ペプチド競合アッセイは、種々の分子および免疫学的実験において広く使用されている。本稿では、in vitroオリゴペプチド競合キナーゼアッセイの詳細な方法と、特定のリン酸化部位を見出すのに有用な関連する検証手順について説明します。
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この記事について
サマリー
要約
特定の部位でのタンパク質のリン酸化は、その立体配座および他の分子との相互作用を決定する。したがって、タンパク質のリン酸化は、細胞の生物学的機能および特性に影響を及ぼす。現在、リン酸化部位を発見するための最も一般的な方法は、迅速かつ高感度な方法である液体クロマトグラフィー/質量分析（LC / MS）分析によるものである。しかしながら、比較的不安定なリン酸部分は、しばしば偽陰性シグナルを生じる断片化段階の間にホスホペプチドから放出されることが多い。そのような場合、部位特異的突然変異体を用いる伝統的なインビトロキナーゼアッセイはより正確であるが、この方法は面倒で時間がかかる。したがって、ペプチド競合を用いる代替方法が有利であり得る。 5 'アデノシン一リン酸活性化プロテインキナーゼ（AMPK）のコンセンサス認識モチーフが確立されており、位置スキャニングペプチドライブラリーを用いて検証したay 2 。したがって、新規基質のAMPKリン酸化部位は、ペプチド競合アッセイによって予測および確認することができた。この報告では、AMPK媒介性核因子赤血球2関連因子2（Nrf2）リン酸化を示すことにより、インビトロオリゴペプチド競合キナーゼアッセイの詳細なステップおよび手順を記載する。リン酸化部位を認証するために、我々は部位特異的突然変異体を用いて順次in vitroキナーゼアッセイを行った。全体として、ペプチド競合アッセイは、複数の潜在的なリン酸化部位をスクリーニングし、リン酸化部位突然変異体による検証のための部位を同定する方法を提供する。
概要
特定の残基でのタンパク質リン酸化は、広範囲の細胞プロセスにおいて重要な役割を果たす。従って、シグナル伝達ネットワークの理解は、特異的なリン酸化部位の同定を必要とする。さらに、リン酸化部位は、タンパク質内の個々のドメインが異なる構造および機能を有するため、タンパク質機能に対する効果を決定する。主要な抗酸化転写因子である核因子エリトロイド2関連因子2（Nrf2）の活性は、異なる部位でのリン酸化によって双方向的に調節される。我々の研究は、Nrf2のリン酸化を触媒するキナーゼに焦点を当てている。酸化チャレンジに対するNrf2のストレス応答は、主にセリン40でのリン酸化を介して急速に起こり、Nrf2を活性化するプロテインキナーゼC（PKC）-δによって媒介される3,4 。逆に、Fynは、チロシン5でNrf2の阻害的リン酸化を触媒するアクティビティの厳密な制御のために68。
リン酸化部位を発見するために使用される最も一般的な方法は、液体クロマトグラフィー/質量分析（LC / MS）分析である。迅速かつ高感度なリン酸化部位マッピングデータをこのように生成することができる。しかし、それにはいくつかの技術的な制限があり、しばしば偽陰性シグナルが生成されます。シーケンスのカバレッジが悪いと、LC / MS分析で頻繁に発生します。リン酸化部位を同定するためには、タンパク質の最大アミノ酸含量に関する情報が必要である6....
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プロトコル
1.安全性
注意：このプロトコールでは、[γ- 32 P] -ATPを用いてAMPKの活性を評価しています。リン-32は放射性同位元素であり、主にβ線を放出する。ベータ粒子のサイズは非常に小さいので、衣類や肌に容易に浸透することができます。ベータ線への外部および内部の両方の暴露は、皮膚の火傷および組織の損傷を引き起こすことを含め、人の健康に有害な可能性があります。
- アクリル遮蔽などの適切な保護を使用して[γ- 32 P] -ATPの使用を必要とするすべてのステップを実行します。
- すべての人員に、すべての手技中に有害な放射線への暴露の程度を監視するために、電子式個人線量計（EPD）が装備されていることを確認する。
- 適切な訓練と規制当局の承認後にのみ、オープンソースの放射線を取り扱うこと。
注：ここでは、すべての実験は、ソウル国立大学でのオープンソース放射線使用の訓練の終了後に行われた韓国政府（nssc.go.kr/nssc/en）の承認を得た。 - 地域の規制に従って放射性廃棄物を処分する。
注：ここでは、ソウル国立大学環境保護安全研究所の指示に従った。以下は、米国および欧州諸国の規制当局のリストである：米国、米国原子力規制委員会（http://www.nrc.gov/）。英国、健康安全局（HSE）（http://www.hse.gov.uk....
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結果
図1と図2は、以前に報告された論文8の繰り返し実験の結果を示しています。推定上のAMPK標的部位を模倣する3つの異なる10残基オリゴペプチド（Ser153を含む＃1,148-157; Ser335を含む＃2,330-339;およびSer558を含む＃3,553〜562）を合成し、 inインビトロキナーゼアッセイ。 AMPKによるNrf2のリン酸化は、オリゴペプチド＃3の存在下で大きく減少した（ 図1 ）。次に、部位特異的突然変異誘発アッセイを実施して、ペプチド模倣実験の結果を確認した。 Nrf2のAMPK介在性リン酸化に対するオリゴペプチド＃3の阻害効果を考慮して（ 図1 ）、我々はS558A-Nrf2変異体を生成した。リン酸化レベルを、野生型Nrf2とSインビ.......
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ディスカッション
AMPKが仲介する予測されるリン酸化部位の真正性を評価する簡単で便利な方法として、競合的なペプチドを用いて特異的なリン酸化部位を発見し、部位特異的突然変異体を用いて検証するために使用できるin vitroキナーゼアッセイをここで説明する。 。 インビトロ競合的AMPK活性アッセイから得られた代表的なデータは、部位特異的突然変異タンパク質を用いたアッセイの結果と一致し、ペプチド競合アッセイがリン酸化部位を決定するための有用なツールであることを示している。この方法は、セリン40 3で Nrf2をリン酸化するPKCδによってリン酸化された特異的部位を同定する研究においても用いられた。ペプチドは競合的にタンパク質に結合するので、結合モチーフ10,11を同定するためのインビトロ GSTプルダウンアッセイに原則を適用することもできる。さらに、このペプチドミメtic法は、リジン残基でのアセチル化のような他の翻訳後修飾の同定にも適用可能である。
こ.......
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開示事項
著者は何も開示することはない。
謝辞
この研究は、韓国政府の資金援助を受けた韓国国立研究財団（MSIP）（No. 2015R1A2A1A10052663およびNo. 2014M1A3A3A02034698）の支援を受けて行われました。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| HEPES | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | 15630 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 208337 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | E3889 | |
| DTT | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | D9779 | |
| β-glycerophosphate | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | G9422 | |
| Na3VO4 | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 450243 | |
| Protease inhibitor cocktail | Calbiochem, Nottingham, UK | 539134 | |
| ATP | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | A2383 | |
| AMP | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | A1752 | |
| AMPK | Upstate Biotechnology, LakePlacid, NY | 14-840 | |
| Nrf2 (WT) | Abnova, Taipei City, Taiwan | H00004780-P01 | |
| [γ-32P]-ATP | PerkinElmer Life and Analytical Sciences, Waltham, MA | NEG502A | |
| EZblue staining reagent | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | G1041 | |
| Pfu turbo DNA polymerase | Agilent Technologies, Santa Clara, CA | 600250 | |
| dNTP mix | Agilent Technologies, Santa Clara, CA | 200415-51 | 複数の解凍と凍結サイクルを避ける |
| DpnI | New England Biolabs, Ipswich, MA | R0176S | |
| LB broth | Duchefa Biochemie BV, Haarlem, Netherlands | L1704 | |
| Ampicillin | Affymetrix, Santa Clara, CA | 11259 | |
| Agarose LE | iNtRON Biotechnology, Sungnam, South Korea | 32034 | |
| HiYield Plus Gel/PCR DNA Mini Kit | Real Biotech Corporation, Taipei, Taiwan | QDF100 | |
| Coomassie Brilliant Blue R-250 | Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA | 161-0400 | |
| Bovine Serum Albumin | Bovogen Biologicals, Victoria, Australia | BSA100 | |
| グルタチオンセファロース 4B | GEヘルスケア、マールボロ、マサチューセッツ | 17-0756-01 | |
| 酢酸氷 | 河Duksan純粋な化学物質、安山、韓国 | ||
| メチルアルコール | 大中化学品 &Metals, Siheung, South Korea | 5558-4410 | |
| [header] | |||
| 台風 FLA 7000 | GE Healthcare, Marlborough, MA | 28-9558-09 | |
| SDS-PAGE kit | Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA | 1658001FC | |
| 真空ポンプ | Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA | 165-178 | |
| ゲルドライヤー | Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA | 165-1746 | |
| ダンシングシェーカー | FINEPCR, ソウル, 韓国 | CR300 | 洗浄にはマシンが必要です |
| Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA | T100 | ||
| インキュベーター/シェーカー | N-BIOTEK, GyeongGi-Do, Korea | NB-205L | |
| Microcentrifuges | LABOGENE, Seoul, Korea | 1730R | |
| クロマトグラフィーカラム | バイオ・ラッド・ラボラトリーズ、ヘラクレス、CA | 732-1010 |
参考文献
- Hardie, D. G., Schaffer, B. E., Brunet, A. AMPK: An energy-sensing pathway with multiple inputs and outputs. Trends Cell Biol. 26, 190-201 (2016).
- Gwinn, D. M., et al. AMPK phosphorylation of raptor mediates a metabolic checkpoint. Mol Cell. 30, 214-....
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