ブルーネイティブPAGEおよびタンパク質相関プロファイリングによってアフィニティー精製タンパク質複合体の解決

サマリー

ここでは、ラベルフリーの定量的質量分析法を用いたタンパク質相関プロファイリングに続く親和性タンパク質複合体の精製と青ネイティブPAGEによるそれらの分離のためのプロトコルを提示します。この方法は、異なるタンパク質複合体へのインタラクトームを解決するのに便利です。

要約

ほとんどのタンパク質は他のタンパク質と関連して行動します。したがって、生物学的プロセスを完全に理解するためには、これらの機能単位を特徴付けることが重要です。質量分析と組み合わせたアフィニティー精製(AP-MS)は、タンパク質間相互作用を同定するための最適な方法となっています。しかし、従来のAP-MS研究では、タンパク質の相互作用に関する情報は得られますが、組織的な情報は失われていました。この問題に対処するために、私たちは、アフィニティー精製されたタンパク質複合体を質量分析による特性評価の前に分離することにより、タンパク質が関与する可能性のある異なる機能集合体を解明する戦略を開発しました。エピトープタグを用いたベイトタンパク質のアフィニティー精製と競合的溶出によって単離されたタンパク質複合体は、青色のネイティブ電気泳動によって分離されます。定量的質量分析を用いた相関プロファイリングによるタンパク質移動プロファイルの比較により、相互作用するタンパク質を異なる分子エンティティに割り当てることができます。この分析法は、ゲルろ過などの従来のクロマトグラフィー技術では解決できなかった分子量の近いタンパク質複合体を分離することができます。従来の AP-GELC-MS/MS よりも少ない作業で、この戦略は、多くの場合、タンパク質相互作用の同定と同時にタンパク質複合体のトポロジカル情報を取得するのに適切であることを示しています。

概要

細胞では、ほとんどのタンパク質は、一過性のタンパク質 - タンパク質相互作用を介して、または安定なタンパク質の集合体を形成することにより、その機能を実行します。タンパク質相互作用を特徴づけることは十分に理解細胞プロセスのために重要です。質量分析法（AP-MS）と組み合わせたアフィニティー精製は、ネイティブのタンパク質相互作用を同定するための最も一般的に適用される戦略の一つです。過去十年間で達成機器の機能の大幅な改善は、このアプローチは非常に強力作られてきました。 AP-MS実験によって識別される相互作用が餌と獲物の間の直接および間接的な団体の混合物が含まれることに注意することが重要です。加えて、多くの場合、タンパク質は異なる生物学的役割を有するかもしれない同じ細胞コンテキスト内でいくつかの異なる複合体に関与し、したがってAP-MSによって同定された相互作用は、異なるタンパク質集合体または機能エンティティの組み合わせを表すかもしれません。導出することはできませんそのような位相情報単純なAP-MS実験によって生成されたタンパク質の一次元リストから演繹 。しかし、この技術は、これらのアセンブリを解決するために、1つまたは複数の方法と組み合わせることにより、タンパク質複合体の構造を定義するためにさらに利用することができます。

AP-MSによって同定されたタンパク質間相互作用のトポロジーを解決するために、いくつかの戦略が適用されています。一つのアプローチは、餌¹と実験の前のラウンドで同定された獲物を用いて反復AP-MS実験を実行することです。非常に有益が、これは両方の実験的および解析的に非常に労働集約的な作業です。質量分析と組み合わせたタンパク質架橋は、ますますタンパク質複合体^{2、3、4、5}で位相情報を導出するために使用されています。しかし、computatio架橋されたペプチドの最終分析は、依然として困難な作業のままであり、したがって、ワークフローのボトルネックです。 MS-開裂可能な架橋試薬の出現は、タンパク質^6、7相互作用に近接しているアミノ酸残基のマッピングを容易にするはずです。別の代替は、従来の直交分離技術^8,9との親和性精製を組み合わせることです。ゲル濾過またはイオン交換によるクロマトグラフィー分画、またはスクロース勾配分画はまた、最近、通過複合分離工程^{10、11、12、13、}システム全体のレベルでの多タンパク質複合体を記述するために、定量的質量分析と組み合わせて使用されてきました。ブルーネイティブポリアクリルアミドゲル電気泳動（BN-PAGE）が広くに適用されています天然のタンパク質の相互作用、ミトコンドリア膜タンパク質複合体^14を含む一般的に、これらを調査します。この分離技術はまた、最近、ミトコンドリア複合体^15、16、17上だけでなく、全体のセル^18、19からの他のタンパク質複合体を解明するためだけでなく、ラベルフリータンパク質定量と相関プロファイリングと組み合わせて使用しました。我々は、その後のネイティブ分画手法および定量的MSとの親和性精製の組み合わせは、特定の蛋白質を含む複数タンパク質アセンブリを解決するための有用な戦略を提供するはずであるという仮説を立てました。

ここでは、定量的質量、SP、続いて単離された複合体のブルーネイティブポリアクリルアミドゲル電気泳動を用いて、一般的なエピトープベースのアフィニティー精製を組み合わせた方法を記載しectrometryとタンパク質相関プロファイリングは、タンパク質が関与する可能性がある複数のアセンブリを解決することができます。私たちは、エピトープタグに融合した目的のタンパク質が生理的豊かさに近い達成し、効率的なネイティブを確保するために、内因性遺伝子座から発現されたマウス胚性幹細胞を使用します複雑な分離。このアプローチは、複数の相互作用タンパク質は、従来GELC-MS ²⁰よりも多くの作業を必要としない一方で、それらの相関プロファイルに基づいて異なるアセンブリにそれらを解決する、に係合を解きます。

プロトコル

FLAGアフィニティー精製によりネイティブのタンパク質複合体の単離

1. 準備
   1. 細胞ペレットを解凍するために37°Cの水浴を設定します。
   2. 4°Cに微量をクールダウン。
   3. 異なるサイズのいくつかのマイクロ遠心チューブ（1.5 mLを、15 mL）に溶解し、氷中でホモジナイザーを置きます。
   4. 溶解緩衝液（50mMのトリス-HCl pHが8、150mMのNaCl、0.1％ノニデットP-40、1mMのEDTA）を10mLを調製し、氷上で保管。直前のバッファを使用して、10 1 M DTTのμLとEDTAフリープロテアーゼ阻害剤の破砕タブレットを追加します。
2. 抗体結合ビーズの調製
   注：抗体でコーティングされたビーズは、事前に週まで用意し、必要になるまで冷蔵庫に保管することができます。プロテインGは、プロテインAは、より高い親和性を持っているウサギIgGを除き、サブタイプ免疫グロブリンほとんどの種のためのプロテインAよりも高い親和性を有します。
   1. 転送50：プロテインGでコーティングされた磁気ビーズの50μLを洗います＃956;微量遠心管にビーズスラリーのLは、チューブの側面にビーズを収集し、液体を除去するために、磁石チューブを置きます。 PBS-0.01％Tween-20を0.5mLの中でビーズを再懸濁します。
   2. チューブの側面にビーズを収集し、液体を除去するために、磁石チューブを置き。 PBS-0.01％Tween-20を40μL中でビーズを再懸濁します。 M2抗FLAG抗体を10μg（1mg / mlのストック溶液の10μL）を加えます。室温で20分間回転させながらインキュベートします。
   3. チューブの側面にビーズを収集し、液体を除去するために、磁石チューブを置き。 PBS-0.01％Tween-20を0.5mLでビーズを洗浄します。
   4. ビーズに抗体を架橋するために、0.2 MトリエタノールアミンpHを8.2 1mLで二回ビーズを洗浄します。次いで、0.2 MトリエタノールアミンpHは8.2で20mMのDMP（ジメチルピメリミデート）（DMP溶液は使用直前に新たに調製すべきである）1mLにビーズを再懸濁します。室温で30分間回転させながらインキュベートします。
   磁石にチューブを置きます。上清を除去し、50mMトリス-HCl pH7.5の0.5mLの中でビーズを再懸濁します。室温で15分間回転させながらインキュベートします。
3. PBS-0.1％Tween-20を0.5mLでビーズを3回洗浄します。必要になるまで最後の洗浄中にビーズを残します。

FLAGベースのアフィニティ精製
注：長時間のバッファなしでビーズを残さないで注意してください。すべてのバッファチューブは常に氷上に保管してください。以下のプロトコルは、FLAGタグタンパク質²⁰の内因性レベルを発現2-5×10 ⁸個の細胞からのタンパク質複合体の精製（10-20 mgのタンパク質溶解物）のために最適化されています。

1. それが溶け始めるまで37℃の水浴中で細胞ペレットを解凍します。 、浴からチューブを取り、ペレットが完全に解凍されるまで、ゆっくりと旋回し、すぐに氷の上で細胞懸濁液の入ったチューブを配置します。
2. 氷冷溶解緩衝液5 mLを加え混合する細胞懸濁液と渦に（DTTおよびプロテアーゼ阻害剤を含有します）。 10分間氷上でインキュベートします。
3. 冷たいダウンスホモジナイザーにライセートを移します。 （目立った粘度がなくなるまで）タイト乳棒を用いて20〜30ストロークで溶解します。冷たいマイクロ遠心チューブにホモジネートを転送します。
4. 4°Cで15分間18,000×gで遠心分離。
5. きれいな冷たいチューブに清澄化ライセートを転送します。背後の溶解物50μLを残します。タンパク質濃度を測定し、精製を監視するために、溶解物の35μLアリコートを取ります。
6. ビーズからPBS-0.1％のTween-20を取り除きます。溶解液1mLでビーズを再懸濁し、溶解物の残りと混合します。 1〜2時間4℃で回転ホイールで混合物をインキュベートします。
7. マグネット付チューブの側面にビーズを収集します。上清の30μLアリコートを収集し、上清の残りを捨てます。 IPP150緩衝液（10mMトリス-HCl pHが8、15の0.5 mL中にビーズを再懸濁0のNaCl、1mMのEDTA、0.1％NP-40）4-6回ピペッティングすることによって。 1.5 mLの冷チューブに移します。
8. IPP150バッファー0.5mLのさらに2回洗浄を繰り返します。
9. 洗浄は、FLAGネイティブ溶出緩衝液（20mMのビス - トリスpHは7、20のNaCl、0.02％ノニデットP-40、1mMのEDTA、200mMのεアミノカプロン酸）0.5mLで3回ビーズ。最後の洗浄では、新しい冷たいチューブにビーズを移します。徹底的にバッファを削除します。
10. ネイティブ溶出緩衝液中の200μg/ mLの3×FLAGペプチドの100μL中にビーズを再懸濁します。穏やかに回転させながら10分間4℃でインキュベートします。
11. 磁石でビーズを収集し、冷たい上清を新しいチューブに移します。
12. 繰り返して、二回1.3.10-1.3.11を繰り返します。すべての溶出液をプール。
13. 4℃、10,000×gでの遠心分離によって遠心フィルターユニット25μL（10 kDaの公称分子量限界カットオフ、PES）まで溶出液を濃縮します。新しい冷たいチューブに濃縮し、溶出液を移し、50％のglyceを追加5％の最終濃度のためのROL。必要に応じて、濃縮溶出物を4℃で一晩保持することができます。

2.ブルーネイティブPAGE

1. 準備
   1. 1xのネイティブPAGE陽極バッファーの1 L、1×ネイティブPAGEダークブルー陰極バッファおよび1xのネイティブPAGEライトブルー陰極バッファを準備します。
   2. プレキャスト3から12パーセントのネイティブPAGEゲルの櫛を削除し、1×ネイティブPAGEダークブルー陰極バッファーでウェルを2回洗います。 1xのネイティブPAGEダークブルー陰極バッファーで井戸を埋めます。ランニングタンク内のゲルを設定しますが、陰極（内側）室にダークブルー陰極バッファを追加しないでください。
2. 電気泳動の実行
   1. サンプルを調製する：〜25μLの溶出液は、それぞれ4×ネイティブサンプルローディング緩衝液及び1X及び0.005％の最終濃度0.5％G-250サンプルの添加剤の適切な量を追加し、濃縮しました。
   2. betwee空のウェルを残しサンプルネイティブ分子量マーカーをロードそれらをn個。すべての空のウェル中、1×ネイティブサンプルローディングバッファーの負荷10〜20μL。
   3. サンプルを邪魔しないように慎重に1xのネイティブPAGEダークブルー陰極バッファー200mlで陰極（内側）チャンバーを埋めます。 1XネイティブPAGE陽極緩衝液550 mlを陽極（外側）チャンバを満たします。
   4. 30分間、150Vでゲルを実行します。実行を停止し、血清ピペットとダークブルー陰極バッファを削除し、1×ライトブルー陰極バッファーと交換してください。 60分間の実行を続行します。ゲルは、室温または4℃で実行することができます。温度は、タンパク質複合体の構造に影響を与える可能性があります。
3. ゲル染色
   1. ゲルカセットを開き、カセットプレートのいずれかを破棄する。ゲルは、他のカセットプレートに取り付けられたままです。ゲルをカバーし、穏やかに振盪しながら30分間インキュベートするのに十分な固定液（40％メタノール、2％酢酸）を含有するトレイまたは容器にゲルを移します。
   2. 固定solutを削除イオンとゲルをカバーするために十分な水を追加します。ゲルは、将来の参考のためにスキャンすることができます。

3.質量分析

注：サンプルの清浄度を確保することができる場合は、すべてのその後の工程は、層流フード内で行われるべきです。すべてのソリューションは、HPLCグレードの水を用いて調製されなければなりません。分析を実施します質量分析研究室でこのプロトコルを話し合います。

1. 準備
   1. 廃棄物を収集するために別の96ウェルプレートの頂部に円錐状の底96ウェルプレートを置き。ピアス21 G針を有する円錐底96ウェルプレートのウェルの底。
   2. ピアス96ウェルプレートのウェルを洗浄します。
      1. 穿孔プレートのウェルに、50％アセトニトリル、0.25％ギ酸の200μLを加えます。 10分間シェーカーでプレートスタックをインキュベートします。
      2. 1分間500×gで遠心分離液は廃棄物収集プレート内の穴を通って流れるようになっています。ワットを破棄ASTEの液体。
      3. 手順を繰り返します3.1.2.1-3.1.2.2さらに2回。
      4. 50mMの炭酸水素アンモニウム150μlでピアス96ウェルプレートのウェルを充填する（たて）。
   3. 遠心ろ過、96ウェルプレートのウェルを洗浄します。
      1. 廃棄物を収集するために遠心濾過板の下、通常の96ウェルプレートを置きます。遠心濾過プレートの各ウェルに50％アセトニトリル、0.25％ギ酸の200μLを加えます。
      2. 1分間200×gでプレートスタックを遠心。廃棄物を捨てます。
      3. 手順を繰り返します3.1.3.1-3.1.3.2さらに2回。
2. ジェル切除およびゲル内消化
   注：ゲルを切り出し一方で、特定し、タンパク質標準のそれぞれに合わせゲルスライスをメモします。タンパク質標準は、すべてのゲルスライスのおおよその分子量を推定するために使用することができます。
   1. 清浄な表面上のガラス板を有するゲルを置き。含まれているレーンをスライス48枚の同じスライス（1.5ミリメートル×5ミリメートル）に試料をする。 （ゲルの上部の最後の5つのスライスを除く）2-3小片に各スライスをカットし、ピアスの1つのウェル中の各スライスを順次配置し、96ウェルプレートを洗浄しました。
   2. 各ウェルにアセトニトリル50μLを追加します。 30〜60分間振盪しながらプレートをインキュベートします。ステップ3.1.2.2のように遠心分離によって液体を除去します。
   3. 各ウェルに50mMの重炭酸アンモニウムで2 mMのTCEPの200μLを加えます。室温で30分間振盪しながらプレートをインキュベートします。ステップ3.1.2.2のように遠心分離によって液体を除去します。
   4. 各ウェルに50mMの炭酸水素アンモニウムでヨードアセトアミド4ミリの200μLを加えます。暗所で37℃で30分間振盪しながらプレートをインキュベートします。ステップ3.1.2.2のように遠心分離によって液体を除去します。
   5. 50mMの重炭酸アンモニウムを加え、アセトニトリルの50μLの150μLを加え、室温で30分間振盪しながらプレートをインキュベートします。この洗浄工程aを繰り返します全て青色がゲル片から除去されるまで、必要に応じて何回です。
   6. 純粋アセトニトリル200μLを添加することにより、ゲル片を脱水し、ゲル片は、白色不透明になるまで20分間室温で振盪しながらインキュベートします。アセトニトリルを除去します。
   7. 各ウェルに冷50mM重炭酸アンモニウム中のトリプシンの0.001 mg / mlと（シーケンシンググレード）の150μLを加えます。 2時間37℃で振盪しながらプレートをインキュベートします。 1時間後、ゲル片が液体で覆われていることを確認。そうでない場合、50mMの炭酸水素アンモニウムの別の50-100μLを加えます。 37℃で2時間後、25℃で一晩消化し続けます。
   8. プレートの正しい向きを確保する、ゲル含有プレートの下に清浄なコニカル底板を置き。 1分間200×gで遠心分離することによりペプチドを含有する液体を集めます。
   9. 遠心蒸発器でペプチド含有プレートを配置し、Tを実行しながら、液体を蒸発させます彼の次のステップ。
   10. ゲル片を50％アセトニトリル、0.25％ギ酸の150μLを加えます。 37℃で30分間振盪しながらインキュベートします。
   11. 1分間200×gで遠心分離することによって、ステップ3.2.9から部分的に乾燥したプレートに液体を集めます。次のステップを実行しながら、ペプチド含有プレートを蒸発させ続けます。
   12. 繰り返して3.2.10-3.2.11を繰り返します。
   13. ゲル片を含むプレートの各ウェルに純粋アセトニトリル200μLを加えます。 15分間室温で振盪しながらインキュベートします。
   14. 1分間200×gで遠心分離によってペプチド含有プレートに液体を集めます。
   15. すべてのウェル中のアセトニトリルの最終濃度が55％を超えていることを確認してください。必要に応じて、余分な純粋なアセトニトリルを追加します。
   16. 洗浄後、遠心濾過プレートにペプチド溶液を移します。ペプチドを収集するためにその下に清浄な円錐底板を置き。 1分間200×gでプレートスタックを遠心。
   17. Evaporウェルが完全に乾燥するまで円錐状底板に液体を食べました。プレートは、シリコーン蓋で覆い、この段階で-20℃で保存することができます。
   18. 激しく15分間振とうしながら、0.5％ギ酸の32μLでペプチドを再溶解させます。 400mMの重炭酸アンモニウムの8μLを添加し、15分間激しく振盪しながらインキュベートします。 1分間200×gでプレートを遠心します。シリコーン蓋で覆い、質量分析まで-20℃でプレートを格納します。
3. 質量分析
   注：ショットガンプロテオミクスと互換性のある方法を使用して、高分解能質量分析計でペプチドを分析します。データ依存取得は、最も一般的に使用されるLCタンデムMSは、このタイプの分析のためにアップを設定し、効率的なペプチドの同定のために最適化されるべき、バックグラウンドノイズ上の冗長配列決定し、候補選択を最小化です。第一段階質量分析スキャン（MS1）にマススペクトルは、プロファイルモードで記録されなければなりません。これはお勧めですEDは、優先第二段階質量分析（MS2）のための二重及び三重荷電イオンを選択します。 M / Z 400-1,600の質量範囲は、8〜30個のアミノ酸の範囲の間で最もペプチドを同定するのに適しています。ここで、オービトラップ質量分析計を用いて分析するためのプロトコルが提供されます。
   1. ナノLC-MS / MSシステムのオートサンプラーを使用して分析当たりのサンプル20μLを注入します。脱塩し、逆相C18カラム（100μM番号2 cm）の上にペプチドを濃縮します。
   2. 300 NL / minで4から28までパーセントアセトニトリル/ 0.1％ギ酸の30分間の直線勾配を用いて分析C18カラム（75μmのID 15 cm）の上の別個のペプチド。
   3. M / z範囲380-1,600、M / Z 400において分解能30,000 2のTh、45秒間±10 ppmの動的排除の分離幅：次のパラメータを使用して依存取得方法トップ10のデータと質量分析計でペプチドを解析、1×10 MS ⁶およびMS / MSのための5,000で自動利得制御対象、最大噴射時間MS 150のMSおよびMS / MSのために100ミリ。

4.データ解析

1. MaxQuantを用いてタンパク質の同定および定量
   1. 質量分析生データから各ゲル分中のタンパク質を同定および定量するために自由に利用できるMaxQuantソフトウェアを使用します。
      注：MaxQuantは、データ依存取得ショットガンプロテオミクスアプローチによって生成されたデータ上で動作します。ブルーネイティブゲル画分からMSデータは、すべてのゲルスライスを組み合わせ実験の画分として別々の実験としないようにバッチで分析すべきです。化学量論計算を実行するためにiBAQ値ボックスにチェックを入れます。 MaxQuantを使用してデータベース検索およびタンパク質定量のための詳細なプロトコルは^{、22 21}に記載されています。
2. ペルセウスを用いたタンパク質プロファイル分析
   1. 同定されたタンパク質の移動プロファイルを表示するために自由に利用できるソフトウェアペルセウスを使用し、使用してそれらを比較統計分析。
      注：ペルセウスを使用する方法に関する一般的なドキュメントはhttp://www.coxdocs.org/doku.php?id=perseus:user:tutorialsで入手できます。サンプルデータセットは、補足データとして利用可能です。
   2. すべてのゲル画分についてのタンパク質同定および定量値を含むMaxQuant分析によって返さproteingroups.txtファイルをアップロードします。メインボックス（ 図1）に強度値を取り込みます。行列は、列としてゲル分率と、行の全てのタンパク質の同定を含むが表示されます。
   3. ヒットを逆に対応するエントリ、唯一のフィルター行のドロップダウンメニューでカテゴリの列（ 図2）に基づいてフィルタの行を選択することで、サイトや潜在的な汚染物質によって同定されたタンパク質を除去します。
   4. 次に、正規化ドロップダウンメニューの合計（ 図3）分割を選択することによって、総タンパク質に対する強度プロファイルを横切る各タンパク質の画分の強度を正規化します。新しいメートルATRIXが表示されます。
   5. 可視ドロップダウンメニュー（ 図4）内のプロファイルプロットを選択することによって、全てのタンパク質の移行プロファイルプロットを表示します。
   6. フィルター行のドロップダウンメニューで有効な値に基づいてフィルタの行を選択します。必要な有効な値の数に1を入力します。
   7. クラスタリング/ PCA]ドロップダウンメニューで階層的クラスタリングを選択することで、すべての青ネイティブゲル画分間同定されたタンパク質の階層的クラスタリングを実行します。列の木箱（ 図5）をオフにします。クラスターは次の行列にクラスタリングタブのヒートマップ（ 図6）に可視化されます。
   8. 系統樹でベイトタンパク質を含むクラスタを探します。クラスタの他の成分は、餌と同時移行タンパク質を表し、したがって、同複合体の潜在的相互作用タンパク質/サブユニットです。

ペルセウスデータアップロードウィンドウの R /> 図1のスクリーンショット。図はペルセウスにタンパク質同定および定量データをロードするための手順を示しています。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

サイトによって同定されたヒットとタンパク質を逆に、汚染物質に対応するエントリのフィルタリングにペルセウスウィンドウのスクリーンショット2.図。カテゴリ列によってフィルター行を選択すると、データセットから排除されるべきタンパク質のエントリの種類を選択するための新しいウィンドウが開きます。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

/55498fig3.jpg」/>
ペルセウス正規化ウィンドウの3スクリーンショット図。正規のメニューで分割を選択すると、さまざまなオプションと、新しいウィンドウが開きます。合計を選択すると、すべての画分を横切ってそのタンパク質の合計強度によって各画分中のタンパク質の強度値を分割します。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

ペルセウスは、移行プロファイルのプロットを示す図4.スクリーンショット。タンパク質は、それらの対応するプロファイルを強調するためのプロファイル以下のマトリックスに選択することができます。ツールバーには、プロファイルを編集してエクスポートするために使用することができます。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

ペルセウス階層的クラスタリング・ウィンドウのスクリーンショット5.図。図は、マンハッタン（L1）の距離メトリックを使用して、タンパク質の階層的クラスタリングの設定を示しています。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

ペルセウスの図6のスクリーンショットは、デンドログラムとタンパク質強度ヒートマップを示します。メインパネルの右側のワークフローは、各ステップ実施し、得られた行列を示し、任意のステップを取り消すために使用することができます。ワークフローはまた、任意の中間行列から分岐することができます。 このFの拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。igure。

3. 相対的化学量論の計算
   1. ベイトタンパク質との共クラスタリングに基づいたタンパク質複合体のサブユニットを選択し、それらが表示されるプロファイルのピーク（複数可）を区切ります。
   2. 各画分中の各サブユニットのためMaxQuant分析によって返さiBAQ値を別々に使用して、その画分の対応するベイトiBAQ値により正規化。
   3. 選択されたピークの画分を横切っベイト及びタンパク質複合体のサブユニットの正規化iBAQsをプロットし、線形回帰を適用します。その正規iBAQ値の傾向を比較することによって、餌する複合体サブユニットの相対量を計算します。
4. タンパク質複合体の大きさの推定
   1. サンプルレーンから整列ブルーネイティブゲルスライスの予測分子量を計算するためにタンパク質標準を使用します。これらのことから、Y軸 -軸にx軸および分子量でゲルスライスをプロットし、線形回帰モデルを生成します。
   それらが同定され、そこから青色ネイティブスライス（複数可）に基づいて、タンパク質複合体（単数または複数）の観察された分子量範囲を推定するためにモデルを使用します。

結果

質量分析によるアフィニティー精製ブルー天然タンパク質相関プロファイリングのワークフローは、（ABC-MS）戦略が、図7に示されています。関心対象のタンパク質の周り天然タンパク質複合体（この場合、フラグに）エピトープタグに対する抗体を用いたアフィニティー精製および競合的溶出によって単離されます。複合体は、BN-PAGEによって分離され、そして全体のゲルレーンを48個のセクションに切り出し、ショットガンLC-MS / MSのために準備されます。定量的MS情報は、青色ネイティブ分離挟んで同定されたタンパク質の移行プロファイルを生成するために使用されます。重なり合うピークを有する別個の複合表示同様の移動プロファイルを形成するように相互作用するタンパク質。関心対象のタンパク質が複数のアセンブリに関与する場合、複数のピークは、その移行プロファイルで観察されたサブ複合体は、ブルーネイティブゲルの分解能の範囲内である与えられています。 MIGの体系的な比較配給プロファイルは、階層的クラスタリングを使用してプロファイリングタンパク質相関によって達成することができます。すべての画分についてのデンドログラムとピーク強度は、異なるタンパク質複合体（ 図8）に属するタンパク質相互作用の同定を容易に、ヒートマップに可視化されます。

我々はMTA2、複雑な^20を改造NURDクロマチンのコアサブユニットの相互作用パートナーを分析するために、この戦略を使用していました。 図9に示すように、MTA2の移動プロファイルは、より高い存在量を表示低い質量ピークと、700 kDaの1.2 MDA間の異なる強度の2つのピークを示しました。 MTA1 / 3、HDAC1 / 2とMBD3を含む他のNURDコアサブユニットは、サブユニット、すなわちChd4の一部についてのピークはあるが、同一の分離パターンを示し、B Gatad2a /及びRbbp4 / 7は、（図9A逆存在量分布を有しB）。これとは対照的に、のCdkのプロフィール2ap1は、Wnt遺伝子のプロモーター²³にNURD複合体を動員調節因子は、唯一のより高い質量ピーク（ 図9C）を表示し、そうSALL4もNURD ^20、24、25結合することが示されている転写リプレッサーを行いました。したがって、ブルーネイティブPAGEによってアフィニティー精製MTA2関連タンパク質の分画は、NURD複合体の2つの異なる形式を解決することができました。

ABC-MSはまた、特定のタンパク質のエンティティに割り当てる一方、新規相互作用の同定を可能にします。ヒートマップで表されるタンパク質クラスターと分数強度の検査を通じて、我々はWDR5 2つのNURD Pと一致する2つの移行のピークを示すと共に、NURDサブユニットとWDR5、MLLメチルトランスフェラーゼ複合体²⁶の調節サブユニットとの間の強い相関を検出しましたWDR5とNURDの間の新規の相互作用を示唆しeaks（ 図8）。私たちは、共免疫沈降およびサイズ排除クロマトグラフィー²⁰での同時移行により、この相互作用を確認しました。

階層的クラスタリングにおける距離メトリック計算の選択は、クラスタひいては相関の形状に影響を与えるであろう。私たちは、目的のタンパク質または複合体の既存の相互作用の知識を持つ最高のフィット感を実現するために異なるメトリックを試してお勧めします。一般的に、我々は、マンハッタン（L1）距離メトリック²⁰で最良の結果を達成しました。ピアソン相関やユークリッド距離メトリックは、代替分別技術^10、11、12に基づいて、複合体を同定するために報告されています。

泉ブルーネイティブ画分から得られたtitative MSデータはまた、タンパク質複合体の化学量論を決定するために用いることができます。 iBAQ（強度基づいて絶対定量）値は、同定されたタンパク質^27、28の相対的存在量の尺度を提供します。マイグレーションプロファイルピーク内の全ての画分中のタンパク質複合体メンバーのiBAQ値は、相対的な量を得るために、ベイトタンパク質のそれに正規化されます。所与のタンパク質複合体のプロファイルのピークを横切る正規iBAQs水平トレンドに従うべきであり、トレンド値は、ベイトタンパク質に対する相互作用タンパク質の化学量論を反映します。化学量論計算のより詳細な表現については^、20を参照してください。

図7：ABC-MS Sを要約する概略ワークフローtrategy。この図は^、20から変更されています。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

MTA2の相互作用のBN-PAGE移動プロファイルの図8の階層的クラスタリング。 MTA2関連タンパク質は、それらの移動プロファイルの類似性に基づいてクラスタ化されました。 NURD錯体を含有するヒートマップの一部のみが（青色のボックスに囲まれている）に示されています。黄色のボックスは、NURD複合体とWDR5の強い相関関係を強調しています。注釈付きの分子量は、同一ゲルで実行タンパク質標準の移動距離から推定しました。この研究は、もともと生化学とMoのためのアメリカの社会は、分子細胞プロテオミクス²⁰に掲載されました lecular生物学。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

NURDサブユニットおよび関連タンパク質の図9 BN-PAGEの移行プロファイル。 A）同様の強度パターンに存在MTA2とNURDサブユニット。逆強度パターンを有するB）MTA2とNURDサブユニット。唯一のより高い分子量のNURDエンティティ中に存在するC）MTA2とCdk2ap1、。注釈付きの分子量は、タンパク質標準の移動プロファイルから推定しました。この研究は、もともと分子細胞プロテオミクス²⁰生化学・分子生物学のためのアメリカの社会に掲載されました。_blank ">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

補足データ：サンプルデータセット。 ABC-MS実験からのタンパク質同定および定量値を含むMaxQuant由来proteingroups.txtファイル。この研究は、もともと分子細胞プロテオミクス²⁰生化学・分子生物学のためのアメリカの社会に掲載されました。 このファイルをダウンロードするにはこちらをクリックしてください。

ディスカッション

ここでは、タンパク質複合体を解決するために、定量的質量分析と組み合わせたブルーネイティブゲル電気泳動、続いてアフィニティー精製の使用を記載しています。このアプローチは、機能性タンパク質アセンブリに1次元のタンパク質相互作用のリストを解明するための方法を提供しています。

私たちは、エピトープタグ融合タンパク質の使用に基づく方法を示しています。しかし、タグ付けされたタンパク質を発現する細胞株が利用できない場合、代替は、目的のタンパク質に対する抗体を使用するのが良いかもしれない、ネイティブの競合溶出を達成することが可能なペプチドが提供されます。出発材料とビーズの量の量は、標的タンパク質の発現レベルに応じて変更する必要があるかもしれません。我々は、典型的には、出発材料2-5×10 ⁸細胞を用いて、このプロトコルを実行し、これも低い発現レベルを有するタンパク質に十分です。溶解緩衝液の組成は、達成するために経験的に選択されるべきです近くに餌の可溶化を完了します。これは、特定のクロマチン結合または膜タンパク質で、タンパク質のいくつかのタイプのために挑戦される可能性があります。代替オプションは、研究下のタンパク質複合体は、高塩、またはクロマチン結合タンパク質^20、29のための超音波処理および/またはヌクレアーゼ処理を使用して安定しているという条件で、塩の量を増加させることを含みます。膜タンパク質の場合には、DDMまたはジギトニンに洗剤を切り替えは³⁰が望ましいことがあります。 DNA結合タンパク質の場合、精製工程²⁰中にこのようなベンゾナーゼヌクレアーゼを含むことが有用です。核酸の完全な除去は、検出された相互作用は、タンパク質間で発生し、DNAによって媒介されないことを保証します。

このアプローチを使用する際に考慮すべき重要な要素は、調査中の複合体の安定性です。手順が長く、preservinを含むことができますGタンパク質複合体で一晩。我々は2つのクロマチンリモデリング複合体（D.ボーデとM.パルド、データは示していない）との良好な成功を収めているが、これは評価されるべきです。必要に応じてアフィニティー精製工程を短縮することができます。

サイズ排除クロマトグラフィーなどのネイティブの分別を許可別の技術は、広くタンパク質複合体を特徴づけるために50年以上にわたって使用されています。我々および他のものはブルーネイティブPAGEの解像度は、サイズ排除クロマトグラフィー^{20、31、32、33を}用いて達成されるものよりも優れていることを示しています。ブルーネイティブPAGEのもう一つの利点は、それが高価なクロマトグラフィーシステムを、必要としないことであるが、むしろ研究室で広く普及しているタンパク質の電気泳動装置を使用しています。ハンズオン時間の面では、この方法では、伝統的なGELC-MS / MS Aより多くの作業を必要としませんpproachまたはオフラインのクロマトグラフィー分画。ほとんどの分別技術がそうであるようにしかし、それは彼らの解像度に制限があります。質量および形状が非常に均一または近接している複合体は、青色ネイティブPAGEによって提供される解像度を超えていてもよく、従ってここで報告されているように、プロトコルは、共有サブユニットと別個の複合体を解決するために普遍的に成功しないかもしれません。心強いことに、我々は3つのサブユニット（M.パルド、投稿準備中）を共有する2つの非常に類似した四量体複合体を分離することに成功しています。

質量分析はますます敏感になってきているので、非特異的相互作用と汚染物も微量ではAP-MSサンプルにおいて検出することができます。ここで紹介する方法は、より高い分子量の餌移行ピークと一致する移行ピークを有するタンパク質に着目してアフィニティ精製におけるバックグラウンド汚染から実際の相互作用の識別に役立つ可能性があります単量体タンパク質。

いくつかのグループは、前の分離^{10、11、12、34}を必要とせずに細胞スケールでのタンパク質複合体を描写するタンパク質相関プロファイリング続く分別技術を使用しています。しかしながら、これは、準化学量論的相互作用を検出するための故障をもたらすことができます。アフィニティ精製によって濃縮ステップの取り込みは、これを克服するのを助けることができます。ここで説明するアプローチは、タンパク質複合体のトポロジーを探索し、所定のタンパク質が同じ細胞コンテキスト内に参加する複数の複合体を解明するための一般的に有用であるべきです。戦略は、タンパク質複合体を解決するために、高価なクロマトグラフィー分画の機器を持っていない可能性が研究室にシンプルかつ従順です。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
Protein G Dynabeads	Life Technologies	10003D
FLAG抗体 M2	Sigma-Aldrich	F1804
Tween-20、タンパク質グレード、10%溶液	ミリポア	655206
ジメチルピメリミデート	Sigma-Aldrich	80490
0.2 M トリエタノールアミン緩衝液、pH 8.2	Sigma-Aldrich	T0449
3x FLAGペプチド	Sigma-Aldrich	F4799
Vivaspin 5K NMWCO, PES	Sartorius	VS0112
NativePAGE 3-12% Bis-Tris gel	Life Technologies	BN1001
20x NativePAGE Running Buffer	Life Technologies	BN2001
20x NativePAGE Cathode Additive	Life Technologies	BN2002
4xNativePAGEサンプルローディングバッファ	ライフテクノロジー	BN2003
NativeMARK	ライフテクノロジー	ズLC0725
NativePAGE 5% G-250サンプル添加物	ライフテクノロジー	BN2004
Nunc 円錐底 96 ウェルプレート、ポリプロピレン	Thermo	249944
マルチスクリーン HTS 96 ウェルろ過システム	Thermo	MSDVN6550
Nunc 96 ウェルキャップ ナチュラル	Thermo	276002
TCEP (トリス(2-カルボキシエチル)ホスフィン塩酸塩)	Sigma-Aldrich	646547
ヨードアセトアミド	Sigma-Aldrich	I1149
アセトニトリル、HPLC グレード	Fisher Scientific	A/0627/17
トリプシン、シーケンシンググレード	Roche	11418475001
MaxQuant (ソフトウェア)	N.A.	N.A.	http://www.biochem.mpg.de/5111795/maxquant
ペルセウス (ソフトウェア)	N.A.	N.A.	http://www.biochem.mpg.de/5111810/perseus