロンのフィルターを通して濾過します。
  10. 新しい50 mLコニカルでは、密度に基づく分離（試薬のリストを参照）用に設計された15 mLのポリスクロース溶液を添加。その後、45°の角度でチューブを保持し、慎重の側に細胞をピペットチューブポリスクロース溶液（ 図2）の上に細胞懸濁液を静か層ようにします。
    注：これは、溶液の表面上にピペット細胞にとって重要です。これは不可逆的な混合物を作成するように、細胞の懸濁液にポリスクロースソリューションを追加しないでください。同様に、ポリスクロース溶液の中心に細胞をピペットではありません。
  11. RTで10分間、300×gで遠心分離し、この混合物を。低加速度を使用します（2から10のうち3）と、このステップのためにゼロに遠心機のブレーキ機能を設定します。
    注：途中で曇った、底部に明確な、とサーモン色の上に：3層が表示されます。中間層は、目的の細胞が含まれています。
  12. 10 mLのピペットを使用すると、慎重に、中間層を除去し、新しい50 mLコニカルチューブに移します。
    注：完全に中間層を転写し、中間層の一部を残すことよりもプロセスにトップとボトム層のいくつかを取ることをお勧めします。
  13. 血球計数器を用いて細胞を数え、総生細胞数を決定します。
    注：私たちは、通常、細胞を計数するのを助けるために0.8％の最終濃度まで細胞混合物に添加し、トリパンブルーを使用します。生存生細胞は青色色素を占有されることはありませんし、白表示されます。

BMPR-IB陽性細胞と細胞を含む足場の調製のためのソート3. FACS

  1. 4℃で5分間、300×gで細胞懸濁液を遠心。 （ステップ2.13で行わ細胞数に基づく）100μLあたり100万個の細胞の濃度でFACS緩衝液中で細胞を再懸濁します。
  2. ラベルされたプラスチック製遠心管に少なくとも10万個の細胞を移し、「BMPR-IB。」これとは別に、標識された別々のプラスチック製遠心チューブに100μLのFACS緩衝液で1万個の細胞を移す「未染色。」 「未染色 "チューブに1mLのFACS緩衝液を追加します。 FACSはEXPERの一部を選別しながら、氷上で、FACS緩衝液中の細胞の残りを保ちます形態が行われています。 「未整理」をこれらの細胞を標識後で実験におけるコントロールとしてこれらを使用してください。
  3. 製造元の指示に従って「BMPR-IB」チューブに蛍光抗ヒトBMPR-IB抗体の適切な量を追加します。抗体を配布するために静かに上下混合物をピペット。
    注：私たちは、1：10希釈でヒトBMPR-IB / ALK-6 APC結合抗体を使用します（詳細については、試薬のリストを参照）。しかし、異なる製造業者からの抗体は、別の推奨濃度を持つことになります。
  4. 光を保つ方法で、氷のバケツをカバーしています。細胞/抗体混合物を30分間（または抗体の製造者の指示に従って）のために座ってできるようにします。
    注：抗BMPR-IBの抗体は二次抗体を必要とする主要な非結合抗体として来る場合は、製造元の指示に従って二次抗体と氷上で別々の染色工程を行います。
  5. で両方の管を遠心4℃で5分間、300×gで。ペレットを吸引しないように注意しながら、上清を吸引。 1mLのFACS緩衝液中でペレット化した細胞を再懸濁します。再び5分間、300×gでチューブを遠心します。注意深く上清を吸引し、1mLの当たり100万個の細胞の濃度になるようにFACS緩衝液中で細胞を再懸濁します。
  6. 新しいラベルされたガラスFACSチューブに40ミクロンの細胞ストレーナーを通して、「未染色」、BMPR-IB「フィルタ」と「未整理」細胞。細胞をフィルターに残されていないことを確認するために、500μLのFACS緩衝液でフィルターを洗浄します。また、「BMPR-IB陽性」とラベルされた二つの別々のプラスチック製遠心チューブに2 mLの標準培地を追加し、「BMPR-IB陰性。」 FACS機で選別された細胞を収集するために、これらの2つを使用してください。
  7. FACSのマシンでは、蛍光マーカーのための負のゲートを定義するために、未染色細胞を使用しています。
  8. BMPR-IB陽性および陰性細胞がコン各チューブに並べ替え、100ミクロンのノズルを使用して標準培地をtaining。 FACSマシンはこの能力を持っている場合、ソート中に4℃で冷やしこれらのチューブを保管してください。
    注：シャロンらによってJOVEの記事13を参照してください。 FACS選別のための優れたプロトコルのために。
  9. 血球計数器を使用して、各チューブに細胞を数えます。 4℃で5分間、300×gで ""、BMPR-IB-陽性」BMPR-IB陰性」および「未整理」チューブを遠心し、細胞ペレットを乱さないように注意しながら、上清を吸引除去します。その後、250μLあたり100万個の細胞の濃度に標準培地で細胞を再懸濁します。
  10. プレカット4ミリメートルPLGA（ポリ[乳酸 - コ - グリコール酸]）ハイドロキシアパタイトで被覆された足場を取得します。 24ウェルプレートのウェルに各足場を置きます。ソートされていない、BMPR-IB陽性、およびBMPR-IB-負（ 図3）：3つのグループからの細胞懸濁液50μL（。 私は .E、200,000細胞）で各足場をカバーしています。
    注：してくださいローらによるJOVEの記事14を参照してください。 PLGA足場の構築の詳細については。
  11. 部分的に、（足場の乾燥を防ぐために）、その蓋付きプレートを覆い、そして30分間37℃で細胞培養インキュベーター中でインキュベート標準培地と周囲の空のウェルを満たします。

頭蓋冠の欠陥とACS含有足場の応用4.作成

注：適切な機関の承認が生きたマウスにおける頭蓋冠の欠陥の発生のための場所であることを確認してください。このプロトコルは、スタンフォード大学の施設内動物管理使用委員会によって承認されています。

  1. 吸入イソフルランガスまたは注入された長時間作用型麻酔薬カクテルのいずれかを使用してCD-1ヌードマウスを麻酔。
    1. 単独のガスを用いることが、麻酔チャンバー内にマウスを置き、2の酸素の流れを開始 - イソフルランを2％の濃度で3 L /分。マウスがfしたらully無意識、吸収性パッドで温水循環毛布の上に発生しやすい、それを配置し、酸素およびイソフルランの同じ濃度の麻酔ノーズコーンにその鼻を置きます。慎重に呼吸数を監視し、必要に応じてイソフルランの濃度を調整します。
    2. 上記のように麻酔室でマウスを麻酔、注入された長時間作用型麻酔薬カクテルを使用し、麻酔薬カクテルを注入します。麻酔室からマウスを削除し、その動作を観察します。
      注：マウスを簡単に麻酔から出てくるかもしれませんが、数分以内に再び完全に注入された麻酔薬の影響下で麻酔されるべきです。吸収性パッドで覆われた温水循環毛布にマウスを転送します。
      注：麻酔薬カクテルのために、我々は通常の生理食塩水でケタミンを10mg / mLとキシラジンの1mg / mLを含む混合物で、腹腔内に配信することをお勧めします。この混合物の標準用量は、100mg / kgおよびキシラジン10mg / kgのをケタミンする等しい30グラムのマウス、300μL。注射用麻酔薬に関する詳細については、議論のセクションを参照してください。
    3. 麻酔の深さを決定するために、つま先のピンチ操縦を使用してください。それは軽く外科医によって挟まれたときに適切に麻酔したマウスは、その足を撤回しません。
    4. 角膜の乾燥を防ぐために、眼軟膏を適用します。
    5. 1ミリグラム/ kgのブプレノルフィンSRを皮下に投与します。
      注：前の優れた疼痛緩和における手術結果に鎮痛を提供します。
    6. 全体の手順の間、マウスの呼吸数を監視します。
      注： - 100呼吸/分で適切にイソフルラン下で麻酔したマウスは、50の呼吸速度を持つべきです。減少した呼吸数は麻酔が深すぎることを示している可能性がありながら、呼吸数の増加は、麻酔が軽すぎることを示しています。
  2. ポビドン-IODと頭蓋骨の背側面の皮膚をPREPINEの溶液を70％エタノールで3回行いました。露出された手術部位を残して、滅菌ドレープでドレープ。
    注：無菌手術用手袋を着用し、手順中に滅菌技術を維持します。唯一のそのような無菌のドレープやオートクレーブ処理機器として無菌面およびオブジェクトをタッチします。アシスタントは、照明、オープン縫合パケットなどを調整しています
  3. 15ブレードメスを用いて、背側頭蓋骨の大部分にわたって延びている矢状正中切開を行います。細かい歯付き鉗子を使用して、右頭頂骨を露出するために切開の右側に皮膚を撤回。
  4. オートクレーブさ4ミリメートルダイヤモンドコーティングされた穿孔ドリルビットとドリルを使用して、頭頂骨を通して欠陥をドリル。硬膜層に骨過去の欠陥を延長しないでください。 （ 図4）
  5. 欠損部に足場を置き、その後、ナイロン縫合糸を実行すると皮膚切開を閉じます。
  6. マウスを監視し、標準的な術後ケアaを提供機関のガイドラインにccording。
    1. それが回復しながらきれいなケージの中に清潔なペーパータオル上でマウスを保管してください。ケージの半分は、温水循環毛布の上に配置されるべきであるとマウスは、最初はこの半分に配置する必要があります。
    2. それは歩行するのに十分な意識を取り戻したまでマウス無人のまま放置しないでください。それは完全に回復するまで、他のマウスを用いたケージに手術を受けたマウスを返さないでください。
  7. 試験される各足場のための新しいマウスを使って上記の手順を繰り返します。ホットビーズ滅菌または他の適切な方法を用いて、手術の間に外科用器具を滅菌します。
  8. まもなく手順の後、その後2,4,6、および8週目に、頭蓋冠欠損閉鎖の速度を分析するためのマイクロCTスキャンを使用します。
    注：レヴィらによる記事を参照してください。頭蓋冠の欠陥のマイクロCTスキャンの説明については6。
  9. 実験はcompleある場合TE、クリーン安楽死室にそれらを配置し、2 L /分の速度でチャンバ内への二酸化炭素ガスの流れを開始することによって、マウスを安楽死させます。呼吸後に安楽死を確認するために頸椎脱臼を行う（約10分後に）完全に止まっています。
  10. 実験が完了した後、必要に応じて、使用の切片、組織学的染色は、欠陥内の骨形成を評価しました。
    注：マッカードルらによる記事を参照してください。組織学のために骨の標本を作製する詳細については、12。組織学的および染色技術の総説については、そのような外科病理 15 のマニュアルとして組織学的マニュアルを参照してください。

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結果

手術の日に行われたマイクロCTスキャンは明らかに頭蓋骨の欠陥が表示されます。この時点で4ミリメートルの欠陥に何の内部成長はありません。後続のスキャンをベースラインと比較して時間をかけて欠陥の大きさを定量化するために時間をかけて得られます。 BMPR-IB +細胞を播種欠陥は、BMPR-IB-と未整理の細胞（ 図5）と比較して、欠陥のより迅速な閉鎖を実証する必要があります。また、欠陥を含む頭蓋骨の一部を脱灰することができ、標準的な方法12を用いて、組織学のために処理しました。 Movatのペンタクロム染色で染色された切片は、他の細胞集団（ 図6）と比較してBMPR-IBの細胞で処理された欠陥に大きな骨の再生を明らかにします。

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ディスカッション

プロトコル内の重要なステップ

ASCの収穫時には、重要なステップは、コラゲナーゼと脂肪の適切な消化です。不十分な消化は、ASCを低収量になります。 BMPR-IB +細胞のFACSソーティングの際には、慎重に陽性のためのゲートを定義することが重要です。あまりにも緩くゲートを定義すると、純粋ではないソートされた集団になることがあります。頭蓋冠欠損の作成時に、頭蓋骨の骨を通して欠陥をドリルダウンするが、硬膜に進出しないことが重要です。これは、多量の出血や動物の安楽死が必要となる脳の露出が発生します。

修正およびトラブルシューティング

頭蓋冠欠陥手術麻酔について、我々の研究室は、吸入イソフルランを使用することを好むが、他のオプションは、腹腔内ケタミン10 mg / mlで、正常なSA内キシラジンの1mg / mLの最終濃度を含む混合物を注入することですライン。この混合物の標準用量は、30グラムのマウスのための300μLです。これは、手術中にイソフルランノーズコーンにあるように、マウスを必要と...

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開示事項

著者らは開示すべきことはない。

謝辞

C.D.M. は、American College of Surgeons (ACS) Resident Research Scholarship によって支援されました。M.S.H. は、California Institute for Regenerative Medicine (CIRM) Clinical Fellow training grant TG2-01159 によって支援されました。M.S.H.、H.P.L.、M.T.L.は、米国顎顔面外科学会(ASMS)/顎顔面外科財団(MSF)研究助成賞の支援を受けました。H.P.L.は、NIHの助成金R01 GM087609と、アンソニー・シュウに敬意を表してイングリッド・ライとビル・シュウからの贈り物によって支援されました。H.P.L.とM.T.L.は、Hagey Laboratory for Pediatric Regenerative MedicineとThe Oak Foundationの支援を受けました。M.T.L.は、NIHの助成金U01 HL099776、R01 DE021683-01、およびRC2 DE020771の支援を受けました。D.C.W.は、NIHの助成金1K08DE024269、Hagey Laboratory for Pediatric Regenerative Medicine、およびStanford University Child Health Research Institute Faculty Scholar Awardの支援を受けました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
100ミクロンセルストレーナーFalcon352360
15ブレードメスMiltex4-515
24ウェルプレートCorning3524
40ミクロンセルストレーナーFalcon352340
50 mL円錐形遠心チューブファルコン352098
6-0エチロンナイロン縫合糸、18インチ、P-3針、 Ethicon1698G
抗 BMPR-IB 一次抗体R&DシステムFAB5051A
BioGel PI手術用手袋Mölnlycke ヘルスケアALA42675Z
Buprenorphine SRZooPharm
Castro-Viejo ニードル ドライバーファイン サイエンス ツール12565-14
CD1 ヌード マウスチャールズ リバー086
コラゲナーゼ タイプ II 粉末Gibco17101-015
DMEM mediumGibco10564-011
ドリル:円形ナイフ 4.0 mmXemax サージカルCK40
ドリル:Z500 ブラシレス マイクロモーターNSKNSKZ500
FBSGicbo10437-077
フィッシャーブランド吸収性アンダーパッド、20インチ x 24インチフィッシャーサイエンティフィック14-206-62
フィッシャーブランド滅菌綿ガーゼパッド、4インチ x 4インチフィッシャーサイエンティフィック22-415-469
ケント・サイエンティフィックDCT-20
ハイクロン 199/EBSS 中型GE ライフサイエンスSH30253.01
Isothesia isofluraneヘンリー・シャイン 
050033 歯付きマイクロ鉗子RobozRS-5150
歯付きマイクロ鉗子RobozRS-5150
パラフィンフィルム (パラフィルム)BemisPM996
PBSGibco10010-023
Pen-StrepGibco15140-122
PLGA scaffolds独自の配合
Poloxamer 188、10%SigmaP5556-100ML
ポリライニング滅菌フィールド、18 "x 24"Busse病院の使い捨て品696適切なサイズの長方形の穴をカット
ポリスクロース溶液:Histopaque 1119Sigma11191
Povidoneヨウ素調製液MedlineMDS093944H
Puralube ワセリン眼科用軟膏、1/8オンス チューブDechra 獣医製品
RBC 溶解バッファーSigma11814389001
Webcol アルコール調製スワブCovidien6818
します

参考文献

  1. Silber, J. S., et al. Donor site morbidity after anterior iliac crest bone harvest for single-level anterior cervical discectomy and fusion. Spine (Phila Pa 1976). 28 (2), 134-139 (2003).
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