我々は、マウスウォルフ管（WD）の単離および培養のための方法を提示します。また、蛍光タグ付けされた抗体を用いて培養/単離されたばかりのWDSのホールマウント免疫染色のための詳細な手順を示しています。一緒に、これらの技術は、WDの開発、コイリング、および分化の研究を可能にします。
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この記事について
サマリー
要約
卵管の形態形成は、男性生殖器系を含むほとんどの哺乳動物の臓器の開発のための基本的な要件です。精巣上体、男性の生殖器官の不可欠な部分は、精子貯蔵、熟成、および輸送を担当しています。大人の精巣上体ウォルフ管（WD）として知られているシンプルかつストレート胚性前駆体から発生する非常にコイル状の管です。精巣内の精子が卵母細胞を受精することができないとして、精巣上体の適切な巻取りは、男性の生殖能力に不可欠です。しかし、精巣上体の開発とコイリングの責任のメカニズムは、部分的に起因し、全器官培養およびイメージング方法の不足のため、不明なままです。本研究では、より良い他の管状器官を研究するために適用することができるWDの巻き取り及び発達のプロセスを可視化するために、インビトロ培養系全体マウント免疫プロトコルを記述する。
概要
男性生殖器系は、主に精巣から成る、生殖細胞の発達および分化、および精子の成熟、輸送、および保管のために必要とされる複雑な管システムのためのサイト。精巣上体は、輸精管と精巣および生殖細胞1の後の精巣発達と成熟に主に関与を接続する管状の器官です。高度にコイル状の成体マウスの精巣上体は、シンプルでストレート前駆体管、ウォルフ管（WD）1から開発しています。精子が雌性の生殖細胞2を受精する能力を獲得するための精巣上体の複雑かつコイル構造が必須です。男性の生殖能力のために、このような本質的な臓器の形状に発展し、取得する方法を十分に理解されていません。様々なシグナル伝達経路は、Wntシグナル伝達経路3,4及び経路5シグナリングアンドロゲンとしてWDの発症に関与することが示されています。我々の最近の仕事は、BALの要件を確立しています出生前の開発4時のWDの巻き取り用のとれたWntシグナル伝達。しかし、さらなる研究が出生後の精巣上体のコイリング、細胞分化、および精巣上体上皮内および間質細胞と細胞間コミュニケーションに関与するメカニズムを理解するために必要とされています。
遺伝的に改変されたマウスモデルは、種々の器官系6の開発および疾患の根底にある分子機構の同定/検証のための強力なツールであることが証明されています。その広範な使用にもかかわ....
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プロトコル
動物のケアおよび実験手順は、ニューサウスウェールズ州の動物研究法、ニューサウスウェールズ州動物実験規制、およびケアのためのオーストラリアのコードとにニューカッスル大学の動物実験倫理委員会のガイドラインに従って行われ、確認されました科学的な目的のための動物の使用。マウスに着手すべての手順は、ニューカッスル大学の動物実験倫理委員会によって承認されました。
1.タイム交尾
- ペア6から8週齢の雄と昼光サイクルの終了直前に雌マウス。
- 毎日、（8.00 AM日以前に）早朝膣栓の存在のために、女性を確認してください。プラグの日は0.5 DPCとして考えられています。
- （オスなし）新しいケージに膣栓の女性を移し、プラグの日付にラベルを付けます。
マウス胚性生殖隆起の2の単離
- マウスembryonを分離以下に説明するように、いくつかの修正を加えて、9で説明したように15.5 DPC妊娠女性からIC生殖隆起。
- 妊婦が午後による妊娠の次の日に入ると考えられている時のように正午前に解剖を行っています。
- 頸椎脱臼（または施設の動物倫理委員会によって承認されたプロトコルに従って）を使用して15.5 DPC妊婦を生け贄に捧げます。
- 吸収性のティッシュペーパーにその背中の上でマウスを維持し、....
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結果
開発中に、WDはシンプルで直管は非常に複雑で、コイル状のダクトに変換された重大な変化を受けます。上記の方法を使用して、WDSは、培養条件に類似の変換を受けます。ここでは、3 D（ 図3）培養WDSからの結果を示しています。 WDの形態形成に関与する分子メカニズムを分析するために、培養培地は、異なるシグナル伝達経路を標的とする阻害剤および活性化剤を補充することができます。 図3Cは IWR1 10、Wntシグナル特異的阻害剤の存在下での培養3日後に巻かWDを示しています。矢印は、（ 図3B）コイル状とコイリングWD（ 図3C）の阻害におけるWntシグナル伝達の結果の抑制を示すWDS（ 図3AおよびC）を解かマークします。従って、この培養系はdevelの間に関与する分子メカニズムを分析するために使用することができWDS（または他の器官）の発。
異なる種類の細胞を標識するために、我々は、WDS（ .......
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ディスカッション
器官培養系は、伝統的な細胞培養系に比べて多くの利点を有します。このシステムは、異なる細胞型の間の元の構造関係と相互作用を保持します。これは、 インビボ系で模倣し、ニッチな要因が存在しない細胞培養研究よりも正確な情報を提供します。器官培養系の使用は、さらに、動物全体を用いて上の利点を有します。これらは、全身がすることができない動物全体を使用してのコストが高く、お手入れが簡単な器官培養系の維持、 など 。また、様々な薬理学的薬剤または薬物は、単離された/培養器官でテストすることができ、臓器の直接の応答を含んでおり、研究しました。
胚WDSの成功の培養のために考慮する必要があるいくつかの重要なステップがあります。損傷を受けた組織が十分に成長し、嚢胞にならないような組織は、それらの完全性を損傷することなく、慎重に収集しなければなりません。の上にメディアの過剰フィルタは、WDSの嚢胞の成長をもたらします。私たちはどんな汚染なしの組織培養フードの外組織の分離と文化を行いました。培地を調製し、組織培養フード内部の24ウェルプレートに添加しまし.......
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開示事項
著者らは、開示することは何もありません。
謝辞
我々は、この原稿の重要な読書のための婦人科腫瘍学グループのメンバーに感謝したいと思います。この作品は、部分的には国立保健医療研究評議会、オーストラリア研究評議会、および癌研究所NSW（PST）からの資金提供によってサポートされています。 MKは、ニューカッスル大学院研究員の大学の受取人です。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 24ウェルプレート | コーニング、米国 | 3524 | は、他のベンダーHank'から購入できます |
| s Balanced Salt Solution (HBSS) | GE Healthcare Life Sciences, USA | SH30031.02 | 他のベンダーから購入できます |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F12) | Sigma, USA | D8437 | 37°Cで温まる;Cウォーターバス使用前の |
| ウシ胎児血清(FBS) | Interpath, オーストラリア | SH30034.02 | 10% FBS を培地に使用 |
| L-グルタミン | GE Healthcare Life Sciences, USA | SH30034.01 | 1% 濃度 |
| 使用 ペニシリン/ストレプトマイシン | Gibco, USA | 15070-063 | 1% 濃度 |
| 使用 Whatman Nuclepore ポリカーボネート Track-Etch | Whatman、USA | 110409 | メンブレン(0.8 µm) |
| IWR1 | Sigma, USA | 10161-5mg | 100 µ |
| パラホルムアルデヒド(PFA) | Electron Microscopy Sciences, USA | 15710 | 16%ストック、4%PBS使用。有毒 - 手袋を着用し、流しに廃棄することはできません |
| エタノール | Thermo Scientific Fisher, USA | 214-20L PL | Absolute, make 25, 50 and 75% with milliQ water. |
| Tween-20 | Thermo Scientific Fisher, USA | 2509-500ml | 非常に粘性があり、 |
| Triton X-100 | Sigma, USA | T8787-50ml | 非常に粘性があり、 |
| Di-Sodium Hydrogen Phosphate | Thermo Scientific Fisher, USA | 621-500mg | 他のベンダーから購入できます |
| Sodium Di-hydrogen Phosphate | Ajax Finechem, USA | 4745-500g | 他のベンダーから購入できます |
| 塩化ナトリウム | Thermo Scientific Fisher, USA | 465-500g | 他のベンダーから購入できます |
| Cytokeratin8/Troma I | Developmental Studies Hybridoma Bank, USA (DHSB) | TROMA-I | 1:250 ブロッキングバッファー |
| アクティブ&ベータ;カテニン | 細胞シグナル伝達技術, USA | D13A1 | 1:200 in blocking buffer |
| phospho-Histone 3 | Millipore, MA, USA | 06-570 | 1:200 in blocking buffer |
| Alexa488 Goat anti-rabbit IgG | Jackson ImmunoResearchLabs, 米国 | 111-545-047 | 1:250 ブロッキングバッファー |
| Alexa594 ヤギ抗ラットIgG | Jackson ImmunoResearchLabs, 米国 | 112-585-072 | 1:250 ブロッキングバッファー |
| グリセロール | サーモフィッシャーサイエンティフィック、米国 | 242-500ml | 他のベンダーから購入できます |
| n-プロピルガレート | シグマ、米国 | 2370-2 | |
| -(4-アミジノフェニル)-1H -インドール-6-カルボキサミジン (DAPI) | シグマ、米国 | D9564-10mg | 核酸 (DNA) |
| ジメチルスルホキシド (DMSO) | サーモフィッシャーを染色するために使用サイエンティフィック、アメリカ | 2225-500ml | 溶剤 |
| カバースリップ(24 x 50 mm) | Lomb Scientific | CS24501GP- |
参考文献
- Joseph, A., Yao, H., Hinton, B. T. Development and morphogenesis of the Wolffian/epididymal duct, more twists and turns. Dev Biol. 325, 6-14 (2009).
- Murashima, A., Xu, B., Hinton, B. T. Understanding normal and abnormal develop....
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再版と許可
