方法論記事

双方向レトロウイルスの統合サイトPCRの方法論と定量的データ解析ワークフロー

DOI：

10.3791/55812

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2017年6月14日

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1UCLA AIDS Institute, University of California at Los Angeles (UCLA), 2Department of Microbiology, Immunology, & Molecular Genetics, University of California at Los Angeles (UCLA), 3Departments of Biomathematics and Mathematics, University of California at Los Angeles (UCLA), 4Personalized Genomic Medicine Research Center, Division of Strategic Research Groups, Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology, 5Department of Medicine, University of California at Los Angeles (UCLA), 6Department of Veterinary Biosciences, College of Veterinary Medicine, The Ohio State University (OSU)

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

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この原稿では、上流および下流のベクター - 宿主接合DNAを同時に解析できる双方向インテグレーションサイトアッセイの実験手順とソフトウェア解析について説明します。双方向PCR産物は、任意の下流の配列決定プラットフォームに使用することができる。得られたデータは、統合されたDNA標的の高スループット、定量的比較に有用である。

要約

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統合サイト（IS）アッセイは、レトロウイルスの組込み部位およびその生物学的意義の研究の重要な要素である。最近のレトロウイルス遺伝子治療研究において、ISアッセイは、次世代シークエンシングと組み合わせて、同じISを共有するクローン幹細胞集団を特徴付ける細胞追跡ツールとして用いられてきた。異なるサンプル内およびその間の再増殖幹細胞クローンの正確な比較のために、アッセイの検出感度、データ再現性およびハイスループット能力は、最も重要なアッセイ特性の1つである。この作業は、双方向IS解析のための詳細なプロトコルとデータ解析のワークフローを提供します。双方向アッセイは、上流および下流の両方のベクター - 宿主接合部を同時に配列決定することができる。従来の単方向ISシークエンス手法と比較して、双方向アプローチはIS検出速度を大幅に改善し、tの両端での統合事象の特徴付けを大幅に改善する彼はDNAを標的にする。ここに記載されているデータ解析パイプラインは、IS配列を参照ゲノム上にマッピングし、シークエンシングエラーを決定する複数の比較ステップを経て、同一のIS配列を正確に同定および列挙する。最適化されたアッセイ手順を使用して、近年、アカゲザルでの移植後に何千もの造血幹細胞（HSC）クローンの詳細な再増殖パターンを発表し、HSC再増殖の正確な時点およびHSCの機能的異種性を初めて示した。霊長類システム。以下のプロトコルは、同一のIS配列を正確に同定および定量する、段階的な実験手順およびデータ解析ワークフローを説明しています。

概要

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レトロウイルスは、そのゲノムDNAを様々な部位の宿主ゲノムに挿入する。癌やその他のウイルス性病因の発生に寄与するこのユニークな特性は、これらのウイルスを遺伝子治療や基礎生物学研究のための細胞工学に非常に適したものにするという皮肉な利点があります。外来DNA（ウイルス）が組み込まれている宿主ゲノム上の場所であるウイルス統合サイト（IS）は、統合ウイルスと宿主細胞の両方の運命に重要な意味を持っています。 ISアッセイは、レトロウイルスの組込み部位の選択と病因、癌の発生、幹細胞の生物学、および発達生物学1,2,3,4を研究するために、様々な生物学的および臨床的研究環境で使用されてきた。低い検出感度、低いデータ再現性、頻繁な相互汚染は現在のおよび計画された研究へのISアッセイの適用を制限する重要な要因である。

多くのIS分析技術が開発されている。リンカー媒介（LM）ポリメラーゼ連鎖反応（PCR） 5 、逆PCR6、および線状増幅媒介（LAM）PCR7を含む制限酵素に基づく組込み部位アッセイが最も広く使用されている。しかしながら、部位特異的制限酵素の使用は、ISの回収中にバイアスを生成し、回収される制限部位の近傍の組込み体（宿主ゲノムに組み込まれた外来DNA）のサブセットのみを可能にする4 。近年、ベクターISをより包括的に評価するアッセイ技術....

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プロトコル

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1.上流（左）および下流（右）接合配列ライブラリーの作製

  1. DNAリンカー調製：
    1. 100μMLINKER_Aオリゴ（最終：20μM）2μL、100μMLINKER_Bオリゴ（最終：20μM）2μL、5M NaCl（最終：1M）2μLを加えて10μLのリンカーDNA溶液を調製する。 PCRチューブ中に4μLのヌクレアーゼフリー水。リンカー配列については、 表1を参照してください。
    2. リンカーDNA溶液をPCR装置で95℃で5分間インキュベートし、実行プログラムを停止し、PCR装置の電源をオフにします。リンカー溶液を30分間機器に放置し、リンカーDNAをゆっくりと冷却します。リンカーDNA溶液は4℃で保存することができます。
  2. LTR特異的ビオチン - プライマー伸長：
    1. UV-Vis分光光度計を使用して、 インビボからのゲノムDNAのDNA濃度および260 / 280nm値を決定する。またはインビトロ実験を含む。 1〜2μgのサンプルゲノムDNAをヌクレアーゼフリーの水を使用してゲノムDNA溶液の最終容量170μLに希釈する。
    2. 10μMのHIV-1特異的ビオチンプライマー（ 表1の L-BPおよびR-BP：4つのレンチウイルス特異的プライ....

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結果

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双方向ISアッセイは、上流（左）および下流（右）ベクター宿主接合部（ 図2 ）の両方について、異なるサイズのPCRアンプリコンを生成した。 PCRアンプリコンのサイズは、インテグロムの上流および下流の最も近いGTACモチーフの位置に依存する。このアッセイはまた、内部DNA PCRアンプリコンを産生した：ポリプリン管の近くのレトロウイルス配列およびプライマー結合部位は、それぞれ、左および右接合PCRの間に同時に増幅された。 PCRアンプリコンバンドは、キャピラリー電気泳動またはアガロース（2％）電気泳動によって視覚化することができます。

配列決定の後、左および右ジャンクション配列の両方を、生の配列（逆多重化およびトリミングベクターおよびリンカーDNAを含む）の前処理、IS配列のゲノムへのマッピング、同一のISの同定および計数のための社内プログラミングスクリプトシーケンス、および誤り訂正手順の適用.......

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ディスカッション

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双方向アッセイは、上流（左）および下流（右）の両方のベクター - 宿主DNA接合配列の同時分析を可能にし、遺伝子治療、幹細胞および癌研究の多くの用途において有用である。 GTACモチーフ酵素（RsaIおよびCviQI）および双方向PCR法を用いることにより、以前のTCGAモチーフ酵素（ TaqαI ）に基づくアッセイ2,15および他のものと比較して、インテグラム（またはクローン集団）を検出する機会が有意に改善される一方向性LM-PCRは5に近づく。双方向アッセイは、特に臨床または小動物モデル研究でしばしば生じる限られたDNAサンプルにおいて、ISの分析を改善する。

ステップ1.1-1.7は重要なステップであり、不要な遅延なしに実行する必要があります。これらのステップは通常1日で実行されます。これらのステップの前に酵素を試験することが強く推奨されます。ステップ1.9および1.10はオプションです。これらの工程は、IS配列で付随して増幅される内部ベクターDNA配列を減少させ.......

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開示事項

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著者は何も開示することはない。

謝辞

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資金提供は、国立衛生研究所R00-HL116234、U19 AI117941、およびR56 HL126544によって提供された。国立科学財団グラントDMS-1516675;韓国国立研究財団（NRF-2011-0030049、NRF-2014M3C9A3064552）; KRIBBイニシアチブ・プログラムを発表しました。

....

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
耐熱性DNAポリメラーゼAgilent600424PicoMaxxポリメラーゼ
耐熱性DNAポリメラーゼバッファーAgilent600424PicoMaxxポリメラーゼバッファー
デオキシヌクレオチド(dNTP)溶液ミックスニューイングランドバイオラボN0447LdNTP溶液ミックス(各10 mM)
PCRチューブVWR International53509-304PCRストリップチューブ 個別添付キャップ2mL
微量遠心チューブMolecular Bioproducts3453微量遠心チューブ
PCR精製キットQiagen28106
RsaI ニューイングランドバイオラボR0167L制限酵素
CviQIニューイングランドバイオラボR0639L制限酵素
バッファーAニューイングランドバイオラボB7204SNEB CutSmartバッファーDNA
ポリメラーゼI大きな(klenow)フラグメント ニューイングランドバイオラボM0210L鈍化
ストレプトアビジンビーズ溶液Invitrogen 60101Dynabeads キロベースバインダーキット
結合液Invitrogen 60101Dynabeads キロベースバインダーキット
洗浄液Invitrogen 60101Dynabeads キロベースバインダーキット
磁気スタンドThermoFisher12321DDynaMag™-2 マグネット
T4 DNA リガーゼニューイングランド バイオラボM0202LT4 DNA リガー
ゼ 10X T4 DNA リガーゼ緩衝液ニューイングランド バイオラボB0202ST4 DNA リガーゼ反応緩衝液
5X T4 DNA リガーゼ緩衝液Invitrogen 46300-018T4 DNAリガーゼ緩衝液、ポリエチレングリコール-8000
UV-Vis分光光度計フィッシャーサイエンティフィックS06497Nanodrop 2000
pvuIIニューイングランドバイオラボR0151L制限酵素
sfoIニューイングランドバイオラボR0606L制限酵素
BニューイングランドバイオラボBニューイングランドバイオラボB7203SNEBバッファ3.1
ヌクレアーゼフリーウォーター統合DNAテクノロジー11-05-01-14
キャピラリー電気泳動Qiagen9001941QIAxcel キャピラリー電気泳動
Veriti 96ウェル 高速サーマルサイクラーサーモフィッシャーサイエンティフィック4375305PCR機器
回転ホイール(またはローラー)エッペンドルフM10534004細胞培養ローラー ドラム
DNAサイズマーカーQiagen929559QXサイズマーカー (100 - 2,500 bp)
DNAサイズマーカーQiagen929554QXサイズマーカー (50 - 1,500 bp)
DNAアライメントマーカーQiagen929524QX DNAアライメントマーカー
ゲノムDNA利用不可in vivoまたはin vitro実験からのサンプルゲノムDNA
ス ス バッファ利用不可

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Serrao, E., Engelman, A. N. Sites of Retroviral DNA Integration: From Basic Research to Clinical Applications. Crit. Rev. Biochem. Mol. Bio. 51 (1), 26-42 (2016).
  2. Kim, S., et al. Dynamics of HSPC Repopulation ....

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タグ

PCR PCR

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