器官培養とマウスウォルフダクトの全マウント免疫蛍光染色

サマリー

我々は、マウスウォルフ管（WD）の単離および培養のための方法を提示します。また、蛍光タグ付けされた抗体を用いて培養/単離されたばかりのWDSのホールマウント免疫染色のための詳細な手順を示しています。一緒に、これらの技術は、WDの開発、コイリング、および分化の研究を可能にします。

要約

卵管の形態形成は、男性生殖器系を含むほとんどの哺乳動物の臓器の開発のための基本的な要件です。精巣上体、男性の生殖器官の不可欠な部分は、精子貯蔵、熟成、および輸送を担当しています。大人の精巣上体ウォルフ管（WD）として知られているシンプルかつストレート胚性前駆体から発生する非常にコイル状の管です。精巣内の精子が卵母細胞を受精することができないとして、精巣上体の適切な巻取りは、男性の生殖能力に不可欠です。しかし、精巣上体の開発とコイリングの責任のメカニズムは、部分的に起因し、全器官培養およびイメージング方法の不足のため、不明なままです。本研究では、より良い他の管状器官を研究するために適用することができるWDの巻き取り及び発達のプロセスを可視化するために、インビトロ培養系全体マウント免疫プロトコルを記述する。

概要

男性生殖器系は、主に精巣から成る、生殖細胞の発達および分化、および精子の成熟、輸送、および保管のために必要とされる複雑な管システムのためのサイト。精巣上体は、輸精管と精巣および生殖細胞¹の後の精巣発達と成熟に主に関与を接続する管状の器官です。高度にコイル状の成体マウスの精巣上体は、シンプルでストレート前駆体管、ウォルフ管^（WD）1から開発しています。精子が雌性の生殖細胞^2を受精する能力を獲得するための精巣上体の複雑かつコイル構造が必須です。男性の生殖能力のために、このような本質的な臓器の形状に発展し、取得する方法を十分に理解されていません。様々なシグナル伝達経路は、Wntシグナル伝達経路^3,4及び経路^{5シグナリング}アンドロゲンとしてWDの発症に関与することが示されています。我々の最近の仕事は、BALの要件を確立しています出生前の開発⁴時のWDの巻き取り用のとれたWntシグナル伝達。しかし、さらなる研究が出生後の精巣上体のコイリング、細胞分化、および精巣上体上皮内および間質細胞と細胞間コミュニケーションに関与するメカニズムを理解するために必要とされています。

遺伝的に改変されたマウスモデルは、種々の器官系⁶の開発および疾患の根底にある分子機構の同定/検証のための強力なツールであることが証明されています。その広範な使用にもかかわらず、推定される遺伝子機能にに関して目標とマウス変異体の予測できない表現型、および一部のモデルでヌル変異体で無表現型、遺伝的要因と環境要因の影響を受け、労働集約を含む遺伝子改変されたマウスモデルの重大な限界があり、マウスモデルを開発する時間のかかるプロセス。したがって、唯一の遺伝的改良剤からの所見の意義の解釈fiedがマウスモデルは、常に⁶簡単ではありません。これらの制限は、我々に制御培養条件下で、リアルタイムで複数のシグナル伝達経路を操作するための柔軟性を提供し、インビトロ器官培養系で使用することによって克服することができます。器官培養系は、全体の臓器⁷の生理学および病理学を理解することに尽力しています。また、フルオロフォア標識抗体で染色した全器官の画像化は、それによって、臓器の形状、構造、および機能⁸のより良い理解を提供し、それはインビボで存在するように、三次元の文脈において関心のマーカーを可視化することを可能。

ここでは、そのようなWDSとして管状の器官の形態形成に関するさまざまな質問に答えるためにも適用することができるマウス胚性生殖隆起の単離、 インビトロ培養し、WDSの全体マウント免疫蛍光イメージングのための方法を、記載しています。このプロトコルでは、我々単離したマウス15.5日から胚性泌尿生殖器の尾根ポスト交尾（DPC）妊娠中のダムや上皮細胞マーカーの免疫染色に続いて3日間（サイトケラチン8、CK8）のためにそれらを培養し、細胞増殖マーカー（ホスホ - ヒストン3、PH 3）とアクティブβcatenin。

プロトコル

動物のケアおよび実験手順は、ニューサウスウェールズ州の動物研究法、ニューサウスウェールズ州動物実験規制、およびケアのためのオーストラリアのコードとにニューカッスル大学の動物実験倫理委員会のガイドラインに従って行われ、確認されました科学的な目的のための動物の使用。マウスに着手すべての手順は、ニューカッスル大学の動物実験倫理委員会によって承認されました。

1.タイム交尾

1. ペア6から8週齢の雄と昼光サイクルの終了直前に雌マウス。
2. 毎日、（8.00 AM日以前に）早朝膣栓の存在のために、女性を確認してください。プラグの日は0.5 DPCとして考えられています。
3. （オスなし）新しいケージに膣栓の女性を移し、プラグの日付にラベルを付けます。

マウス胚性生殖隆起の2の単離

1. マウスembryonを分離以下に説明するように、いくつかの修正を加えて^、9で説明したように15.5 DPC妊娠女性からIC生殖隆起。
2. 妊婦が午後による妊娠の次の日に入ると考えられている時のように正午前に解剖を行っています。
3. 頸椎脱臼（または施設の動物倫理委員会によって承認されたプロトコルに従って）を使用して15.5 DPC妊婦を生け贄に捧げます。
4. 吸収性のティッシュペーパーにその背中の上でマウスを維持し、70％エタノールで腹部の腹側をスプレー。
5. 鉗子で下腹部の皮膚（腹側）を持ち上げ、手術用はさみを使用して横方向の切開を行い、胸郭の端に泌尿生殖器の開口部から延びます。腹部を露出するように、動物の頭部に向けて肌を引き出します。
6. 腹膜腔を公開するために手術用ハサミで腹部の筋肉をカットします。ちょうど子宮頸部上記鉗子で妊娠子宮を取得し、カットをします。今トンに保持することによって子宮を持ち上げます膀胱o及び腹膜アタッチメントから子宮を分離するために子宮卵管接合部でのカットに続いて子宮広間膜をカット。
7. 氷冷HBSS（ハンクス液）を含む50 mLのチューブに子宮を転送します。過剰な血液を除去するために、氷冷HBSSで優しく妊娠子宮を洗ってください。
8. 氷冷HBSSを含むペトリ皿に子宮を維持し、氷上に置きます。子宮壁を切り取り、胚を取り出します。氷上でHBSS新鮮なペトリ皿に胚を保管してください。
9. きれいな滅菌ティッシュペーパーを取り、新しいペトリ皿の上に置きます。ティッシュペーパーで70％エタノールをスプレー。側面でこのティッシュペーパーで胚を維持し、 図1に点線で示すように方向に滅菌ブレードを使用して、下腹部からそれをカット。
10. 脊柱を固定することによって、滅菌スポンジベースで胚を修正しました。
11. 解剖実体顕微鏡下でそれを置き、慎重に腹側正中線に沿って切断。肝臓と腸を削除します。マウス泌尿生殖器系（腎臓、尿管、精巣、WD、および輸精管）が表示されるようになるはずです。
12. 精巣およびWDを切り取り、そして氷上で、HBSSで新鮮なペトリ皿に保管。 WDおよび精巣を取り出し、尿道への取り付けに近い輸精管を切断し、導帯からWDの下部の添付ファイルをカット。
13. （これは実験計画に従って変更される場合があります）同じグループの胚からの精巣およびWDSをプール。

胚性生殖隆起の3.文化（図2）

1. 10％FBS（ウシ胎児血清）、1％ペニシリン/ストレプトマイシンおよび1％L-グルタミンを含むDMEM / F12を補うことにより、胚生殖隆起を培養するための培地を調製します。水浴中で37°Cにメディアを温めます。
2. 24ウェル細胞培養プレートのウェルあたり培地300μLを加えます。
3. 新鮮なペトリ皿を取り、その上に無菌HBSSの小滴を置きます。ポリカーボネートトラックエッチメンブレン（0.8を入れて81;メートル）HBSSに面した輝く表面とのHBSSこのドロップに。
4. きれいな鉗子を使用すると、（上向きにし、その粗面に）膜上の2つのWDSおよび生殖腺を入れて、滅菌ワイプ/吸収紙を使用して、HBSSの最大量を削除します。吸収紙で組織に触れないでください。そうでなければ、それは、組織を損傷します。
5. WDSも生殖腺いずれも互いに接触していることを確認してください。そうでなければ、彼らはその後のインキュベーション中に一緒に固執します。
6. 空気 - 媒体インターフェースで300μLの培地と文化それらを含む24ウェルプレートのウェルに組織を有する膜を転送します。 WDSの嚢胞成長の膜の結果にあまりにも多くの培地。
7. 5％CO ₂の存在下で、37℃のインキュベーター中でプレートをインキュベートします。
8. 毎日培地を変更します。ピペットで培地を変更するには、第1ウェルから培地を除去した後、予め温め新鮮な培地300μLを追加します。
   注意：WDの形態形成の異なるシグナル伝達経路の効果を研究するために、必要な濃度での化学的活性化および/または阻害剤を培地に添加することができます。
9. 3日間培養組織。 3日以内に、15.5 DPCの胚から収集巻かWDSは非常に入り組んチューブ（ 図3B）に変身します。 Wntシグナル阻害剤、IWR1の添加は、巻きWD（ 図3C）の阻害をもたらします。
10. これらの組織を採取するために、氷冷PBSでペトリ皿を取ります。ペトリプレートに培養生殖腺およびWDを有する膜を転送します。膜をPBSに浮遊します。 PBSでそれをシンクし、生殖腺およびWDを取り出すために、膜を押します。
11. 4℃または室温で1時間、4％パラホルムアルデヒド（PFA）、O / Nで組織を固定してください。必要に応じて、固定する前に、WDSの明視野像を取ります。

4.ホールマウント免疫蛍光

1. 洗浄固定組織をPBS-T（PBS + 1％で3回RTでゆっくりと揺らし、10分ごと、とのトリトンX-100）。
2. ゆっくり揺り動かし（〜30回転）で、4℃で、段階的エタノールシリーズ（25％、50％、75％及び100％）、10分毎に組織を脱水。このステップでは、組織を75％エタノール中で4℃で保存することができます。
   1. エタノールを変更するには、2分間邪魔されずに組織を維持し、組織が落ち着くしましょう。できるだけ多くの上清を取り出した後、エタノールの次に高い濃度を追加します。組織への損傷を避けるために、ピペットチップは、いずれかの段階で組織に触れないようにしてください。
3. 脱水後、ゆっくり揺り動かしながら4℃で、エタノール（100％、75％、50％及び25％）、10分毎に段階的に直列に組織を再水和します。
4. PBS-T（PBS + 0.1％トリトンX-100）を用いて組織を洗浄し、4倍、20分毎に、室温で、穏やかで（約30 rpm）をロッキング。
5. ブロッキング緩衝液を用いて室温で1時間、組織ブロック（PBS + 1％BSA + 0.2％脱脂粉乳粉末+ 0.3％トリトンX-100）。
6. AFTERブロッキング、（ブロッキング緩衝液中に希釈した）一次抗体溶液に組織を転送し、穏やかなロッキング（〜30 rpm）で4℃でO / Nインキュベートします。用いた一次抗体の希釈液は、 材料表に記載されています。
7. 次の日は、穏やかなロッキング（〜30回転）で、室温でPBS-MT（PBS + 2％脱脂粉乳+ 0.5％のTween-20）、4倍、30分ごと、で組織を洗います。
8. ブロッキング緩衝液中で（このステップは個々の抗体の最適化を必要とする）250と緩やかに揺り動かしながら、室温で1時間インキュベート：この洗浄工程に続いて、1の希釈で二次抗体を追加します。
9. 今年以降、二次抗体は、感光性蛍光体で標識されているように、光への暴露を防止するために、アルミホイルで覆われた組織を維持します。
10. 組織は緩やかに揺り動かしながら、PBS-T（PBS + 0.1％のTween-20）、30分ごとに3倍洗います。
11. 染色された組織を取り付けるためのスライドを準備します。
    1. このために、ガラスカバースリップをカットダイヤモンドペンを用いて、薄いストリップに2つのストリップネイルエナメルを使用して、スライドガラス上の他の上の1つを貼り付けます。 2つの境界を作成し、これら2つの境界の間に組織を配置します。
    2. DAPIを含む封入剤を追加し、カバースリップ上に置きます。スライドにそれを修正するためにカバースリップの隅にネイルエナメルを適用します。
       注：組織は現在、イメージングのための準備が整いました。 -20℃でこれらのスライドを保管してください。

結果

開発中に、WDはシンプルで直管は非常に複雑で、コイル状のダクトに変換された重大な変化を受けます。上記の方法を使用して、WDSは、培養条件に類似の変換を受けます。ここでは、3 D（ 図3）培養WDSからの結果を示しています。 WDの形態形成に関与する分子メカニズムを分析するために、培養培地は、異なるシグナル伝達経路を標的とする阻害剤および活性化剤を補充することができます。 図3Cは IWR1 ^10、Wntシグナル特異的阻害剤の存在下での培養3日後に巻かWDを示しています。矢印は、（ 図3B）コイル状とコイリングWD（ 図3C）の阻害におけるWntシグナル伝達の結果の抑制を示すWDS（ 図3AおよびC）を解かマークします。従って、この培養系はdevelの間に関与する分子メカニズムを分析するために使用することができWDS（または他の器官）の発。

異なる種類の細胞を標識するために、我々は、WDS（ ...

ディスカッション

器官培養系は、伝統的な細胞培養系に比べて多くの利点を有します。このシステムは、異なる細胞型の間の元の構造関係と相互作用を保持します。これは、 インビボ系で模倣し、ニッチな要因が存在しない細胞培養研究よりも正確な情報を提供します。器官培養系の使用は、さらに、動物全体を用いて上の利点を有します。これらは、全身がすることができない動物全体を使用してのコストが高く、お手入れが簡単な器官培養系の維持、 など 。また、様々な薬理学的薬剤または薬物は、単離された/培養器官でテストすることができ、臓器の直接の応答を含んでおり、研究しました。

胚WDSの成功の培養のために考慮する必要があるいくつかの重要なステップがあります。損傷を受けた組織が十分に成長し、嚢胞にならないような組織は、それらの完全性を損傷することなく、慎重に収集しなければなりません。の上にメディアの過剰フィルタは、WDSの嚢胞の成長をもたらします。私たちはどんな汚染なしの組織培養フードの外組織の分離と文化を行いました。培地を調製し、組織培養フード内部の24ウェルプレートに添加しまし...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
24ウェルプレート	コーニング、米国	3524	は、他のベンダーHank'から購入できます
s Balanced Salt Solution (HBSS)	GE Healthcare Life Sciences, USA	SH30031.02	他のベンダーから購入できます
Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F12)	Sigma, USA	D8437	37°Cで温まる;Cウォーターバス使用前の
ウシ胎児血清(FBS)	Interpath, オーストラリア	SH30034.02	10% FBS を培地に使用
L-グルタミン	GE Healthcare Life Sciences, USA	SH30034.01	1% 濃度
使用 ペニシリン/ストレプトマイシン	Gibco, USA	15070-063	1% 濃度
使用 Whatman Nuclepore ポリカーボネート Track-Etch	Whatman、USA	110409	メンブレン(0.8 µm)
IWR1	Sigma, USA	10161-5mg	100 µ
パラホルムアルデヒド(PFA)	Electron Microscopy Sciences, USA	15710	16%ストック、4%PBS使用。有毒 - 手袋を着用し、流しに廃棄することはできません
エタノール	Thermo Scientific Fisher, USA	214-20L PL	Absolute, make 25, 50 and 75% with milliQ water.
Tween-20	Thermo Scientific Fisher, USA	2509-500ml	非常に粘性があり、
Triton X-100	Sigma, USA	T8787-50ml	非常に粘性があり、
Di-Sodium Hydrogen Phosphate	Thermo Scientific Fisher, USA	621-500mg	他のベンダーから購入できます
Sodium Di-hydrogen Phosphate	Ajax Finechem, USA	4745-500g	他のベンダーから購入できます
塩化ナトリウム	Thermo Scientific Fisher, USA	465-500g	他のベンダーから購入できます
Cytokeratin8/Troma I	Developmental Studies Hybridoma Bank, USA (DHSB)	TROMA-I	1:250 ブロッキングバッファー
アクティブ&ベータ;カテニン	細胞シグナル伝達技術, USA	D13A1	1:200 in blocking buffer
phospho-Histone 3	Millipore, MA, USA	06-570	1:200 in blocking buffer
Alexa488 Goat anti-rabbit IgG	Jackson ImmunoResearchLabs, 米国	111-545-047	1:250 ブロッキングバッファー
Alexa594 ヤギ抗ラットIgG	Jackson ImmunoResearchLabs, 米国	112-585-072	1:250 ブロッキングバッファー
グリセロール	サーモフィッシャーサイエンティフィック、米国	242-500ml	他のベンダーから購入できます
n-プロピルガレート	シグマ、米国	2370-2
-(4-アミジノフェニル)-1H -インドール-6-カルボキサミジン (DAPI)	シグマ、米国	D9564-10mg	核酸 (DNA)
ジメチルスルホキシド (DMSO)	サーモフィッシャーを染色するために使用サイエンティフィック、アメリカ	2225-500ml	溶剤
カバースリップ(24 x 50 mm)	Lomb Scientific		CS24501GP-

を使用したM濃度を分注する際に注意が必要です