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方法論記事

代謝産物分析のためのタンデム液体クロマトグラフィー - 質量分析に基づくアプローチ

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DOI：

10.3791/55558

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2017年3月28日

 ,  ,  , 
1Department of Biology, Georgetown University, 2Division of Infectious Diseases, Weill Cornell Medical College, 3Department of Medicine, Weill Cornell Medical College

この記事について

サマリー

ここでは、液体クロマトグラフィーおよび質量分析を介して、 黄色ブドウ球菌およびそれらのその後の分析からの代謝産物を抽出するためのプロトコルを記載します。

要約

細菌性病原体を阻止するための努力では、ホストは、多くの場合、感染部位での栄養素の利用可能性を制限します。この制限は、細胞の代謝を調節する、調節因子が応答するための鍵代謝物の存在量を変えることができます。近年では、タンパク質やRNAの数は、病原性遺伝子発現の重要な調節因子として浮上しています。例えば、コーディタンパク質は、分枝鎖アミノ酸及びGTPのレベルに応答して、広く、低G + Cグラム陽性細菌で保存されています。 黄色ブドウ球菌のグローバルレギュレーターとして、コーディは、毒性の多数および代謝遺伝子の発現を制御します。私たちは、 黄色ブドウ球菌は、潜在的にホスト環境で遭遇栄養制限条件に適応するための努力でその代謝状態を変更するために、部分的には、コーディを使用すると仮定しました。この原稿は、質量分析と連結した液体クロマトグラフィーを用いて、 黄色ブドウ球菌からの代謝産物を抽出し、分析するための方法を記載していますtrometry、この仮説をテストするために開発されたプロトコル。この方法はまた、このような連続ケモスタット培養を使用することなく、生物学的に定常状態と一定の通気を維持するなど厳しさと再現性を確保するベストプラクティスを、強調しています。 USA200メチシリン感受性黄色ブドウ球菌に対してはUAMS-1親株を分離、同質遺伝子コーディ変異体は、（（ 例えば 、スレオニンおよびイソロイシン）アスパラギン酸に由来するアミノ酸の有意な増加を示し、それらの前駆体の減少、例えば 、アスパラギン酸およびO -acetylhomoserine ）。これらの知見は、RNA配列解析で得られた転写データとよく相関：これらの経路における遺伝子は、 コーディヌル変異体に10〜800倍の間にアップレギュレートしました。トランスクリプトームとメタボロームのグローバルな分析を結合することは、環境または栄養ストレスに直面したとき細菌がPHYのに潜在的な洞察を提供し、彼らの代謝を変化させる方法を明らかにすることができます栄養素の欠乏に関連したiological変化は、感染の間に経験しました。そのような発見は、新規な抗感染薬および治療薬の開発のための道を開くことができます。

概要

細菌性病原体は、ホスト環境内の多くの課題に取り組まなければなりません。免疫細胞による直接攻撃に加えて、ホストはまた、栄養免疫1、2を生成し 、細菌の生存および複製に必須の栄養素を隔離します。これらの厳しい環境を生き残るためには、細菌性病原体は、病原性因子を展開します。これらの要因のいくつかは、細菌が免疫応答を回避することができます。他の要因は、組織由来成分3、4、5を消費して不足している栄養素を補充するために、細菌を可能にすることができるようなヒアルロニダーゼ、thermonuclease、およびリパーゼなどの消化酵素を分泌が挙げられます。実際、細菌が毒性、6因子7の産生に対する細胞の生理学的状態を結ぶ調節系を進化させてきました、 クラス= "外部参照"> 8、9、10アップ。

証拠の成長体は、代謝および毒性を結ぶ重要な調節因子としてのコーディを指します。第ジペプチドパーミアーゼ（DPP）遺伝子11のリプレッサーとして枯草菌で発見が、コーディは、現在、ほぼ全ての低G + Cグラム陽性細菌12,13によって産生されることが知られており、炭素に関与する遺伝子の多数を調節して窒素代謝14、15、16、17、18、19。病原性の種では、コーディも最も重要な病原性遺伝子の一部20、21の発現を制御し、EF "> 22、23、24、25、26、27コーディは二つの配位子のクラスによってDNA結合タンパク質として活性化される：分岐鎖アミノ酸（BCAA、イソロイシン、ロイシン、およびバリン[ILV]）及びGTP。これらの栄養素が豊富である場合、コーディは抑制する（またはいくつかの場合において、刺激）転写を。これらの栄養素は限らなるように、コーディ活性は徐々に中央代謝に接続された様々な代謝経路を介してその再ルーティング前駆段階的転写応答をもたらす、低減されます28、29、30。
質量分析（LC-MS）に連結されたタンデム液体クロマトグラフィーを正確に小分子の細胞内代謝物31を同定および定量することができる強力な技術です。相互コンダクタンスとペアになったときriptome分析（ 例えば、RNA-配列）、この解析ワークフローは、環境または栄養ストレスに応答して起こる生理的変化への洞察を提供することができます。ここでは、LC-MSを介した黄色ブドウ球菌細胞とその後の分析からの代謝産物の抽出のための方法を提示します。このアプローチは、 黄色ブドウ球菌の生理学上のコーディの多面的な効果を発揮するために使用されています。

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プロトコル

緩衝溶液の調製

  1. 超純と1Xの最終濃度になるように10×PBSのストック溶液を希釈することにより（蒸留及び脱イオン）水;リン酸緩衝生理食塩水（pH7.4のPBS）を調製。
  2. アセトニトリルを2mL、メタノール2mL、超純H 2 O 1mLの、及びギ酸の19μL（0.1mMの最終濃度）を組み合わせることにより、クエンチング溶液を調製します。
  3. LC-MSは、超純水にギ酸（0.2％[v / v]の最終濃度）を添加することによりA溶媒準備。
  4. アセトニトリルにギ酸（0.2％[v / v]の最終濃度）を添加することによりLC-MSの溶媒Bを調製。
    注：すべてのソリューションは、（一般的に高速液体クロマトグラフィーグレード）利用可能な最高純度の試薬を用いて調製されなければなりません。ソリューションは、各実験の前に新たに調製し、使用前に氷上で保存してください。

定常状態黄色ブドウ球菌の成長2.確立

  1. ストリークS. aureu凍結グリセロールストックからのトリプシン大豆寒天（TSA）の分離のための関心のS株。 16-24時間37℃でインキュベートします。
  2. トリプシン大豆ブロス（TSB）又は各株の単一コロニーを有する滅菌ガラス培養管に別の適切な培地4mlに植菌。 16-20時間、37℃で毎分60の回転（rpm）で回転させながら傾斜（〜70°の角度）でインキュベートします。
    注：細胞生理に影響を与える工程2.2に記載のものを含む、標準的な方法を使用するときに一晩培養物を酸素勾配を受けやすいです。したがって、我々は（以下、ステップを2.4から3.2を参照）、生物学的定常状態を確保するために複数のバック希釈戦略を採用しています。
  3. 600nmで（OD 600）でのステップ2.2からの培養物の光学密度を測定するために分光光度計を使用します。光学的基準（ブランク）として滅菌媒体を用います。別々の、250mLのデロングフラスコ内（37℃に予め温めておいた）滅菌TSB培地50mlに0.05のOD 600にこれらの細胞を希釈します。
  4. IncuBATE 280 rpmで振盪しながら水浴中で37℃で培養。
  5. 30分ごとに、OD 600回の測定を行います。光学濃度が増加するにつれて、それは、分光光度計の線形吸光度範囲内に留まるようにTSBで培養物を希釈することが必要になることができます。
  6. ステップ2.5からの培養物を〜0.8〜1.0のOD 600を達成したとき、0.01〜0.05のOD 600まで37℃TSB 50mlにそれらを継代培養を繰り返し2.4および2.5ステップ。

3.サンプルのコレクションのセットアップ

  1. 適当な容器（ 例えば、ガラス皿、アイスバケット、またはクーラー）に砕いたドライアイスのベッドを準備します。
  2. 培養物の光学濃度が所望の収穫点に近づくと、≥5分間ドライアイス上で35ミリメートル未処理のペトリ皿と予備冷却するために急冷溶液1mLを加えます。
    注：「希望収穫ポイントは」実験的な目標に応じて異なります。例えば、一方がMを検査した場合etabolites好気性成長の間、この状態の重要な指標は、酢酸排泄及び後指数増殖期32、33中の酢酸の再同化を含みます。一般に、この点は、特定の成長段階（ 例えば、対数期）以内でなければなりません。この段階に関連する特定のOD 600の値は、異なる細菌株および増殖培地の間で変化してもよいです。
  3. ゴム栓で（-20℃に予冷）ステンレス鋼フィルターフリットを配置し、ハウス真空または真空ポンプに取り付けられた真空フラスコの上にそれを置きます。
  4. 真空を適用し、上部に混合セルロースエステル膜（0.22μmの孔径）を置きます。
    注：フリットと同等の直径を有するフィルタを使用すると、適切サンプルがフィルタを介してではなく、エッジ上に描画されることを保証するために、このフィルタをセンタリングすることが重要です。氷冷、滅菌H 2 Oを用いて膜を濡らすことを助けることができます膜を配置しています。

4.サンプルの収穫

  1. OD 600〜0.4〜0.5で、フラスコからの培養物の13 mLのを除去するために血清学的ピペットを使用して、フィルターに試料を適用します。
  2. 全サンプルを濾過した後、直ちに培地関連代謝産物を洗い流すために氷冷PBSの≥5mLでフィルターを洗浄します。
  3. 真空を外し、フリットからフィルタを除去するために滅菌ピンセットを使用します。予冷クエンチ溶液にフィルタ（セル側ダウン）を反転させます。
    注：これは、すぐに液体が代謝活性を逮捕、細胞の急速冷却を確保するために除去されているように（ すなわち、数秒以内）すぐに上記の手順を実行することが重要であると。
  4. ≥20分間ドライアイス上でクエンチ溶液中でフィルターをインキュベートします。
  5. 滅菌ピンセットを用いて、ペトリ皿にフィルタ（セルサイドアップ）を反転し、Tのオフ細胞をリンスするためにマイクロピペットを使用して彼は、クエンチ液に膜。
  6. 急冷溶液中で細胞を再懸濁し、次いで0.1ミリメートルシリカビーズ〜100μLを含む無菌2mLの耐衝撃性チューブに細胞懸濁液を移します。ドライアイス上または-80°Cでこれを保管してください。

5.代謝物の抽出

  1. 融解サンプルを湿潤氷上及びサイクル間ドライアイス上で2分間の冷却期間と、6,000rpmで4つの30秒バーストでホモジナイザーで細胞を破壊します。
  2. 最高速度で予め冷却、冷蔵微量で15分間溶解物を明確に（ すなわち、≤4℃で18213×gで）。
  3. きれいな微量遠心チューブに上清を移します。
  4. マイクロピペットを用いて、ステップ6中の残留ペプチド含量の定量化のためのマイクロ遠心チューブにサンプルの小部分を転送します。 -80℃で残りを格納します。
    注：予約済み試料の体積は、ステップ6.1で使用されるBCAアッセイに依存して、変化します。このサンプルは、即時の分析のために湿った氷の上に格納されるか、または-80℃で凍結されなければなりません。

6.ビシンコニン酸（BCA）アッセイ

  1. 各試料の残留ペプチド濃度を決定するために、ステップ5.4からのサンプルを用いて、キットの製造業者によって推奨されるようにBCAアッセイを行います。

7. LC-MS

  1. ステップ1.4で調製したLC-MS溶媒B、75μLで抽出した黄色ブドウ球菌の75μLを混合します。
  2. 混合し5分間13,000×gで回転させる渦。
  3. 液体クロマトグラフィー（LC）バイアルに上清の100μLを置き、それをキャップ。空気の泡が試料中に閉じ込められていないことを確認してください。
  4. LC-MSオートサンプラーにLCバイアルをロードし、ソフトウェアで実行されているリストを編集「オフラインワークリストエディタ。」
    1. "サンプル名"を記入（ 例えば、野生型-1）、 "サンプル位置"（ 例えば、P1-A1）、 "メソッド"（ 例えば、ギACID-負の方法）、および"データファイル"（ 例えば、野生型-1）の列。ボタン「保存ワークリスト」ボタンをクリックしてください。 「質量分析データ収集ワークステーション」のソフトウェアと入力以前に保存されたワークリストを開きます。連続LC-MS測定を開始するには、「スタートワークリストファイル名を指定して実行」ボタンをクリックしてください。
  5. 列上のサンプルを分離し、フライト（TOF）スペクトロメータ、およびLCシステムと結合TOF分析計の時間に列をリンクします。次のように移動相勾配を使用する：0-2分、85％溶媒Bを、 3~5分、80％溶媒B。 6~7分、75％溶媒B。 8~9分、70％溶媒B。 10から11.1分、50％溶媒B。 11.1から14分、20％溶媒B。及び14.1から24分、5％溶媒B。 85％溶媒Bで10分間の再平衡期間と0.4 mLの分-1の流量で終わります。
  6. アイソクラティックポンプを用いて、同時質量軸の較正を可能にするために実行して基準質量溶液を注入します。
    注：この手順標準TOF分析計のマニュアルに基づいています。
    1. リアルタイムキャリブレーションを実行するために、基準質量液として酢酸D4及びヘキサキス（1H、1H、3H-テトラフルオロ）ホスファジンの混合物を使用します。分-1注入用の2.5ミリリットルの流量でアイソクラティックポンプを使用します。

イオン数の8バッチ修正

  1. （1複製、 例えば、野生型）バッチ補正のための基準サンプルとして機能する任意のサンプルを指します。
  2. 基準試料内の全ての代謝産物のためのイオンカウントの合計を計算します。すべてのサンプルについてこの計算を繰り返します。
  3. 比を生成するために、参照試料の総イオンカウントすることにより、各試料の総イオンカウント数を分割します。
  4. 各代謝産物のバッチ補正イオンカウントを得るために、サンプル/基準比率によってサンプル内の各代謝産物のためのイオンカウントを分けます。

9.ペプチドの正規化

  1. D各代謝産物の正規化値を生成するためにステップ6でBCAアッセイを用いて決定したペプチド濃度によって、ステップ8で得られた各サンプルのバッチ補正イオンカウント値をivide。
    注：ステップ9.1で得られた各代謝産物の正規化、バッチバッチ補正イオンカウントは直接株の間で比較し、統計的分析（-test 例えば、マンホイットニーU）に供することができます。あるいは、いずれかの治療または遺伝的背景により変化しないことが知られている代謝産物は、代謝産物の分解による変化を検出するための正規化として使用することができます。抽出緩衝液中のL-ノルバリン又はgluraric酸の既知量の包含は、試料処理34中の損失を補正するために使用することができます。

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結果

私たちは、豊かな、複雑な培地中でのin vitro成長中の黄色ブドウ球菌における細胞内代謝物プールを分析しました。原理の証明として、我々は比較メチシリン感受性黄色ブドウ球菌骨髄炎の間の代謝産物プロファイルはUAMS-1（野生型[WT]）及びグローバル転写調節コーディ（Δ コーディ ）26を欠く同系株を単離します。プロトコルのステップ2に記載したように、定常状態は、WT及びコーディ株の指数培養物を、TSB培地において確立しました。野生型及びコーディ -null変異体培養物の成長挙動は、成長収率及び速度でのみ軽度の差（ 図1）を用いて、類似していました。 RNA-配列およびマイクロアレイ技術を使用して、我々などがアスパラギン酸に由来するアミノ酸の生合成に関与する酵素をコードする複数の遺伝子がコーディ -null変異体Cに脱抑制されたことを明らかにしましたTSB中の...

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ディスカッション

すべての小分子代謝物は、中央代謝経路におけるそれらの共通の起源を介して相互に接続されています。指数関数的成長の間、細菌細胞は、特定の条件の下での生理的状態のスナップショットを提供し、生物学的および代謝定常状態です。コーディはILV​​とGTPに応答することによって栄養素充足を監視します。 ILVとGTPプール降下として、コーディ活性は、おそらく徐々に栄養枯渇30を増加させることに適合するように、その標的遺伝子の発現を調節、低減されます。コーディ欠損株はILVとGTPが環境から除去されたかのように振る舞うだけコーディ熟練株に成長挙動の相対的で非常に軽度の差（ 図1）を示します。したがって、これらの株における代謝物の定常状態プールの比較は栄養素が不足しているとき、代謝が再設定される範囲を明らかにするユニークな機会を提供してくれます。これは、OUことに留意すべきですコーディ活性が最大になるときR実験は（ILVとGTPが指数期に最も豊富に存在する）代謝物の存在量を調査します。しかし、他の質問は、成長の他の段階で対処す...

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開示事項

著者は、彼らが競合する金融利害関係を持たないことを宣言します。

謝辞

この作品は独立賞にNIH経路（GM 099893を付与）し、教員のスタートアップ資金SRBに、だけでなく、研究プロジェクト助成（GM 042219を付与）によって部分的に資金を供給されました。資金提供者は、研究デザイン、データ収集および解釈、または出版のために仕事を提出するという決定には役割がありませんでした。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
材料/機器a
DeLong培養フラスコ(250 mL)Belco2510-00250
Sidearm Flask, 500 mLPyrex5340
3穴ラバーストッパー, #7Fisher14-131E
ステンレススチールフィルターホルダー/フリットVWR89428-936
ペトリ皿、35 mmコーニング430588組織培養未処理
混合セルロースエステル膜、0.22 μm孔径ミリポアGSWP02500
耐衝撃性チューブ、2 mLUSA Scientific1420-9600
シリカビーズ、0.1 mmBiospec Products Inc11079101Z
Precellys 24 ホモジナイザーBertin InstrumentsEQ03119-200-RD000.0
Micro BCA Protein Assay KitPierce (Thermo Scientific)23235
Cogent ダイヤモンド水素化物 C カラムAgilent70000-15P-2
精密質量飛行時間 (TOF) LC-MS、6200 シリーズAgilentG6230B
クアットポンプ、1290 シリーズAgilentG4204A 
ビンポンプ、1290シリーズAgilentG4220A 
バルブドライブ、1290シリーズAgilentG1107A 
アイソクラティックポンプ、1290シリーズAgilentG1310B 
TCC、1290シリーズAgilentG1316C 
サンプラー、1290シリーズAgilentG4226A 
サーモスタット、1290シリーズAgilentG1330B 
Chemical
Tryptic Soy BrothBecton Dickinson211825
Difco Agar, GranulatedBecton Dickinson214530固体培地には 1.5% [w/v] 寒天が含まれています
リン酸緩衝生理食塩水 (pH 7.4) 10xAmbionAM9624超純水アセ
トニトリルで新鮮に 1x に希釈しますFisher ScientificA955-500Optima LC-MS
メタノールFisher ScientificA456-500Optima LC-MS; toxic
Formic AcidSigma Aldrich94318質量分析用、98%
Software
MassHunterAgilentG3337AA
Bacterial StrainSpeciesStrainGenotype
strong>SRB 337Staphylococcus aureusUSA200 MSSA UAMS-1野生型
SRB 372黄色ブドウ球菌USA200 MSSA UAMS-1ΔcodY::erm
a記載されている化学薬品および材料は、説明されている方法に固有のものであり、標準的な実験用化学薬品や消耗品は含まれていません。

参考文献

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