方法論記事

誘導性T7 RNAポリメラーゼ媒介マルチ遺伝子発現システム、pMGX

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DOI：

10.3791/55187

⸱

2017年6月27日

 ,  ,  , 
1Department of Chemistry and Biomolecular Sciences, University of Ottawa, 2School of Biosciences, The University of Nottingham Malaysia Campus

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

この研究は、pMGXプラスミド系を用いて、 大腸菌（Escherichia coli）における単一のプラスミドからの複数の遺伝子のT7媒介性同時発現のための方法を記載する。

要約

合成生物学、タンパク質 - タンパク質複合体の研究、および生合成経路の特徴付けおよび利用には、複数のタンパク質の共発現がますます必要不可欠である。この原稿では、誘導性T7RNAポリメラーゼの制御下にある多重遺伝子合成オペロンの構築のための非常に有効なシステムの使用が記載されている。このシステムは、多くの遺伝子が1つのプラスミドから同時に発現されることを可能にする。ここでは、アンピシリンまたはカナマイシン耐性選択マーカー（AおよびK）のいずれかとN末端ヘキサヒスチジンを有するかまたは欠いている4つの関連ベクターpMGX-A、pMGX-hisA、pMGX-KおよびpMGX-hisKのセットタグ（his）が開示される。 5つの遺伝子を含むpMGXベースのシステムが容易に構築され、 大腸菌で 5つのコードされたタンパク質すべてを産生することができることを示す、このベクターシステムを用いた合成オペロンの構築のための詳細なプロトコールを対応するデータと共に提供する。このシステムemとプロトコルは、研究者が大腸菌で複雑な多成分モジュールと経路を日常的に発現することを可能にする。

概要

特に、複数の機能モジュールを発現させなければならない合成生物学アプリケーションでは、複数のタンパク質の共発現がますます必要不可欠となっている。発現および機能がしばしば共発現2,3を必要とするタンパク質 - タンパク質複合体の研究において ;経路中の各遺伝子が4,5,6,7,8で発現されなければならない生合成経路を特徴づけ、利用することにある。特に宿主生物であるエシェリヒア・コリ （ Escherichia coli）において、共発現のための多くの系が開発されている。例えば、異なる選択可能なマーカーを有する複数のプラスミドを使用して、豊富な異なるexプレスベクトル10,11 。複数のタンパク質発現のための単一プラスミド系は、各遺伝子の発現を制御するために複数のプロモーターのいずれかを使用している10,12 ;複数の遺伝子が単一の転写産物にコードされている合成オペロン2,13;場合によっては、最終的にタンパク質分解処理されたポリペプチドをコードする単一の遺伝子を含み、目的の所望のタンパク質14を生じる。

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図1：ポリシストロニックベクターの構築を示すpMGXワークフロー。 pMGXシステムは、誘導性T7プロモーターの制御下で合成オペロンの構築のための柔軟で使い易い戦略を提供する。e.com/files/ftp_upload/55187/55187fig1large.jpg "target =" _ blank ">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

この原稿では、誘導性T7 RNAポリメラーゼ（ 図1 ）の制御下にある多重遺伝子合成オペロンの構築のための非常に有効なシステムの使用が記載されている。このシステムは、多くの遺伝子が1つのプラスミドから同時に発現されることを可能にする。これは元々pKH22と呼ばれていたプラスミドシステムに基づいており、これは数多くのさまざまなアプリケーションでよく使用されています6,7,8。ここでは、このプラスミドセットは、4つの関連ベクター：pMGX-A、C末端タグまたはN末端タグを欠く発現ベクターおよびアンピシリン耐性マーカーを含むように拡大される。 pMGX-hisA、N末端ヘキサヒスチジンタグおよびアンピシリン耐性マーカーをコードする発現ベクター; pMGX-K、発現ベクターl任意のC末端タグまたはN末端タグとカナマイシン耐性マーカーとを接触させる工程;およびN末端ヘキサヒスチジンタグおよびカナマイシン耐性マーカーをコードする発現ベクターであるpMGX-hisK。この研究では、pMGXシステム、特にpMGX-Aを使用して5つの遺伝子を含むポリシストロニックベクターを作製する方法が、 大腸菌における個々のタンパク質の成功した産生と共に実証される。

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プロトコル

1.興味のある遺伝子を得る

  1. 合成遺伝子を設計する。
    1. 大腸菌発現のための遺伝子配列を最適化する。
    2. 配列（AvrII、NdeI、EcoRIおよびXbaI）から問題のある制限部位を除去する。
    3. クローニングのための制限部位を組み込む。 5'-NdeI部位および3'-EcoRI部位が推奨される。必要に応じて、他のサイトも使用できます。選択したプラスミドのマルチクローニング領域を参照してください（ 図S1〜S4 ）。必要に応じて、ウェスタンブロット検出用の5 'または3'エンコードタグを含めます。
    4. 設計された遺伝子を商業的に注文する。
    5. 製造者の指示に従って、平滑化クローニングキットを用いて平滑化ベクターに遺伝子を平滑化する;遺伝子を増幅するためのプライマーを設計する（ステップ1.2.2に進む）。またはさらに5 'および3'末端を加えてpMGXプラスミドに直接クローニングし、ステップ2に進む。ここで、th代表的な結果は、関心のある遺伝子を無作為にクローニングすることによる。
  2. 所望の遺伝子を増幅する（設計および最適化された合成遺伝子または所望の遺伝子を含む鋳型DNAから） 15 。
    1. クローニングのための制限部位を有するプライマーを設計する; 5'-NdeI部位および3'-EcoRI部位が推奨される。必要に応じて、他のサイトも使用できます。選択したプラスミドのマルチクローニング領域を参照してください（ 図S1〜S4 ）。必要に応じて、ウェスタンブロット検出用の5 'または3'エンコードタグを含める。
    2. 所望の遺伝子をPCR増幅する15 。
    3. アガロースゲル電気泳動によるPCRの解析16 。
    4. 非特異的な増幅がある場合、ゲル抽出によって増幅された遺伝子を浄化する。そうでない場合は、酵素クリーンアップキットを使用してください。
    5. 分光光度計を使用してDNAを定量する。260nmにおけるe。溶出緩衝液を含むブランク17 。

2.マルチ遺伝子発現系ベクターpMGX 18への関心対象遺伝子のクローニング

  1. 制限は、得られた目的の遺伝子および所望のベクターpMGXをNdeIおよびEcoRIで消化する。
    注：大量の再環状化プラスミドが得られた場合、EcoRIを添加する前にNdeI反応を1時間進行させます。
    1. 0.5-1.5μgのDNAと1μLの各酵素と4μLの適切な10倍緩衝液を含む40μLの消化反応物を使用する。
    2. NdeIおよびEcoRI消化物については、EcoRI緩衝液を使用し、最初にNdeIエンドヌクレアーゼを添加する。 37℃で1時間消化する。次に、EcoRIエンドヌクレアーゼを添加し、ダイジェストをさらに1時間進行させる。 NdeIはDNAの末端近くの切断に敏感であるため、EcoRIによる初期消化はNdeIによる効果的な消化を妨げる可能性があります。
  2. 電気アガロースゲル上で制限消化物を発色させる（1kb遺伝子については、110Vで0.7％アガロースゲルを55分間使用する;異なる遺伝子サイズに対するアガロースゲルのパーセントを選択するには、参考文献16を参照のこと）。
  3. きれいなメスまたはカミソリの刃を使用して挿入バンドとベクターバンドを切り出し、切除したゲルセグメントを1.5mLチューブに入れる。
  4. ゲル抽出キットを使用してアガロースゲルからDNAを製造元のプロトコールに従って抽出する。
  5. 3：1インサート - ベクター比を用いて目的の遺伝子をpMGXベクターにライゲートする。インサートなしで消化したpMGXのネガティブライゲーションを設定する。
    1. T4 DNAリガーゼ1μL、ベクターDNA（〜5μL）0.15〜0.5μg、および3：1インサート対ベクター比に基づいて適切な量のインサートを含む20μL連結反応をセットアップし、挿入されている遺伝子; pMGXバックボーンは、5,312〜5,504bpのサイズである。すべてのbuを含むネガティブコントロール反応を含める挿入されている遺伝子。ベクターDNAの量が、陰性対照ライゲーションおよびベクタープラス挿入ライゲーション反応において同等であることを確認する。
  6. 連結反応をXL1-Blue化学的にコンピテントな大腸菌細胞に連結し、連結したプラスミドpMGX- yfg1 （目的遺伝子1を含む）、pMGX -yfg2 （目的遺伝子2を含む）、pMGX -yfgn （目的遺伝子nを含む）。無菌技術を使用する（バイオセーフティキャビネット内または炎の下）。
    1. 化学的にコンピテントなXL1-Blue E. coliの 100μLアリコートを氷上で5分間解凍し、ライゲーション反応液 5μLを加えます。氷上で30分間インキュベートする。
    2. 42℃に保たれた水浴中で細胞を45秒間熱ショックし、次いで200μLの冷LBを加える。氷上で2分間インキュベートする。
    3. 細胞を37℃、220rpmで1時間振盪し、次いでプレートを100μLをLBを含有する寒天プレート上に広げる。（アンピシリンまたはカナマイシンのいずれか）を含む。
  7. 陽性形質転換体のクローンをスクリーニングする。
    1. ネガティブコントロールおよびライゲーションプレート上のコロニー数を比較する。 1：2より大きいコロニーカウント比が望ましい。ネガティブコントロールプレート上に多数のコロニーがある場合は、ステップ2.1に戻り、メモを確認します。
    2. スクリーニング（1 n）のために挿入された異なる遺伝子の各ライゲーション反応から4-8個のコロニー（ネガティブコントロール：ライゲーション比に依存する）を選択し、4 mLのLBおよび適切な抗生物質一晩培養/個々のコロニーに接種する。 37℃および220 rpmで振とうしながら一晩培養します。
    3. 製造業者のプロトコールに従ってプラスミドDNA単離キットを用いてプラスミドDNAを単離する。
    4. 150〜500ngのDNAと1μLの各酵素を含む20μLのNdeI + EcoRI消化反応を2μLの適切な10×緩衝液で設定する。第一に関心のある遺伝子が制限部位の間にあるのと同時にNdeIおよびEcoRIを添加する。空のpMGXベクターによる陰性対照が推奨される。水浴中で37℃で2時間消化する。

3.遺伝子1、pMGX -yfg1を含むpMGXベクターへの遺伝子2の挿入

  1. 制限は、AvrIIでpMGX- yfg1を消化し、仔ウシ腸ホスファターゼ（CIP）で治療する。
    1. 0.5-1.5μgのベクターDNA（約5-10μLの単離されたDNA）および1μLのAvrIIを含む40μLの消化反応物を、適切な10×緩衝液4μLとともに使用する。 37℃で1.5時間消化し、次いで1.5μLのCIPを添加する。 37℃でさらに30分間放置する。
  2. 制限酵素消化物pMGX- yfg2をAvrIIおよびXbaIで消化して目的の遺伝子を遊離させる。
    1. 0.5〜1.5μgのDNAと1μMのDNAを含む40μLの消化反応;各酵素のLを4μLの適切な10×緩衝液で希釈する。 37℃で2時間消化する。
  3. 電気泳動制限は、適切なパーセント（0.7％）のアガロースゲルで消化し、きれいなメス/カミソリの刃を用いてインサートおよびベクターバンドを切除する（ステップ2.2〜2.3参照）。
  4. ゲル抽出キットを使用してDNAを抽出し、DNA 17を定量する。
  5. 3：1インサート - ベクター比を用いて、L遺伝子2をpMGX- yfg1に挿入する。追加の挿入物なしで消化したpMGX -yfg1のネガティブライゲーションを設定する。上記の手順2.5で設定します。
  6. ステップ2.6で見られるように、ライゲーション反応物5μLをXL1-Blue化学的コンピテント大腸菌細胞に連結し、プラスミドpMGX -yfg1,2 （目的遺伝子1および2を含む）および陰性pMGX -yfg1コントロールに連結する。
  7. ネガティブコントロールおよびライゲーションプレート上のコロニー数を比較する。コロニー数の比g1：2以上が望ましい。ネガティブコントロールプレート上に多数のコロニーがある場合は、ステップ3.1に戻り、CIP処理を確認します。
  8. ライゲーション反応から4-8個のコロニー（ネガティブコントロール：ライゲーション比に応じて）を選択し、個々のコロニーあたり4 mLのLBと適切な抗生物質を接種し、37℃および220 rpmで一晩増殖させます。
  9. 製造業者のプロトコールに従ってプラスミドDNA単離キットを用いてプラスミドDNAを単離し、DNA17を定量する。
  10. EcoRIでpMGX -yfg1,2の制限消化を行うことにより、第2の遺伝子の有効な挿入をスクリーニングする。
    1. 150-500 ngのDNAと1μLのEcoRI酵素と2μLのEcoRI 10xバッファーを含む20μLの消化反応を使用します。 37℃で2時間消化する。
  11. 適切な％アガロースゲル上で制限消化物を電気泳動する;対応するバンドを探すsを遺伝子2のサイズに合わせる（ステップ2.2参照）。遺伝子は、望ましくない逆向きのベクターに挿入することができる。

第1および第2遺伝子pMGX-yfg1,2を含むpMGXベクターへの第3遺伝子の付加

  1. 制限はAvrIIでpMGX- yfg1,2を消化し、ステップ3.1に示すようにCIPで治療する。
  2. ステップ3.2に見られるように、制限消化物pMGX- yfg3をAvrIIおよびXbaIで消化する。
  3. 適切な％アガロースゲル上で制限消化物を電気泳動し、きれいなメス/カミソリの刃を用いてインサートおよびベクターバンドを切除する;手順2.2-2.3を参照してください。
  4. ゲル抽出キットを使用してアガロースゲルからDNAを抽出し、DNA 17を定量する。
  5. 3：1インサート対ベクター比を用いてL遺伝子3をpMGX- yfg1,2に挿入し、ステップ3.5に示すように、追加の挿入物なしで消化したpMGX -yfg1,2のネガティブライゲーションを設定した。
  6. 5μLの連結反応をXLに変換する1-Blue化学的にコンピテントな大腸菌細胞、ライゲートしたプラスミドpMGX- yfg1,2,3 （目的の遺伝子1,2および3を含む）、および陰性pMGX -yfg1,2対照（ステップ2.6参照）。
  7. ネガティブコントロールおよびライゲーションプレート上のコロニー数を比較する。ネガティブコントロールプレート上に多数のコロニーがある場合は、ステップ4.1に戻り、CIP処理を確認します。
  8. ライゲーション反応から4〜8個のコロニー（ネガティブコントロール：ライゲーション比に応じて）を選択し、個々のコロニーあたり4 mLのLBと適切な抗生物質を接種する。 37℃および220rpmで一晩増殖させる。
  9. プラスミドDNA単離キットを製造元のプロトコールに従って用いてプラスミドDNAを単離する。
  10. ステップ3.10に示すように、EcoRIでpMGX -yfg1,2,3の制限消化を行うことにより、第3の遺伝子の有効な挿入をスクリーニングする。
  11. 適切な％アガロースゲル上で制限消化物を電気泳動する;見える遺伝子2および遺伝子3のサイズに対応するバンドについては（ステップ2.2参照）。注：遺伝子3は、望ましくない逆向きのベクターに挿入することができます。遺伝子2および3が同じサイズである場合、スクリーニングのために別の適切な制限消化部位を選択しなければならない。
    注：新しい遺伝子ごとに必要に応じて繰り返します。

5.マルチ遺伝子発現系を用いた目的タンパク質の産生およびウエスタンブロッティングによる産生の評価

  1. 関心のある全ての遺伝子を含む陽性クローンを、BL21-（λDE3）のような化学的コンピテントなタンパク質生産大腸菌に形質転換する。
    1. 化学的にコンピテントなBL21-（λDE3） 大腸菌の 100μLアリコートを氷上で5分間解凍し、次いで陽性クローン化プラスミドDNA1μLを加える;氷上で30分間インキュベートする。
    2. 42℃に保たれた水浴中で細胞を45秒間熱ショックし、次いで200μLの冷LBを加える。氷上で2分間インキュベートする。
    3. 細胞を37°Cおよび220 rpmで1時間振とうし、プレート100μLを適切な選択マーカー（アンピシリンまたはカナマイシンのいずれか）を含むLB-寒天プレートに塗布する。
  2. イソプロピル-β-D-1-チオガラクトピラノシド（IPTG）誘導によりタンパク質を発現させる。
    1. B21-（λDE3）形質転換プレートから単離されたコロニーを選択し、適切な抗生物質を加えた4mLのLBに接種する。一晩増殖し、37℃および220rpmで振とうする。
    2. 1mLの一晩培養液を使用して、100mLのLBに適切な抗生物質培養物を加えて接種する。
    3. OD 600が0.6になるまで220 rpmで振盪しながら37℃で増殖させる。
    4. 100μMIPTGで培養物を誘導し、25℃および220rpmで15時間増殖させる。
    5. 1 mLの培養液を取り除き、13,000 xgで1分間遠心してください。上清を捨てる。
  3. 製造元の指示に従って溶解液を用いて細胞を溶解する可溶性細胞ライセートのウエスタンブロットを行い、すべてのタンパク質がうまく産生されたかどうかを調べる19 。

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結果

この研究では、目的は単一のプラスミドから5つのタンパク質を同時発現させることであった。 N-またはC-末端ヘキサヒスチジンタグのいずれかをコードする5コドン最適化合成遺伝子断片を商業的に購入した。合成遺伝子をPCRによって増幅し、個々にPCR-平滑ベクターにクローニングし、配列決定した。ポリシストロニックプラスミドを作製するために、目的の5つの遺伝子を最初に適当なpMGXプラスミドpMGX-Aにクローニングした。 図2は、NdeI + EcoRIで消化したpMGX-Aに加えてPCRBlunt- yfg1およびPCRBlunt- yfg2を示す（ステップ2参照）。最初の2つの遺伝子をpMGX-Aにクローニングするために、プラスミドをNdeI + EcoRIで消化した（ 図2 ）。目的の遺伝子をpMGX-Aにクローニングすると、pMGX- yfg1およびpMGX - yfg2

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ディスカッション

特に複雑な多遺伝子代謝経路の特徴付けおよび再構築には、複数の遺伝子の同時発現がますます必要不可欠となっている3,4,5 。 pMGXシステムは、 大腸菌ルーチン6,7,8で多遺伝子同時発現を行い、多様な研究者にアクセス可能である。この研究では、目的の5つのタンパク質が、pMGX-Aを用いて単一のプラスミドシステムから同時に生成されることが示された。現在利用可能な多くの同時発現系は、pET Duetベクター12のようなバイシストロン性プラスミドを生成する2つの遺伝子の挿入のみを可能にする。より多くの遺伝子の添加を必要とする場合、異なる選択マーカーを有する複数のバイシストトロニックベクターが必要とされる。他のマルチ遺伝子発現系とは対照的に、pMGX系は容易なクローニングを可能にする異なるドナープラスミドを必要とせずに制限部位を再利用する能力を有するか、遺伝子から複数の制限酵素部位を除去する能力を有する13,14 。このプロトコールの重要なステップには、遺伝子設...

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開示事項

著者は何も開示することはない。

謝辞

この研究は、カナダの自然科学および工学研究評議会によって支持された。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
Enzymes
アルカリホスファターゼ、子牛腸(CIP)ニューイングランドバイオラボM0290S
AvrIIニューイングランドバイオラボR0174S
EcoRIニューイングランドバイオラボR0101S
NdeIニューイングランドバイオラボR0111S
XbaINewEngland BiolabsR0145S
Herculase II Fusion DNA PolymeraseAgilent Technologies600677
T4 DNA LigaseNew England BiolabsM0202S
NameCompanyカタログ番号コメント
試薬
1 kb DNA ladderNew England BiolabsN3232L
4-20% Mini-PROTEAN TGX Stain-Free Protein GelsBio-Rad456-8095
50x TAEFisher Thermo ScientificBP1332-4
寒天Fisher Thermo ScientificBP1423-500
アガローFisher Thermo ScientificBP160-500
AmpicilinSigma-AlrichA9518-5G
BL21 (DE3) 化学コミデント細胞自社調製したコプテントセル
B-PER 細菌タンパク質抽出試薬フィッシャー サーモサイエンティフィックPI78243
dNTP mixアジレントテクノロジーズ ポリメラーゼ
ゲル抽出キット付属OmegaD2500-02E.Z.N.A Gel Extraction, supplied by VWR Cat 3: CA101318-972
GlycineFisher Thermo ScientificBP381-1
His Tag 抗体 [HRP], mAb, MouseGenScriptA00612
Immobilon Western Chemiluminescent HRP SubstrateEMD MilliporeWBKLS0100
IPTGSigma-Alrich15502-10G
LBFisher Thermo ScientificBP1426-500
メタノールFisher Thermo ScientificA411-20
低温殺菌インスタントスキム粉乳地元の食料品店無名食料品店の牛乳は適切
です ニトロセルロース膜アマシャムプロトラン(GEヘルスケアライフサイエンス)10600007膜PT 0.45 & マイクロ;m 200 mm x 4 m、VWRから供給 Cat #: CA10061-086
プラスミドDNA分離キットOmegaD6943-02E.Z.N.A Plasmid DNA MiniKit I、VWRから供給 Cat #: CA101318-898
pMGXBoddy LabBoddy Lab
cboddy@uottawa.ca プライマー統合DNA技術目的の遺伝子に必要なプライマーを設計する
合成遺伝子Life Technologies必要に応じて設計および最適化
厚くブロットフィルターペーパーBio-Rad1703932
Tris baseBioShopTRS001.1
Tween-20Sigma-AlrichP9416-50ML
XL1-Blue ケミカルコンピテントセル自社で調製した
Name会社カタログ番号コメント
Equipment
BioSpectrometerEppendorfRK-83600-07
ゲルボックス - PAGEバイオ・ラッド1658005Mini-PROTEIN Tetra Vertical Electrophoresis Cell
Gel ImagerAlpha InnotechAlphaImager EC
インキュベーターオーブンFisher Thermo Scientific11-690-650DIsotemp
インキュベーターシェーカーFisher Thermo ScientificSHKE6000-7MaxQ 6000
Personna RazorsFisher Thermo ScientificS04615
Power PackBio-RadS65533QFB300
TransilluminatorVWR InternationalM-10E,6W
サーモサイクサーエッペンドルフZ316091マスターサイクラー パーソナル、シグマ
UV フェイスシールド18-999-4542
ウォーターバスフィッシャー サーモサイエンティフィック15-460-2SQ
ウェスタントランスファー バイオ・ラッド1703935ミニトランスブロットセル
ス からのリクエスト

参考文献

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