分離の心室心筋の筋小胞体カルシウム拡張予備能と細胞内のカルシウム除去の評価

サマリー

細胞内カルシウム リサイクル心筋収縮および拡張機能の調節に重要な役割を果たしています。ここでは、カルシウム イメージング システムにより筋小胞体 Ca^{2 +}リザーブと心筋拡張期のカルシウム除去機能を評価するためのプロトコルについて述べる。

要約

細胞内カルシウム リサイクル心筋収縮および拡張機能の調節に重要な役割を果たしています。心筋の筋小胞体 (SR) は、reuptakes 細胞内 Ca^{2 +}安静時の収縮の Ca^{2 +}貯水池として機能します。ビートを利用できる SR Ca^{2 +}予備は心筋収縮性の予測、細胞内 Ca^{2 +}の除去は、心臓の拡張機能のために重大。糖尿病、心不全など、いくつかの病態生理学的条件下で障害カルシウム クリアランスと心筋細胞の Ca^{2 +}ストアは、心機能低下の進行状況に関与する可能性があります。ここでは、方式^{2 +}リザーブと拡張期の Ca^{2 +}除去を評価するプロトコルについて述べる。簡単に言えば、単一心筋細胞が酵素によって分離され、フラ 2 で示された細胞内の Ca^{2 +}蛍光カルシウム イメージング システムによって記録されました。合計 SR Ca^{2 +}放出を誘発するためにカフェインを採用するには、連動した刺激システムと灌流システムによって自動灌流スイッチ プログラムをプリセットします。その後、モノラル指数曲線のあてはめカルシウム濃度のカフェイン誘発性カルシウム パルス減衰時定数を分析に用いる。したがって、SR の Ca^{2 +}の貢献-ATPase (SERCA) と Na⁺-Ca^{2 +}交換 (NCX) 拡張期のカルシウムの除去を行った。

概要

細胞内カルシウム ([Ca^{2 +}]_私) リサイクル¹心筋細胞の収縮および拡張機能の調節に重要な役割を果たしています。ご存知のように、カルシウム誘発性 Ca^{2 +}放出は収縮する電気信号に変換するカップリング、興奮収縮を開始します。膜の脱分極は、細胞膜の L 型 Ca^{2 +}チャネル、Ca^{2 +}を引き起こすはリアノジン受容体 2 (RyR2) を介した細胞質に SR からの解放をアクティブにします。一時的な上昇細胞質 Ca^{2 +}筋原線維の収縮を開始します。期には, 細胞質 Ca^{2 +}は SR Ca^{2 +}による SR に reuptaken-atp アーゼ 2 (SERCA2) と、Na⁺-Ca^{2 +}交換 (NCX)²を介して心筋のポンプ。このプロセスはリサイクル、心筋収縮緩和に します。

心臓の SR は収縮機械を囲む細胞内膜ネットワークです。それは収縮の Ca^{2 +}貯水池として機能、それがリラクゼーションの中に細胞内 Ca^{2 +} reabsorbs。ビートを利用できる SR Ca^{2 +}予備は心収縮力の確定....

プロトコル

機関動物のケアと使用実験研究センター、中国医学科学の中国アカデミー、浙江大学委員会によって承認されたプロトコルに従ってすべての動物実験を行なった

。

1 ソリューション準備

1. 表 1 で説明したようにすべてのソリューションを準備します。

。

2 分離の左心室 (LV) 心筋

注: 左心室心筋細胞は酵素によって前述 ⁷ Langendroff 灌流システムを使用して分離、^{、。 8 , 9 , , 10 11}.

1. Langendroff 灌流システムのセットアップ。通常 Tyrode (NT) ソリューションで灌流システムを埋める、36.5 ° C の温度設定、チューブに空気の泡を排除します
。
2. は、重さし、抱水クロラール (400 mg/kg) の腹腔内注入 (ip) による Sprague-dawley ラットの麻酔。5 分後尻尾や....

結果

ストレプトゾトシン (STZ) - 誘発糖尿病ラット (DM) と年齢をマッチさせたスプレイグ - を示すここで、ドーリー (SD) ラットの例。8 週齢雄 SD ラット (200 ± 20 g) は、管理グループのための DM グループまたはクエン酸バッファーの STZ (70 mg/kg, ip) の単一腹腔内注射を受けた。STZ 投与後 1 週間ラット血糖値と > 16.7 ミリ モル/L が糖尿病と考えられていた。8 週間後左心室心筋細胞は酵素によって分離されました。カルシウム再導入後の生存状態のまま細胞の約 70-80% があります。ロッド形、明確な縞および安定した収縮の唯一の細胞は (図 1 b) を記録するために選ばれました。図 1 aのように、我々 は商工会議所の血流と細胞の針灌流を設定します。プリセット ・ プログラムされた自動的に灌流バルブとペーシング システムを切り替える図 2 a<.......

ディスカッション

SR からリリースされたカルシウム変化は心臓の収縮の Ca^{2 +}の主要な源です。程度、SR Ca^{2 +}コンテンツの振幅および小数部の Ca^{2 +} SR からリリース心筋収縮のため利用できる SR Ca^{2 +}予備を反映します。その一方で、SR の Ca^{2 +}予備は拡張期^12,13,14の間に SR で SR Ca^{2 +}再取り込み、Ca^{2 +} SR のリークとそのバランスの能力に依存します。私たちの実験では 10 mM カフェインの急速なアプリケーションは総 Ca^{2 +}リリースおよび RyR チャネルを開いて、SR 内の Ca^{2 +}再取り込みを防ぐを誘導するために目指しています。このように、カフェイン誘発性 Ca^{2 +}パルスの振幅は、SR .......

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
NaCl	アルファ Aesar	012314
MgCl2	アルファ アエサル	012315
KCl	アルファ アエサル	11595
HEPEs	シグマ	H3375
D-グルコース	アルファ アエサル	A16828
NaOH	アルファ アエサル	A18395
KOH	アルファ アエサル	A18854
KH2PO4	Alfa Aesar	011594
MgSO4	Alfa Aesar	3337
L-Glutamic	Alfa Aesar	A15031
Taurine	Alfa Aesar	A12403
EGTA	Sigma	E3889
Collagenase A	Roche	10103586001
Collagenase Type II	ワージントン	LS004177
	BSA ロシュ	735094
カフェイン	Sigma	C0750
Fura-2 AM	Invitrogen	F1201
顕微鏡	オリンパス	IX 71
ランゲンドルフシステム	Beijing Syutime Technology Co	PlexiThermo-S-LANGC
マイクロマニピュレーター	マーシャウ	ザーMM33リンク
灌流チャンバー	IonOptix	FHD
バルブ 制御重力灌流システム	ALA	VC 3-8
バルブコマンダーソフトウェア	ALA	VC 3 1.0.1.2
精密流量調整器	Delta Med	3204315
マルチバレルマニホールド 灌流ペンシル	AutoMate Scientific	04-08-[360]
ミクロンの取り外し可能な先端	AutoMate Scientific	360um i.d.
蛍光測定および細胞寸法測定システム	IonOptix	Hyperswitch
記録ソフトウェア	IonOptix	IonWizard 6.2.59
刺激装置	IonOptix	MyoPacer EP
Sprague-dawley ラット	Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co.	SCXK 2016-01-007436