方法論記事

マイクロ電極アレイにおけるニューロン細胞培養の刺激に対するネットワーク応答の時間依存的増加

DOI：

10.3791/55726

⸱

2017年5月29日

 ,  ,  , 
1Krasnow Institute for Advanced Study, George Mason University, 2Neural Engineering, Bioengineering, George Mason University, 3Neural Engineering, Computer Science, George Mason University, 4Electrical and Computer Engineering, George Mason University

この記事について

サマリー

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

多電極アレイ上で培養されたマウス神経細胞は、電気刺激後の応答の増加を示す。このプロトコルは、ニューロンを培養する方法、活動を記録する方法、および刺激のパターンに応答するようにネットワークを訓練するプロトコルを確立する方法を示す。

要約

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

マイクロ電極アレイ（MEA）は、薬物毒性、次世代パーソナライズド医薬品の設計パラダイム、神経細胞培養におけるネットワークダイナミクスの研究に使用できます。単一のセルからの活動だけを記録できるパッチクランプのような従来の方法とは対照的に、MEAは、各電極を個別に配置するという厄介な作業を必要とせずに、ネットワークの複数のサイトから同時に記録することができる。さらに、多数の制御および刺激構成を同じ実験装置内で容易に適用することができ、幅広いダイナミクスを探索することが可能になる。これらのインビトロ研究における重要な動力学の1つは、培養されたネットワークが学習を示す特性を示す程度であった。 MEA上で培養されたマウス神経細胞は、電気刺激によって誘発された訓練後の応答の増加を示す。このプロトコルは、MEA上で神経細胞を培養する方法を示す。成功したメッキされた皿の95％以上からのコード;刺激のパターンに応答するようにネットワークを訓練するためのプロトコルを確立する。そのような実験の結果をソートし、プロットし、解釈する。ニューロン培養を刺激および記録するための独自のシステムの使用が実証される。ソフトウェアパッケージは、ニューロンユニットの分類にも使用されます。刺激後時間ヒストグラム、バースト間隔、バースト持続時間を視覚化し、トレーニングプロトコールの前後で刺激に対する細胞応答を比較するために、カスタム設計されたグラフィカルユーザインタフェースが使用される。最後に、この研究努力の代表的な結果と今後の方向性について議論する。

概要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

マイクロ電極アレイ（MEA）は、薬物の毒性、次世代パーソナライズド医薬品の設計パラダイム、神経細胞培養におけるネットワークダイナミクスの研究に使用できます1 。単一の細胞からの活動のみを記録できるパッチクランプ法や、単一のサイトで電極を囲むニューロンからの細胞外応答を記録できるガラスピペットによるフィールド記録などの従来の方法とは対照的に、MEAは同時に各電極を個々に配置するという煩雑な作業を必要とすることなく、細胞培養中の複数の部位から記録することができる。これは、その培養物内のネットワークを形成する細胞群間の動的相互作用の研究を可能にする。さらに、ネットワーク発射パターン2,3,4,5およびネットワーク制御6に対する電気刺激の効果は、/ sup>は十分に実証されており、電気的刺激および制御の多数の構成を同じ実験装置内で容易に適用することができ、幅広い時空間ダイナミクスを探究することができる。

これらのインビトロ研究における重要な動力学の1つは、培養されたネットワークが、学習の指標である7,8,9,10,11,12,13を示す程度であった。 Peixoto Labは以前、Ruaro らに記載されているように、高周波トレーニング信号の影響を調べました。 14 、マイクロ電極アレイ15上にプレートされたマウスニューロンのネットワーク上。これらの実験では、ネットワークは応答フォローインの増加を示した電気刺激によって誘導されるg訓練。増加した反応は、刺激認識を介した学習の一形態と考えられ、これにより、ネットワークは、特定の刺激（ すなわちトレーニング）プロトコルの適用後に刺激の変化に対して一貫した方法で応答した。

このプロトコルは、MEA上で神経細胞を培養し、皿の95％以上からの記録を成功させ、刺激のパターンに応答してネットワークを訓練し、単一ユニットの活動を分類し、ヒストグラムをプロットし、そのような実験。ニューロン培養の刺激および記録のための専用システム（ 表を参照 ）の使用、ならびにニューロンユニットを分類するためのソフトウェアパッケージ（ 表の表を参照 ）の適用を実証する 。カスタムデザインのグラフィカルユーザーインターフェイス（ 表の表を参照 ）を使用してポストsを視覚化します時間間隔ヒストグラム、インターバースト間隔、およびバースト持続時間の測定、ならびにトレーニングプロトコルの前後の刺激に対する細胞応答を比較することができる。

プロトコル

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

すべての動物の手続きは、NIHのガイドラインおよび/または実験動物の人間のケアと使用に関する公衆衛生サービス政策に従い、ジョージメイソン大学で制度的に承認された動物介護利用（IACUC）プロトコルに基づいています。

材料準備

  1. （2）500mLのビーカー、約24枚の濾紙（直径150mm、8つのウェッジに切断し、孔のサイズは問わない）に垂直に配置された長さ5.75インチのガラスピペット、1000μLの濾過ピペット200μLのろ過したピペットチップ、10μLのろ過したピペットチップ、および洗浄用の脱イオン水（少なくとも200mL）で洗浄します。
  2. 試薬と培地を調製する。
    1. 無菌技術を使用して生物学的に全ての試薬と培地を調製する。
    2. 表1に従ってポリ-D-リジン（PDL）を調製する。
      1. 滅菌DI水でPDLを最終cに混合する。50μg/ mLの濃度で、以下のように投与した。無菌の血清学的ピペットを使用して、96mLの滅菌DI水をオートクレーブしたガラス試薬ボトルに移す。
      2. 滅菌血清ピペットを使用して、4 mLの滅菌DI水をPDLを含む製造元のバイアルに加えます。ピペットでPDLを溶解する。同じピペットを使用して、96 mLの滅菌DI水を含むガラス試薬ボトルにPDL溶液を移す。
      3. ボトルをしっかりとキャップをしてからバイオハイブリッドから取り出し、ボルテックスしてください。バイオハザードでは、溶液を5mLアリコートに分け、 -20℃で未使用の溶液を凍結する。解凍したPDLは一度再凍結することができます。以前に再凍結した場合は、解凍した解を破棄します。
    3. 表2に従ってラミニン溶液を調製する。
      1. 以下のように、ラミニンをPBSと混合して20μg/ mLの最終濃度にする。滅菌血清ピペットを使用して、49 mLのPBSを50 mL遠心チューブに移す。
      2. 滅菌血清学を使用する1ピペットで1mLのPBSをラミニンの適切な重量を含む製造者バイアルに加える。ピペットでラミニンを溶解する。同じピペットを使用して、49mLのPBSを含む50mLの遠心管にラミニン溶液を移す。
      3. チューブをしっかりとキャップしてからバイオハイブリッドから取り出し、ボルテックスしてください。生物学的には、溶液を5mLアリコートに分け、 -20℃で未使用の溶液を凍結する。融解したラミニンは再凍結することができない。未使用の解凍溶液は廃棄してください。
    4. 表3のように記憶媒体を準備する。
      注記：保存媒体は、周囲のCO 2レベルで最大1ヶ月間組織を保存するために使用されます。それは購入することができます（材料の表を参照してください）、または周囲のCO 2細胞保存培地+神経細胞培養のための2％無血清サプリメント+安定化されたL-グルタミンの形態（材料表参照）。
      1. 10mLの保存用培地を調製するために、CaCl 2を含まない胚組織用保存培地10mLを15mLの遠心管に移す。神経細胞培養のための無血清補充液210μLとL-グルタミンの安定化形態55μLを加える。反転して軽く混合する。
      2. 保存媒体は感光性であるため、15 mLの遠心チューブをアルミホイルで覆って保護してください。チューブ当たり2mLの保存培地を分注し、合計5つのアリコートを得る。冷蔵庫に2週間まで、または使用可能になるまで保管しますが、冷凍しないでください。
    5. 表4に従って、DMEM 5/5培地を調製する。
      1. 神経細胞培養、ウマ血清（HS）、ウシ胎児血清（FBS）、およびアスコルビン酸に対する無血清補充液のアリコートを解凍する。必要であれば、細菌汚染をコントロールするためにペンストレップのアリコートを解凍する。各成分を50 mLの遠心管にピペットで移す。ピペットチップが表面や物体に触れないように注意してくださいts。
      2. 生物学の中で、真空を止めたまま真空管にフィルターを接続します。混合物をフィルター上部に注ぎ、それを閉じます。 Biohoodの真空を入れ、培地のフィルターを容器の底に通します。真空を止める前にフィルターを真空から抜いてください。
      3. 滅菌培地容器の蓋を締めてラベルを貼り、未使用の培地を4℃で1ヶ月間保存します。培地を無菌状態に保つために生物学的な内部の容器を開ける。
    6. 表5に従って、DMEM +培地を調製する。
      1. 神経細胞培養およびアスコルビン酸（および必要であればペン - ストレプトン）のための無血清補充液のアリコットを解凍する。各成分を50 mLの遠心管にピペットで移す。残りのプロセスについては、手順1.2.5.2-1.2.5.3を繰り返します。

2.アレイ/皿の準備

注：この手順で使用されるMEAは、60チャネルのアレイです8×8の正方形で囲まれています。電極間距離は200μmであり、各電極の直径は10μmである。トラック用の導電材料はチタンであり、電極自体はTiNで作られている。電極周りのガラスリングは6mmの高さで、外径は24mmです。 MEAを覆うためにポリオキシメチレン（POM）から作られたキャップが使用され、記録および刺激セッション中の汚染を防ぐためにガス透過性/液体不透過性フッ素化エチレンプロピレン（FEP）フィルムが使用される。

  1. めっきする前日。
    1. 未使用のMEAをプラズマに曝すことによって親水性にする。これは通常、最初の使用後は必要ありません。対照培養に使用されるガラスカバースリップにもプラズマ処理が行われることを確認する。
      注：プラスチックペトリ皿（35mm）も対照皿として使用することができ、前処理を必要としません。
      1. プラズマエッチャーを使用してプラズマ処理を40〜60秒間、半減電力（50W）で実施する.wiチャンバ圧力は100〜150mTに設定される。
    2. すぐにDI水でMEAを満たしてください。 DI水で満たされたペトリ皿にカバーガラスを沈める。脱イオン水を処理された表面に約15分間接触させたままにしておきます。
    3. 生物学の中で、DI水を吸い出します。 70％エタノールでリムにMEAを満たす。カバースリップが入っているペトリ皿から脱イオン水を除去し、カバースリップが完全に沈むまでエタノールでペトリ皿を満たします。これを10〜15分間放置する。
    4. MEA ID番号、手術日、細胞の種類、頭文字を使用して、すべてのペトリ皿およびコントロール皿にラベルを付けます。次に、ラベルされたペトリ皿に各MEAを置きます。
    5. 個々のペトリ皿にMEAを置き、真空吸引を用いてエタノールを除去する。残留エタノールを除去するためにMEAを滅菌脱イオン水で満たす。真空吸引を使用して脱イオン水を除去してください。 MEAを生物学の中で空気乾燥させる。
    6. 50μg/ mLのポリ-D-リシン40-70μLを加える。e（PDL;高分子量、少なくとも50kDa）を各MEAの中心に、0.2mLを滅菌ピペットチップを用いて対照に移した。
      注：MEAの中心にピペットを触れないでください。先端が電極に損傷を与える可能性があります。分配されるPDLの正確な量は、表面の親水性に依存する。
    7. 各皿に実験用ティッシュペーパーの小さな断片を置き、一晩PDLの蒸発を避けるために滅菌水で湿らせます。すべての皿をカバーしてから、それらを生物学的な時代から取り除く。 37℃のインキュベーターに皿を一晩置きます。
  2. めっき日。
    1. プレーティング当日、ラミニン（20μg/ mL）の1アリコートを解凍する。各MEAは40〜50μLのラミニンを必要とし、各対照ディッシュは0.2mLのラミニンを必要とする。使用するMEAおよびコントロールの数に基づいて、必要とされるラミニンの量を計算する。
    2. インキュベーターからすべての料理を生物学的に移す。
    3. すべてのMEAを無菌で満たす脱イオン水に滅菌した血清学的ピペットを用いて10〜15分間放置する。滅菌パスツールピペットを使用して脱イオン水を吸引し、このプロセスを2回繰り返す。
    4. 滅菌ピペットチップを使用して、各MEAの中心部にラウミウムを40〜50μL加え、コントロールプレートにラミニンを0.2mL加える。 biohoodのすべてのMEAsとコントロールディッシュをカバーし、1時間37℃でインキュベーターにそれらを転送します。
      1. 滅菌パスツールピペットで吸引してMEAの中心から余分なラミニンを慎重に取り出し、プレーティング前に表面を空気乾燥させます。
    5. 皿を生命の中に残すか、細胞をプレートする準備が整うまでインキュベーターに入れます。
      注：皿は翌日までインキュベーターにとどまることができます。しかし、より多くの時間が必要な場合は、皿を洗浄し、ポリ-D-リジン（PDL）ステップ（ステップ2.1.6）からやり直すことをお勧めします。

3.胚の除去と脳抽出

  1. L-15（Leibovitz）培地を100mmペトリ皿のうち4本に注ぎます。それらを覆い、-20℃の冷凍庫に入れてください。培地は濁った粘稠度になりますが、凍結しないでください（約40〜60分）。
  2. 解剖の約40分から1時間前にこれを行う。
    注：これは、彼らがしっかりとした一貫性を持ち、抽出時に崩壊しないように、胚と脳を素早く冷やします。
  3. 胚の除去のために解剖領域を準備する。
    1. シンクの近くにトレイを置き、胚を取り除くために手術器具と材料を配置します。これらは冷たいL-15 "スラッシュ"、ペーパータオル、70％エタノールを含むスプレーボトル、鈍いノーズ親指鉗子、細かい鉗子、小さな外科用ハサミ、および大きなハサミ（ 図1 ）を備えた4つのペトリ皿を含む。
  4. 脳抽出のための解剖領域を準備する。
    1. ガラスペトリ皿を置く氷がいっぱい入っているトレーの中にいた。
    2. ペーパータオル、小さな外科用ハサミ、薄い両頭スパチュラ、70％エタノールで満たされたスプレーボトル、および屠殺のためのビニール袋（ 図2 ）を含む脳抽出のための外科用器具および材料を配置する。
  5. 実験室用コート、顔面マスク、手袋を着用する。手袋を含むすべての作業面に70％エタノールをスプレーします。
    注：これは滅菌手順ではありませんが、可能な限り汚染の可能性を減らすことが最善です。
  6. NIHのガイドライン16および/または実験動物の人間のケアと使用に関する公衆衛生サービス政策に従って、CO 2窒息のための施設で承認された動物介護および使用プロトコール（IACUC）の下で、E17期限切れ妊娠マウスを安楽死させる。パニックまたはディスコを引き起こさないように、CO 2ガスをチャンバー内に3〜5分かけてゆっくりと放出させてくださいマウスのmfort。
  7. マウスを断頭し、腹側を上にしてペーパータオルに置きます。下腹部に70％エタノールをスプレーする。小さな外​​科用はさみを使用して、下腹部の皮膚および皮下脂肪にV字型の切開を施し、切開部を胸腔の遠位端まで延ばし、子宮を露出させる。
  8. 鉗子を使用して、胚の間で子宮を注意深く持ち上げます。子宮全部が解放されるまで、解剖用はさみで結合組織を切り取る。簡単に、70％エタノールで子宮をすすいで血液を取り除き、冷たいL-15で満たされた4つのペトリ皿の1つに入れます。
  9. 1組の細かい鉗子を使用して子宮および内臓胚嚢から各胚を解放する。臍帯が切断され、胎盤嚢が取り除かれたことを確認する。冷たいL-15でいっぱいの2番目の皿に解放された胚を置きます。鉗子とハサミで胚を断頭します。鉗子を使用して、第3のペトリ皿に頭部を移し、体両方とも冷たいL-15でいっぱいです。

4.前頭皮質除去

  1. バイオファイルでは、オートクレーブした濾紙のくさびを冷たいペトリ皿のステージ上に置きます。濾紙上に1つの胚頭を置く。一対の鉗子を非支配的な手で眼球腔に挿入して頭蓋骨を握る。虹彩はさみで皮膚とその下の筋肉組織を取り除く。
  2. 虹彩はさみの下の薄い刃先を頭蓋骨の底に置きます。脳から離れた頭蓋骨の内面に対して下側の薄い部分を維持し、後頭部プレートを切断し、次いで頭頂プレートの中間線に沿って切断する。軟骨前面の頭蓋骨プレートの間を吻側で切断し続ける。
  3. 後頭部プレートの中心から始めて、中心カットの左と右に垂直にカットします。
  4. 注意深く腹側表面の間に小さなスパチュラをスライドさせて脳を除去するそれが脳の下に完全に来るまで、脳と下の頭蓋骨のプレートのスパチュラを持ち上げてください。脳全体がそのまま出てくるでしょう。
  5. 脳が紙にくっつかないように濾紙上にL-15培地を数滴滴下し、脳をへらから濾紙上に静かに腹側を下にしてスライドさせる。スパチュラの先端で嗅球を慎重に切断します。
  6. 清潔なへらを使用して、前頭葉を台形パターンで切開する。保存培地を含む15mLの遠心管に組織を移す。残りの胚で上記を繰り返します。毎回新鮮な濾紙を使用してください（ すなわち、 1頭につき1枚の濾紙を使用してください）。

5.細胞の解離

  1. バイオハザードでは、 表6に記載されている項目を組み立てます。
  2. 滅菌血清ピペットを使用して5mLのDMEM +をバイアルのパパインに加える。加温DMEM +を用いてパパインをよりよく溶解させることができる。やさしくピペットを用いて溶液を混合する。
  3. 滅菌マイクロピペットを使用して、DNaseのバイアルに0.5 mLのDMEM +を加えます。 DNアーゼ溶液は、DNアーゼが剪断変性に感受性があるため、強力なピペッティングを避けてください。
  4. 2.5 mLのパパイン溶液を滅菌遠心チューブに移し、125μLのDNaseを同じチューブに加えます。キャップ付き遠心チューブを約8回ゆっくりと反転させて、溶液を混合する。
  5. 滅菌されたワイドボアピペットを使用して、保存培地を含むチューブから組織を取り出し、滅菌した35mmペトリ皿に入れます。できるだけ少量の培地を採取する。滅菌ピペットを使用して、組織を除去せずにできるだけ多くの余分な記憶媒体を除去する。組織は培地に浮かべてはいけませんが、湿っているはずです。
  6. 2つの滅菌メス刃を使用して組織を切る。滅菌血清ピペットを使用して、DNase /パパイン混合物2.5 mLをペトリ皿の細かい組織に加えます。静かにペトリ皿を渦巻きにして帽子はすべての組織が溶液中で自由であり、皿の底に付着していない。皿をインキュベーター内に37℃で15分間置く。
  7. 生物学的には、滅菌された広範な移植ピペットを使用して、すべての培地および組織を無菌の5 mLの極低温チューブに移す。同じワイドボアの移送ピペットの先端をチューブの底に近づけます。ゆっくりとピペットで10-15回上下にゆっくりと粉砕します。
  8. ピペッティング中に泡を形成しないでください。均質な混合物が達成されるまで小口径移送ピペットを使用してプロセスを繰り返す。組織が解離していない場合は、1,000μLピペットを用いて粉砕します。
  9. 解離した細胞混合物に2mLの加温DMEM 5/5を加える。遠心分離機のチューブをまだ生物学的な状態にしておきます。静かに反転させる。室温（20〜25℃）で約573×gで5分間遠心分離する。
  10. 生物学的には、無菌の血清学的ピペットを用いて上清をすべて除去して廃棄し、ペレット。滅菌ピペットを使用して、チューブ内のペレットに加温DMEM 5/5を加え、細胞を再懸濁します。混合物が均質になるまで穏やかに上下にピペッティングすることによってペレットを破壊するために、滅菌された小口径の移送ピペットを使用する。
    注：ピペット操作中に泡が発生しないように注意してください。ごくわずかな組織が収集された場合は、0.5mLのDMEM 5/5のみを加えます。
  11. 生体内では、滅菌ピペットを使用して、10μLの細胞懸濁液をマイクロ遠心チューブに移す。 Biohoodの外側に、10μLのTrypan blueをマイクロ遠心チューブの細胞懸濁液10μLに加えます。
    注：この手順では無菌性は必要ありません。
  12. トリパンブルー細胞懸濁液10μLを使い捨て血球計チップに入れ、細胞を計数する。

6.細胞のプレーティング

  1. 生体内では、滅菌マイクロピペットを使用して、50μLの細胞懸濁液を各アレイおよび各コントロールペトリ皿の中央に移す。 πを1つ使うディッシュあたりのチップの先端。セルをアレイの中央に正確に配置してください。皿に入っていたラボティッシュペーパーを滅菌水で再湿らせるか、新しいティッシュペーパーを各皿に入れます。料理を覆う。
  2. カバーされたペトリ皿を37℃および10％CO 2に設定したインキュベーター内に3〜4時間置く。
  3. 生体内で、加温DMEM 5/5 1 mLを各MEAに静かに加える。
    注：培地を添加する際には、中央のアレイから細胞を洗い流さないようにしてください（重要！）。非常に慎重に、滅菌マイクロピペットを使用して内側のエッジの周りに一度に1滴を追加します。
  4. 各MEAにガス透過性FEP膜を含むキャップを配置する。インキュベーターに2日間戻してください。
    注：キャップは汚染や蒸発を防ぎます。 MEAに置く前に100％エタノールで生物学的にキャップを乾燥させて、無菌的な技術に従ってください。培養は生物学的な期間内に蓋をされなければならず、常に保護されたままでなければならない。

7.メイン文化を育てる

  1. 2日後、加温DMEM +で培地を完全に交換する。
    1. あまりにも長い時間培養を重視することを避けるために、インキュベーターから生物兵器まで数枚の皿を一度に移してください。
    2. 滅菌1 mLのマイクロピペットを使用して、ディッシュの内側の壁にピペットの先端を注意深く置くことにより、ディッシュからすべての培地を引き出し、中央の細胞に触れないようにします。 1つのディッシュにつき1つのピペットチップのみを使用して、コンタミネーションが広がらないようにしてください。
    3. 滅菌マイクロピペットを使用して1 mLの暖かいDMEM +を注ぎ、注意深くピペットの先端を皿の内壁に置きます。
  2. 上記のように、加温DMEM +で50％培地交換を週に2〜3回、授乳と授乳の間に4日以内に行う。
    1. 滅菌1 mLのマイクロピペットを使用して、ディッシュから培地500μLを取り出します。温かいDMEM +500μLを分注するために滅菌マイクロピペットを使用してください。<

視覚検査と記録

  1. 一日おきに顕微鏡で検体を検査して、アレイ上の細胞のカバレッジ（4倍および10倍の倍率を使用）およびコンタミネーション（20倍の倍率を使用）を細菌または真菌のいずれかで探す。
    注： 図3aは最適な細胞カバレッジの例を示し、 図3bは細胞密度の低い培養を示す。
  2. プレーティングの2週間後、自発的活性のMEA皿のサンプルを試験する。下記のように、MEAから3〜5分間記録する。活動が存在する場合、スパイクが検出されます（ 図4 ）。
    注：実験の種類と調査されている仮説に基づいて、いつ試験を開始するかを決定するのは実験者次第です。
    1. MEAで活動を記録するには、電源、アンプ、ヘッドステージ/プリアンプ、温度コントローラー、および刺激発生器（材料の表および図5を参照）。
    2. インキュベーターから培地を取り出す前に、温度コントローラーを差し込み、プリアンプの加熱されたベースプレートが35℃に達するように、電源をオンにして（メーカーの指示に従って）システムの電源を入れます。
    3. プリアンプにキャッピングした培養物を置き、MEAの黒い線が基準地面と揃うようにします。プリアンプのピンが並んでいること、プリアンプの上部が固定されていること、カルチャーキャップがまだオンになっていることを確認してください。
    4. カルチャーをプレートに入れたら、データ取得ソフトウェアの "Change MEA"オプションのチェックを外します（ソフトウェア名とユーザーガイドについては表の表を参照）。さらに、録音を行う前に、「ブランキング」と書かれたボックスのチェックを外してください。
    5. 「MEA_Select」で「ダウンロード」を選択してください彼は文化をシステムに入れています。続行する前に、プログラムが「ダウンロードOK」と表示されていることを確認してください。
    6. ソフトウェア環境で "Start"を押すと、信号の視覚化が開始されます。メインウィンドウで「Spikes」→「Detection」→「Automatic」を選択し、「Std Dev」の値を「5」に変更し、「refresh」をクリックしてしきい値をリセットします。
      注記：[スパイク]ウィンドウには、しきい値を超えたスパイクが表示されます。
    7. メインウィンドウで、「レコーダー」→「レコーダー」→「ブラウズ」を選択します。パスとファイル名を変更して、日付、時刻、料理、および実験を特定します。時間制限を設定します（ 例えば、 5分まで）。 「停止」、「録音」、「再生」をクリックします。録音は自動的に停止します。
    8. 刺激ソフトウェアを開きます。 「レコーダー」→「レコーダー」→「ブラウズ」を選択してファイルを作成し、時間を設定しますe限度。もう一度録画するには、「停止」、「録画」、「再生」をクリックします。刺激を皿に届けられるように（刺激ソフトウェア上の）「ダウンロードと開始」をクリックします。
    9. 料理を変更するには、ソフトウェアコントロールの[Change MEA]ボタンを選択します。
      注：インキュベーターから培地を一度に30分以上放置しないでください。系の周囲にCO 2雰囲気を維持するシステムはありません。長時間の録音セッションが必要な場合は、市販のアダプターを使用してCO 2を供給してください。

トレーニングネットワーク

注： 図6は、以下で説明するステップ9.1-9.3の概要を示しています。

  1. 細胞培養物からの自発的活性の5分間のベースラインを記録する（ステップ8に記載）。ベースラインが確立されたら、0.5Hz二相性からなる5分間の予備訓練プロービング刺激を投与する図8に示すように、選択された刺激電極を介して200μsのパルス持続時間および900mVのパルス振幅（ 図7a ）を有するパルス（刺激電極を選択する方法の詳細については、材料表のソフトウェアマニュアルを参照）。
  2. 訓練前の刺激が完了したら、プロービング刺激と同じ電極を用いてネットワークに「訓練」プロトコルを投与する。 Hamilton らに記載されているように、2秒ごとに1回、高周波列車を送達する。 15 （ 図7bおよび図7c ）。
    注：トレーニング信号は40個のパルス列で構成されています。各パルス列は、パルス間に4ms、パルス幅が200μs、パルス振幅が900mVの100個の2相パルスで構成されています。
  3. 訓練期間を終えた後、訓練後5分間の刺激刺激を細胞に投与し、訓練前の刺激と同一である。訓練後の刺激が終了したら、ネットワークから5分後の刺激後の自発的活動を記録する（ステップ8に記載）。
  4. 自然変動やシステムの非定常性によるネットワーク応答の可能性のある変化を説明するために、MEAの別個のコントロールグループを使用してください。対照群が実際の訓練信号が投与されない擬似訓練期間を受けることを除いて、これらの対照群に対して上述したのと同じ実験プロトコルを管理する。

10.データ分析

注：データファイルは保存され、独自のソーティングソフトウェア（マテリアルの表を参照）を使用して後でニューロンユニットにソートされます。カスタマイズされたグラフィカルユーザーインターフェイス（GUI）を使用して、ユニットをロードし、カルチャー、バースト間隔、バースト持続時間、およびPSTH後の活動パターンを分析します（表の表を参照）。 PSTHはビンサイズ（可変長）でネットワークの活動を表示し、提示された刺激に対するネットワークの応答の視覚的表現を提供するので、分析される最も重要なグラフ。

  1. 独自のソートソフトウェアを使用して.mcdデータファイルを.plx形式に変換します（ソフトウェア名とユーザーガイドについては、表の表を参照）。 .plxファイルを同じプログラム内の新しい.plxファイルにエクスポートします。チャネルをニューロンユニットにソートする（ 図9 ）。並べ替えが完了したら、データを.nexファイルとしてエクスポートします。
  2. 該当するソフトウェア（ Materials Tableを参照）で.nexファイルを開き、無料で入手できるカスタムメイドのGUIで分析する.matファイルとして保存します（ Materials Tablesを参照 ）。
    注：グラフィカルユーザインタフェース（マテリアルの表を参照）は、ユーザ入力（ すなわち、人口PSTH、バイアス平均PSTH、または個別チャネルPSTH）、刺激実験の概要と、刺激後のファイルと刺激前のファイルとの間の直接の比較を可能にする。また、ネットワーク応答を最初の6つの刺激と最後の6つの刺激と比較する、初期PSTH対最終PSTHをプロットします。 GUIは、刺激ファイルおよび自発的活動の両方のファイルについて、スパイク速度、インタースパイク間隔、バースト当たりスパイク、バースト間間隔、およびバースト持続時間などのいくつかの他の機能を実行する。
  3. まず、スパイク列を含む変数と刺激アーティファクトを含む変数を含む.matファイルを選択します。スクリプトがデータを分析し、メインGUIにPSTH平均グラフがポップアップします（ 図10 ）。
    1. アクティブな電極ボタンをクリックすると、平均PSTH（赤色）と比較して個々のPSTH（青色）が表示されます。
      注記：アクティブ電極はヒートマップを表示するために色付けされます。高い値（より赤色）が大きいピークPSTH値は、刺激に対してより強い応答を示した。
    2. ポップアップメニューを使用して解析オプションを選択します。 "Biased Average"ボタンを選択して電極のサブセットを選択し、そのサブセットの平均をプロットします。これは、カルチャ内のサブネットワークの動作を比較するのに便利です。
      注記：ポップアップメニューから複数の異なる分析オプションが選択されており、それらはすべてソフトウェアの「ヘルプ」ボタンで説明されています。
    3. 現在表示されているグラフを高解像度のjpegファイルとして保存するには、[Save Graph]ボタンを選択します。 「データテーブル」ボタンを選択して、データをスプレッドシートにエクスポートします。

結果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ここに示した手順（ 図11 ）を用いて、E17マウス神経細胞をプレートした60チャンネルMEAを、培養物が健常な細胞のカーペットで覆うまでインキュベートした（ 図12および図3a ） 。 10％CO 2および37℃での3週間のインキュベーションの後、培養物を市販の記録システム（ 材料表参照）を用いて自発的活性について検査した。温度はニューロンの活動および発火率に影響するので、温度コントローラーを用いた記録手順の間、温度を37℃に維持した。

アクティビティのテスト
自発的に活動的なネットワークは通常、変化する信号パターンを示す。平均的な活動的な文化は、約40％の電極を含む。これらの活性電極サイトのうち、ほぼ半数が自発的信号を記録し、発火率は5~10Hzの範囲である。自発的活性の代表的なラスタプロットを図4aに示す。目盛りは、20秒のウインドウ中のアクチブ電極9本、取得速度25kHz、300Hz〜3kHzのバンドパスフィルターで記録された活動電位のタイムスタンプを示します。 図4bは、ソーティング手順前の8バーストの活動中のベースラインノイズおよびろ過された未処理細胞外シグナルを示す。活動電位をノイズから分離するために、各チャネルの閾値はベースラインノイズの標準偏差の5倍に設定され、500msのウィンドウにわたって計算されます15 。

分析の前に、各電極の記録されたスパイクをオフラインでソートして、k-meansアルゴリズムと主成分分析を使用して、論理活動および刺激アーチファクトを分析する。生理学的応答として同定されたシグナルをグループ化して、各電極で集団応答を作成した（ 図13および図9 ） 15 。

電気刺激による神経ネットワークのトレーニング
ネットワークは、刺激発生器（材料の表参照）を用いてMEA電極を介して培養物に直接印加された電気刺激を用いて訓練された。代表的な結果のこのセットでは、他の多くの構成を適用することができるが、13の電極からなる「L」字形状が用いられた（ 図8 ）。プロービングおよびトレーニングの刺激は、Ruaro et al。 14 。

ベースラインは、刺激前に5分間の自発的活動を記録することによって最初に設定した。ベースラインが確立されたら、選択された刺激部位（ すなわち、 「L」）を介して、200μsのパルス持続時間および900mVのパルス振幅を有する0.5Hzの二相性パルスからなる5分間の予備トレーニングプロービング刺激（ 図7a ）形をした）。次いで、トレーニングプロトコルを、同じセットの電極を使用して2秒ごとにネットワークに投与した。トレーニング信号は、4つのインターパルス期間、200μsのパルス期間、および900mVのパルス振幅を有する、それぞれ100個の二相パルスを含む40個のパルス列から構成された（ 図7bおよび図7c ）。この訓練期間に続いて、訓練前の刺激と同様に、訓練後5分間のフェーズが続いた。プロトコルはその後だった刺激後の自発的活動の5分間の記録で結論付けられた。

同じ実験プロトコールを、ネットワーク応答の自然変動を説明するために、対照群の培養物に適用した。しかし、制御プロトコルの唯一の違いは、実際のトレーニング信号が管理されていない擬似訓練期間の適用であった。

データセットの統計解析（ すなわち、トレーニング対コントロール）は、被験者間因子として変数「トレーニング」を用いて、一方向ANOVAを用いて実施した。レイテンシは、被験者内因子として用いられた。有意な相互作用が見出された場合、Tukeyの事後手順が実施された。結果は、刺激の20ms以内にプレトレーニングの応答を示したが、活性の範囲は最初の反応の後に矛盾していた。しかし、訓練後の活動はar pre-training中に見られるように、刺激後最初の20ms内に応答したが、刺激後30-50msの有意な活性も示した（ 図14および図15 ） 15 。また、「スパイク頻度」対「刺激後の時間」および「スパイク信頼性」対「刺激後の時間」の統計的に有意な相関があった。 「スパイク信頼度」は、各刺激に対する応答に1の最大値が割り当てられた、刺激に対するネットワーク応答を見る確率として定義することができる。 図16は、スパイク頻度がほぼ50％増加したことを示し、30トレーニング後の20〜50 msの範囲で、訓練されたネットワークに対してスパイク信頼性が-50％増加します。これらの結果は、トレーニングがネットワークのダイナミクスを根本的に変えたことを示唆しています。

1 "class =" xfigimg "src =" / files / ftp_upload / 55726 / 55726fig1.jpg "/>
図1 ：胚除去に使用されるツールおよび材料。 （ A ）氷で満たされたトレイ。 （ B ）冷たいL-15「スラッシュ」で満たされたペトリ皿。 （ C ）ペーパータオル。 （ D ）70％エタノールを含むスプレーボトル。 （ E ）細かい鉗子（×2）。 （ F ）小型外科用ハサミ。 （ G ）鈍いノーズ親指鉗子。 （ ハ ）大きなはさみ。 （ I ）ボディバッグ。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。

figure-results-1
図2 ：脳抽出に使用されるツールおよび材料。 （ A B ）胚芽を含むペトリ皿。 （ C ）貯蔵媒体を含む箔で覆われた遠心チューブ。 （ D ）倒立したガラスペトリ皿。 （ E ）オートクレーブろ紙。 （ F ）エタノール70％のビーカー。 （ G ）プラスチックピペット。 （ H ）アイリスはさみ。 （ I ）細かい鉗子。 （ J ）薄い両端のへら。 （ K ）ペーパータオル。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。

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図3 ：最適培養と非最適培養 （ A ）は、（ B ）とは対照的に、アレイを覆う健康なカーペットの細胞を示す細胞増殖が不十分である。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。

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図4 ：自発的活動の代表的な結果。 （ A ）自発的活動の代表的なラスタプロット。目盛りは、取得速度25 kHzおよび3 kHz〜300 Hzの帯域通過フィルタ範囲で、20 sのウインドウ中に9個のアクティブ電極から記録された活動電位を示します。 （ B ）活性部位からの代表的なろ過された細胞外作用電位。参考文献15から変更された図 。 より大きなバージョンを表示するにはここをクリックしてくださいこの図のn。

figure-results-4
図5 ：録画セットアップ。 （ A ）刺激発生器。 （ B ）温度コントローラ。 （ C ）電源。 （ D ）増幅器。 （ E ）ヘッドステージ/プリアンプ。 （ F ）キャップされたMEA。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。

figure-results-5
図6 ：電気トレーニングプロトコルの概略 図初期ベースラインを5分間、プローブ刺激を3分間記録する。テタニック刺激を適用する 90秒間オンになりますが、これは記録されません。 2分間プローブ刺激を3分間、最後のベースラインを5分間適用して記録する。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。

figure-results-6
図7 ：刺激およびトレーニング信号のパラメータのプロービング （ A ）プロービング刺激は、0.5Hzの周波数で投与された±900mVのバイフェーズパルスからなる。 （ B ）パルス列は250Hzの周波数で100、±900mVの二相パルスからなる。 （ C ）トレーニング信号は、2秒ごとに40パルス・トレインで構成されています。参考文献15から変更された図 。"_blank">この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。

figure-results-7
図8 ： "L"字型構成の表現。四角は、MEAからの個々の電極を表す。青い四角は刺激のために使用される電極を示し、他のすべては記録のために使用される。参考文献15から変更された図 。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。

figure-results-8
図9 ：ノイズと刺激アーティファクトからユニットを区別する。いくつかの上部パネル（ A〜 D ）ここでは、黄色の波形のみが検出されます。 （ E ）緑色の波形のみがユニットです。 （ F ）刺激飽和のためにユニットが合理的に検出されない、刺激にも使用された電極から記録されたチャネルの例。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。

figure-results-9
図10 ：刺激後時間ヒストグラム（PSTH）。グラフィカルユーザインタフェース（ マテリアルテーブル参照）は、ユーザ入力（ すなわち、母集団PSTH、偏り平均PSTH、または個体）に従ってPSTHをプロットします刺激実験の概要と、刺激後のファイルと刺激前のファイルとの間の即時比較を可能にする。また、初期PSTHと最終PSTHをプロットします。これは、ネットワーク応答を最初の6つの刺激と最後の6つの刺激と比較する。 GUIは、刺激ファイルおよび自発的活動の両方のファイルについて、スパイク速度、インタースパイク間隔、バースト当たりスパイク、バースト間間隔、およびバースト持続時間などのいくつかの他の機能を実行する。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。

figure-results-10
図11 ：細胞の準備とプレーティングの概要。 （ A ）E17妊娠マウスをCO 2で安楽死させる。 （ B ）マウスはデパピタイトです子宮が除去される。 （ C ）胚は解放され、断頭される。 （ D ）各胚から脳を抽出し、前頭葉を除去する。 （ E ）細胞が解離する。 （ F ）解離した細胞を培地に懸濁する。 （ G ）懸濁した細胞を60チャンネル多電極アレイ（MEA）に播種する。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。

figure-results-11
図12 ：微小電極アレイ上にプレートされた神経細胞培養物。胚性マウスニューロンは、各電極からネットワークを横切って神経活動を同時に記録することを可能にする60チャネルMEA上に播種される。 （修正された図参考文献15から ）。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。

figure-results-12
図13 ：各チャネルの波形をソートするためのプログラムのソートソートプログラム（ Materials Tableを参照）は、データファイルをロードし、各チャンネルに対して最初に取得されたすべてのユニットを表示します。特定のユニットに信号を割り当てるためにいくつかの方法の1つが選択されます。この例では、k-meansクラスタリングアルゴリズムが選択され、黄色のユニット（下のウィンドウの「ユニットa」とラベル付けされている）が識別されました。別のプログラム（ Materials Tableを参照）を使用して.nexファイルを.matファイルにエクスポートします。このファイルは、カスタムメイドのGUIの入力ファイルです ong>材料表および図10を参照）。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。

figure-results-13
図14 ：訓練期間後の刺激に対するネットワーク活動の変化。 8電極からの活動の代表ラスタプロット。垂直の赤線は刺激の時間を示し、黒の目盛りは活動電位を示す。事前訓練（ A ）では、チャネルを横切る刺激パルスに即座に応答する。訓練後（ B ）において、ネットワークは、刺激に対する即時応答と同様に、より長期の活動応答を示す。.jove.com / files / ftp_upload / 55726 / 55726fig14large.jpg "target =" _ blank ">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

figure-results-14
図15 ：訓練されたネットワークは、スパイク周波数を大幅に変更しました。制御ネットワークのためのネットワークスパイクの頻度は、各刺激の直後に50ms以上のスパイクの数を積分し、その期間で除算することによって計算される。示されたのは、訓練された12のネットワークと10の制御ネットワークの平均である（誤差バーは平均の標準誤差を示す）。アスタリスク（*）は、2つのデータセット間の統計的差異（ p値 <0.05）を示す。参考文献15から変更された図 。 larを見るにはここをクリックしてくださいこの図のゲールバージョン。

figure-results-15
図16 ：シナプスが仲介する応答は、訓練されたネットワークで大幅に変更されています。 （ A ）スパイク信頼性は、10ミリ秒のビンで測定され、制御ネットワークに標準化されて、電極付近のニューロンの直接活性化（0〜20ミリ秒）について変化を示さない。したがって、これらのビンのコントロールと訓練されたネットワークの間に統計的な違いはありません。一方、長い待ち時間の応答（30〜50ms）はシナプス的に媒介され、この方法が上記の図15よりも信頼性の詳細な調査を提供することを示している。 （ B ）母集団スパイク頻度は信頼性の挙動を反復し、直接活性化（0〜20ms）の変更を示さず、一方、統計長期的な反応（30〜50ms）については、理論的に有意な差が見られる。この動作は、前の図15の平均結果と一致しています。誤差バーは、平均値の標準誤差であり、10の制御ネットワークと12の訓練されたネットワークで計算されます。 （*） p値 <0.05; （**） p値 <0.001。参考文献15から変更された図 。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。

数量 項目
1 オートクレーブしたガラス試薬ボトル（少なくとも100 mLのサイズ）
20 15mLの滅菌遠心チューブ
1 10mL滅菌血清ピペット
4 25mLの滅菌e血清学的ピペット
2 50mL無菌血清ピペット
1 遠心チューブラック
150 mL 滅菌DI水
5 mg ポリ-D-リシンバイアル

表1： PDL調製 - 材料および試薬のリスト。

数量 項目
1 50mLの滅菌遠心チューブ
10 15mLの滅菌遠心チューブ
2 1mL無菌血清ピペット
2 50mL無菌血清ピペット
1 遠心チューブラック
1 mL リン酸塩緩衝食塩水（PBS）
1 mg ラミニン

表2： ラミニン調製 - 材料および試薬のリスト。

数量 項目
1 オートクレーブしたガラス試薬ボトル（少なくとも100 mLのサイズ）
20 15mLの滅菌遠心チューブ
1 10mL滅菌血清ピペット
4 25mL無菌血清ピペット
2 50mL無菌血清ピペット
1 遠心チューブラック
150 mL 滅菌DI水
5 mg ポリ-D-リシンバイアル

表3： 貯蔵媒体の調製 - 材料および試薬のリスト。

数量 項目
44mL 安定化された形態のL-グルタミンを有するDMEM（材料の表参照）
1 mL 神経細胞培養のための血清を含まないサプリメント（材料表を参照）
2.5mL ウマ血清
100μL アスコルビン酸[4mg / mL]
2.5mL ウシ胎児血清（FBS）
0.5mL ペンストレップ（オプション）
1 50mLの滅菌遠心チューブ
2 25mL無菌血清ピペット
2 10mL無菌血清ピペット
2 1mL無菌血清ピペット
1 フィルター250 mL

表4： DMEM 5/5培地の調製 - 材料および試薬のリスト

数量 項目
49 mL 安定化された形態のL-グルタミンを有するDMEM（材料の表参照）
1 mL 神経細胞培養のための血清を含まないサプリメント（材料表を参照）
100μL アスコルビン酸[4mg / mL]
0.5mL ペンストレップ（オプション）
1 50mLの滅菌遠心チューブ
2 25mL無菌血清ピペット
2 1mL無菌血清ピペット
1 フィルター250 mL

表5： DMEM +培地の調製 - 材料および試薬のリスト。

数量 項目
1 パパイン140U /バイアル
1 1,260 U /バイアル
7 mL DMEM +（冷却）
5 mL DMEM 5/5（加温）
10μL トリパンブルー
2 メスの刃
1 35mm無菌ペトリ皿
4 15mLの滅菌遠心チューブ
2 5mLの滅菌低温管
2 2mLの滅菌低温チューブ
1 50mLの滅菌遠心チューブ
1 マイクロ遠心チューブ
2 大口径移送ピペット
3 小口径移送ピペット
5 2mL無菌血清ピペット
5 1mL無菌血清ピペット
2 10μL滅菌マイクロピペットチップ
1 1000μL滅菌マイクロピペットチップ
1 血球計数チップ

表6： 細胞の解離 - 材料および試薬のリスト。

ディスカッション

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

このプロトコールで概説されている手順は、初心者がMEA上で自身のニューロン培養物をプレートし、ネットワーク活動を記録するのに十分な詳細を提供する。このプロトコールは、培養物が適切に付着し、電極アレイ上に細胞のカーペット層を形成し、数ヶ月間健康で汚染物質を含まないことを確実にするのに役立つ。

プロトコルのすべての部分を順守することが最善の方法ですが、成果を上げるために重要なプロセスがあります。培養が汚染されるのを防ぐためには、プロセス全体を通して無菌技術を使用することが不可欠です。プロトコールに記載されているように、新しいMEAを親水性にしなければならない。そうでなければ、細胞接着不良が生じる。厳しいピペッティングおよび解離中の気泡の形成を回避することにより、損傷した細胞がプレーティングされる回数を減少させ、より高く、より健康的な収量をもたらす。最初の後にDMEM 5/5からDMEM +に切り替える摂食も重要です。 DMEM 5/5にはウマ血清が含まれており、連続的に使用するとグリア細胞が培養上支配的になり、培養が正常に見えるものの、ニューロン活性が低下します17 。スケジュールどおりに培養物に給餌し、適切なインキュベーション条件に保つこともまた重要である。

MEA上の細胞培養物をプレーティングすることは、最適ではない結果をもたらす可能性がある多くの変数を伴う。目標は細胞の完全な「カーペット」であるが、上記の重要なステップに対処できなければ、細胞の成熟が悪くなったり、汚染されたりする。乏しい細胞の成熟とは異なる貧弱な細胞接着もまた懸念される。これは、メッキ前の貧弱なMEA調製または古い培地の使用を含むいくつかの要因によって引き起こされる可能性がある。神経細胞培養のための安定化形態のL-グルタミンおよび無血清補充物を含有する古い培地（ 材料 表）が使用されると、細胞は最初に接着するが、約2週間後に浮遊する。細菌汚染が持続的な問題である場合、アンピシリンまたはペン - ストレプトンなどの抗生物質を培地に添加することができる。真菌汚染を処理するために利用できる殺菌剤もある。これらは、文化の成果に影響する可能性があるより一般的な変数のいくつかです。時間と経験の後にのみ遭遇する多くのものがあります。

ガラス微小電極の使用と比較して、この技術はネットワークのダイナミクスおよび薬理学的応答を研究するのに優れている。これは、多くの異なる時空間刺激パターンの使用を可能にし、同時に複数の領域からの神経応答の記録を可能にする。以前のグループは、ここで説明したものと同様のプロトコルを使用して興味深い結果を示しています18 。培養は数週間または数ヶ月続き、同じ培養物を再使用することができるので、この技術もまた同じネットワーク上で時間の経過とともに複数の実験が繰り返されます。

しかし、この手法には限界があります。 MEAは非侵襲性である。したがって、パッチクランプまたはピペットによる細胞内記録とは対照的に、細胞外活性のみを記録することができる。さらに、アレイ中の各電極はいくつかの細胞によって覆われているので、単一のニューロンの活性を分解することは不可能である。逆に、これらはインビトロ培養であるため、脳内のネットワークの構造的特性を完全に再現することはできません。また、細胞がそれらのpHバランスを維持するためのCO 2雰囲気を提供する機構がなければ、活性は一度に30分未満しか記録できない。

この技術が習得されると、電気刺激を伴うまたは伴わない薬理学的操作が探究され得る。ニューロンネットワークにおける学習および記憶形成を突き止めるための新しいプロトコルもまた、p海馬または脊髄ネットワークのためのプロトコル。ネットワークの刺激および訓練のためのプロトコルは以前に公開されており、これらのうちのいくつかは、Eytan らによって提案された「選択的適応」などのインビボプロトコルにさらに発展した 。 19 。いくつかのプロトコルがテストされました。しかし、2005年にRuaroによって提案された破傷風手技の修正の結果のみがここに提示される14,20。

開示事項

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

著者は何も開示することはない。

謝辞

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

この研究は、国立科学財団グラントCMMI-1300007によって資金提供されました。ジョセフ・メイソン大学でジョセフ・J・パンクラジオ博士、ハミド・チャルカカル博士、グレッチェン・クナック博士（Dr. Gretchen Knaack）博士の5年間にわたり、これらのプロトコールの設計と5年以上の文化の維持に協力してきた先の研究員に感謝したい。 、フランツ・ハミルトン博士、マイケル・マケラ、ロバート・グラハム。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
アスコルビン酸シグマ アルドリッチA44034 mg/mL アリコート
B-27Invitrogen17504-044神経細胞培養用の無血清サプリメントを製造。1 mLのアリコートを作り、凍結
ビーカー - ガラス - 100 mLVWR13912-160
ビーカー - ガラス - 500 mLVWR10754-956
鈍い先端の親指鉗子World Precision Instruments500365-G
極低温バイアル - 滅菌、2 mLフィッシャー・サイエンティフィック10-500-26
極低温バイアル - 無菌、5 mLフィッシャー・サイエンティフィック10-500-27
DMEM with GlutamaxGibco Life Technology10569-010L-グルタミンDNaseの安定化型を含む細胞培養培地
Worthington BiochemicalLK003172
EthanolFisher Scientific04-355-451
ウシ胎児血清(FBS)ATCC30-2030
先端の細い親指鉗子World Precision Instruments501324-G
Glass PipetsVWR14673-010
GlutaMAX -- I (100X)Gibco Life Technology35050-061A stabilized form of L-glutamine used as a suplement
Hemocytometer chipFisher Scientific22-600-101
Hibernate EB completeBrainBitsD00118Ambient CO2細胞記憶培
地 馬血清アトランタバイオロジカルズS12195H
ラミニンシグマ アルドリッチL2020-1MG
MCSフィルターアンプマルチチャンネルシステムFA60SBC
MCSヘッドステージ/プリアンプマルチチャンネルシステムMEA1060-INV
MCS微小電極アレイマルチチャンネルシステム60MEA200/10iR-ITO
MCS電源マルチチャンネルシステムPS20W
MCS信号分周器マルチチャンネルシステムSDMEA
MCS刺激発生器マルチチャンネルシステムSTG4002
MCS温度コントローラーマルチチャンネルシステムTC02
メディア収納ボトル - ガラス 500mLVWR10754-818オートクレーブ
マイクロ遠心チューブ - 0.4 mLサーモフィッシャー3485オートクレーブ
マイクロ遠心チューブ - 2 mLサーモフィッシャー3434ECONOオートクレーブ
マイクロピペットチップ - 10 μLVWR37001-166オートクレーブ
マイクロピペットチップ - 1,000 μL VWR13503-464オートクレーブ
マイクロピペットチップ - 200 μL VWR37001-596オートクレーブ
マイクロピペッター - 10 μL サーモフィッシャー4641170N
マイクロピペッター - 1,000 μL サーモフィッシャー4641210N
マイクロピペッター - 200 μL サーモフィッシャー4641230N
パパイン-0.22フィルターワージントン生化学LK003178
ペニシリン-ストレプトマイシン(ペン連鎖球菌)サーモフィッシャー15070063
ペトリ皿-100 mm使い捨てフィッシャーサイエンティフィック08-757-100D
ペトリ皿-100 mmガラスVWR10754-788
トリ皿-35 mm Fisher Scientific08-757-100A
リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) (1x)Corning21-040-CV
Plasma Cleaning SystemPlasma Etch, Inc.PE-50
ポリ-D-リジン臭化水素酸塩 (PDL)シグマ アルドリッチP6407-5MG
ポリエチレンコニカル (遠心分離) チューブ -15 mLフィッシャー サイエンティフィック05-527-90
ポリプロピレン コニカル (遠心分離) チューブ -50 mLファルコン352070
プロシージャ マスクImco1530-IMC
ピルビン酸シグマ アルドリッチP4562-5G
刃ワールド・プレシジョン・インスツルメンツ 500237-G
はさみ - 虹彩ワールド精密機器14111-G
はさみ - 大型世界精密機器14214
はさみ - 小型外科用ワールド精密機器 501733-G
血清学ピペット - 滅菌済み、1 mL VWR89130-892
血清学ピペット-滅菌、2 mL VWR89130-894
血清学ピペット - 滅菌済み、25 mL VWR89130-900
血清学ピペット-滅菌、50 mL VWR89130-902
:Matlab GUIPeixoto Labnpeixoto@gmu.edu.matファイルの分析に使用されます。 ご要望に応じて無料でご利用いただけます。 npeixoto@gmu.edu に連絡してコピーをリクエストしてください。
ソフトウェア:MCS MC_RackMultiChannel SystemN/Aデータ収集に使用
ソフトウェア:NeuroExplorerPlexon http://www.plexon.com/products/neuroexplorer.nexファイルを.matに変換するために使用されます
ソフトウェア:オフラインソーターPlexon http://www.plexon.com/products/offline-sorterニューラルスパイクをソートし、データファイルを.plxに変換し、次に.nexに変換するために使用されます
ソフトウェアマニュアル:MCS MC_RackMultiChannel Systemhttps://www.multichannelsystems.com/sites/multichannelsystems.com/files/documents/manuals/MC_Rack_Manual.pdf
ソフトウェアマニュアル:NeuroExplorerPlexon https://www.neuroexplorer.com/downloads/Nex3Manual.pdf
ソフトウェアマニュアル:オフラインソータープレクソン www.plexon.com/system/files/downloads/Offline%20Sorter%20v2.8%20Manual.pdf
スパチュラ - 小型ダブルエンドのワールド精密機器 503440
ステリカップ 0.22 & マイクロ;m孔フィルター - 250 mLMilliporeSCGVU02RE
Transfer pipette - 大口径 サーモフィッシャー335-1S
トランスファーピペット - 小口径 サーモフィッシャー242-1S
トリパンブルーシグマ アルドリッチT8154-20ML
Whatman 濾紙Whatman 1442 150ガラスのペトリ皿で 8 つのパイのくさびとオートクレーブにカット
する ペメスソフトウェア

参考文献

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