方法論記事

磁気活性化細胞選別法により単離された血管周囲脂肪組織からの脂肪細胞前駆体の拡大および脂肪生成誘導

DOI：

10.3791/55818

⸱

2017年6月30日

 ,  ,  , 
1Department of Large Animal Clinical Sciences, Michigan State University, 2Department of Pharmacology and Toxicology, Michigan State University

この記事について

サマリー

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ここでは、MCS（Magnetic-Activated Cell Sorting）を用いた脈管内脂肪組織（PVAT）からの脂肪細胞前駆細胞（APC）集団の単離方法を報告する。この方法は、蛍光活性化細胞選別（FACS）と比較した場合、脂肪組織のグラム当たりのAPCの単離の増加を可能にする。

要約

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

パラクラインシグナリングを介した血管機能の主要調節因子である血管周囲脂肪組織（PVAT）の拡大は、肥満時の高血圧の発症に直接関連する。肥大および過形成の程度は、デポの位置、性別、および存在する脂肪細胞前駆細胞（APC）表現型のタイプに依存する。過去10年間のAPCおよび前脂肪細胞分離のために使用された技術は、個々の細胞が特定の細胞表面マーカーに基づいて同定され得る正確さを大幅に改善した。しかしながら、APCおよび脂肪細胞の単離は、特にインタクトな細胞を細胞培養適用のために保持しなければならない場合、細胞の脆弱性のために困難であり得る。

磁気活性化細胞選別（ MCS）は、脂肪組織の重量単位あたりより多くの生存APCを単離する方法を提供する。 MCSによって回収されたAPCは、インビトロプロトコールでプレア成長因子カクテルを使用してそれらを脂肪細胞に分化させ、細胞によって保持された多分性および脂肪生成能の分析を可能にする。この実験は、拡張中の心臓血管疾患の発症において重要な役割を果たす大動脈および腸間膜のPVATデポーに焦点を当てた。これらのプロトコルは、定義されたAPC集団を分離し、拡大し、そして区別するための方法を記載する。このMCSプロトコルは、最小限の設備またはトレーニングで細胞選別が必要なあらゆる実験で分離を使用することを可能にする。これらの技術は、細胞表面マーカーの存在に基づいて特定の細胞集団の機能性を決定するさらなる実験を助けることができる。

概要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

脈管周囲脂肪組織（PVAT）は、血管に近接しているため、脈管機能1における主要なパラクリンシグナル伝達成分である。この脂肪組織の拡大は、存在する脂肪細胞前駆細胞（APC）の表現型に依存する2,3 。脂肪組織からの細胞の単離は、主要な脂肪細胞が壊れやすく、浮力があり、大きさの範囲があるため、困難である。特定の単離技術はまた、炎症性タンパク質合成を増加させ、脂肪生成遺伝子発現を減少させることによって細胞表現型および形態を変えることができ、細胞の完全性を維持するプロトコルの重要性を強調する。

初代細胞および特異的前脂肪細胞亜集団の培養は、インビボ増殖に対する還元主義的アプローチを提供し、同等の細胞遺伝的メイクアップ5を維持するが、これらの細胞の私は、老化や老化による劣化のために制限されています6 。皮下および大網デポーを含む様々な脂肪デポーからの前脂肪細胞もまた、特定の解剖学的部位から細胞を集めることの重要性を強調する増殖の差異7を示す。非PVAT白色脂肪細胞由来の前駆細胞は、以前の研究7,8,9において特徴付けられてきたが、PVAT APC表現型についてはあまり知られていない。

ここに記載された技術は、形態学、生存能力、および増殖および分化の可能性に最小限の影響を及ぼしながら、特異的および限定されたAPC集団の分析を可能にする。ビーズが細胞を変えずに溶解するので、磁気活性化細胞選別（MCS）は、培養などの下流の適用に適している。 MCSもまた経済的であり、一旦、抗体の欠点フローサイトメトリーアッセイの必要性は最小限に抑えられています。 PVAT前駆体を用いたインビトロ研究はまた、これらの初代細胞が有する可能性を垣間見ることができる。

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プロトコル

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本書に記載されているすべての手順は、ミシガン州立大学の機関動物管理および使用委員会（IACUC）によって制定されたガイドラインに従います。すべてのバッファーとメディアを光から保護する必要があります。

緩衝液、培地および器具の調製

  1. （KRBB）：135mM塩化ナトリウム、5mM塩化カリウム、1mM硫酸マグネシウム、0.4mMリン酸二水素カリウム、5.5mMグルコース、1％抗生物質/抗真菌剤（10,000単位/ mLペニシリン、10,000μg / mLのストレプトマイシン、25μg/ mLのアンホテリシンB）、および10mMのHEPES（pH = 7.4）。この溶液は、4℃で滅菌した場合、3週間安定です。
  2. コラゲナーゼタイプ1溶液を調製する：4％ウシ血清アルブミン（BSA）を含むKRBB中に1mg / mL。この溶液は37℃で保存し、4時間安定です。
  3. 赤血球溶解緩衝溶液の調製：154mM塩化アンモニウム、10mM重炭酸カリウム、および0.1mMのEDTAを含む。 4℃で1ヶ月間保管してください。
  4. DMEM / F12培地、10％ウシ胎仔血清（FBS）、5％正常ロバ血清、40μL/ mL F（ab）断片ロバ抗ラットIgGを調製する。 4℃で1ヶ月間保管してください。
  5. MCS緩衝溶液：リン酸緩衝食塩水（PBS、pH = 7.5）、0.5％BSA、および2mM EDTAを調製する。 4℃で1ヶ月間保管してください。ガラス容器内で37℃に加熱し、次いで15秒間真空を適用することによって、脱ガス溶液。使用しないでください。
  6. （DMEM）：F12,15％ウシ胎児血清（FCS）、1％抗生物質/抗真菌剤（10,000単位/ mLペニシリン、10,000μg/ mLストレプトマイシン、25μgのストレプトマイシン、 / mLアンホテリシンB）、44.05mM重炭酸ナトリウム、100μMアスコルビン酸、33μMビオチン、17μMパントテン酸塩、2mM L-グルタミン、および20mM HEPES。無菌状態で4℃で2週間まで保存してください。
  7. APC＆白血病抑制因子（10 ng / mL）、血小板由来増殖因子BB（10 ng / mL）、および塩基性線維芽細胞増殖因子を含む基礎増殖培地（＃160;培地： 5ng / mL）。無菌状態で4℃で2週間まで保存してください。
  8. APC誘導培地：10％FBS、2.5μg/ mLインスリン、0.5mM 2-イソブチル-1-メチルキサンチン（IBMX）、1μMデキサメタゾン、および200μMT3（トリヨードチロニン甲状腺ホルモン）を含むAPC培地を調製する。無菌状態で4℃で2週間まで保存してください。

2.脂肪細胞前駆細胞の単離

  1. 施設ガイドラインに従ってラットを麻酔する。ラットを背臥位に置く。つま先のつまみで麻酔の深さを確認し、この痛みを伴う刺激に対する反射応答の喪失を確認します。
    注：このプロトコールは、10週齢のSprague Dawleyラットおよび70mg / kgのペントバルビタールを腹腔内注射によって送達する。
  2. 垂直正中線切開を作る胸骨領域の胸骨に沿って、および会陰領域にi番目のはさみ。腹腔に入り、上腸間膜動脈、小腸腸間膜抵抗性血管（mPVAT）および胸部大動脈（aPVAT）を暴露する。
    1. 腸間膜および大動脈への接続をすべて切断し、動物から血管を取り除く。解剖顕微鏡とKRBBで満たされたペトリ皿を用いてPVATを分離し、血管を観察し、PVATを単離する。
    2. この実験では、非PVAT脂肪蓄積を表す生殖腺（GON）脂肪を収集する。 10mMのHEPES（pH = 7.4）を含むKRBBの氷上に単離された脂肪パッドを置く。
    3. バイオセーフティフードでは、約50mgの組織を、1mLのコラゲナーゼI型溶液を含む1.7mLチューブに移し、組織はさみ（1〜3mm片）で切ります。
  3. Rotisserieインキュベーター（またはオービタルシェーカーを備えたインキュベーター）で37℃で1時間インキュベートしてサンプルを消化する。バイオセーフティフードでは、消化した物質を100および40 50mLのチューブに移した。得られたろ液を4℃で10分間、300×gで遠心分離する。
    注記：ここからのプロトコールの全てのステップは、細胞を無菌状態に保つためにバイオセーフティフード内で実施するものとする。
  4. 上清を除去し、SVF細胞を含むペレットを1×赤血球溶解緩衝溶液1mLに再懸濁し、1.7mLの微量遠心管に移す。光から保護されたRTで5分間細胞をインキュベートし、4℃で300xgで5分間遠心分離する。
  5. SVF Basal Mediaに上清を残し、残りの細胞ペレットを再懸濁する。トリパンブルー溶液を用いて生細胞を計数するために20μLのサブサンプルを収集する。
    注：隔離可能なSVF細胞の数は、サイトによって異なります。組織1mg当たりに採取されたSVFの平均数は、aPVAT = 5.0±2.0×10 3 、mPVAT = 1.04±0.62×10 4 、GON = 2.4±1.2× 10 5である 。

3.磁気活性セルソーティング

_content ">注：4℃ですべてのステップを実行することにより、CD34およびPDGFRα細胞表面マーカーに基づいてSVFからAPCを単離します。

  1. 細胞を300 x gで5分間スピンします。上清を捨て、細胞ペレットを1×10 6細胞/ mLでMCSブロッキング緩衝液に再懸濁し、20分間インキュベートする。
    注：1×10 6〜2×10 8細胞/ mLの細胞懸濁液を効果的に分離することができます。
  2. 細胞を5μLのFITC結合マウス抗CD34（1μg/ 1×10 6細胞）と共に4℃で30分間インキュベートする。 300 xgおよび4℃で5分間細胞をスピンします。
    1. 4μLの抗FITCマイクロビーズと96μLのMCSバッファー（全量100μL）と4℃で5分間、暗所でインキュベートし、CD34 +およびCD34 -細胞を分離する。
  3. 磁気分離器をスタンドに取り付け、列翼を前面に向けてMultiSort（MS）Columnをセパレータに置きます。 5 mL上部チューブホルダー内のMSカラムの下に置いてください。
  4. MCS Buffer SolutionでリンスしてMSカラムを調製します。カラムの上に500μLのMCS Bufferをアプライし、バッファを通過させます。流出液を廃棄し、回収チューブを交換する。
  5. 抗体標識された細胞懸濁液を調製したMSカラムにロードする。未標識細胞を含むフロースルーを収集する。
  6. 脱気したMCS緩衝液3×500μLでMSカラムを洗浄する。前のステップからの流れを通過して結合する非標識細胞を収集する。
  7. 磁気分離器からMSカラムを取り外し、新しいコレクションチューブ上に置きます。 1mLのMCS緩衝液をMSカラムに注ぎます。直ちに磁気標識した細胞でフラクションをただちに洗い流しますが、カラムに供給されたプランジャーをゆっくりと加えて、余分なガスがカラムに入らないようにしてください。
    注：単離された細胞数はサイトによって異なります。 SVF集団から単離されたCD34 + APCの平均数組織のmgは、aPVAT = 2.6±0.43x10 2 、mPVAT = 9.6±1.4x10 2 、GON = 1.3±0.22x10 3である 。
  8. 細胞を300×gおよび4℃で5分間スピンさせる。 1：200溶液/ 1×10 6細胞ウサギ抗PDGFRα10μL中に集めたCD34 +画分を4℃で30分間インキュベートする。
    1. 300 xgおよび4℃で5分間細胞を再度遠心する。標識された細胞を抗ウサギIgGマイクロビーズ4μLおよびMCS緩衝液96μLとインキュベートし、3.3から3.7のステップを繰り返して単離する。
      注：単離された細胞数はサイトによって異なります。組織1mgあたりのCD34 +集団から単離されたPDGFRα + APCの平均数は、aPVAT = 2.4±0.64、mPVAT = 8.4±2.4、GON = 10.4±1.9であり、これは以前に単離された集団の0.5~10％である。

4.細胞培養および脂肪生成誘導

  1. SVFの文化および2日間毎に交換する基礎培地中の6ウェル組織培養プレート中のAPCを含む。 3回の連続継代後、8ウェルプレート、24ウェルプレート、48ウェルプレート、96ウェルプレート、24ウェルプレートで50,000細胞/ウェルで評価される増殖アッセイのために1×10 2細胞/ウェルの黒色96ウェル組織培養プレートにプレートするか、定性的および定量的である脂肪生成アッセイのための48ウェル組織培養プレート中の10,000細胞/ウェル。
  2. 分化のために示されたように、骨形成タンパク質4（3.3nmol / L）によるコンフルエント後48時間および誘導前のAPC基礎培地の補充。細胞をインキュベートするためにAPC誘導培地を用いて100％コンフルエンシー（0日目）の48時間後に細胞を誘導する。
  3. 48時間後、培地を交換して、IBMXおよびデキサメタゾンを含まないAPC誘導培地中で、14時間毎に培地を交換し、48時間ごとに細胞を維持する。
  4. FACSによって検証されたMCS分離。
    1. 磁気的に分離した50μL（50,000セル）のサブサンプルを取るFACS溶液で洗浄する。
    2. 細胞を遠心分離し、PDGFRα +細胞を標識するロバ抗ウサギIgG Dylight 405の1：1,000溶液100μL中に再懸濁する。軽く、4℃で30分間インキュベートする。
    3. フローサイトメーターで488 nm（FITC）および405 nm（Dylight 405）フィルターを使用して解析するまで、細胞を洗浄し、2％ホルムアルデヒド溶液200μLで再懸濁します。
      注：培養細胞による脂質蓄積は、蛍光を測定するマイクロプレートリーダーで脂質親和性脂肪生成蛍光アッセイを使用し、脂質蓄積のキャリブレーターとして前脂肪細胞を使用して定量的に評価する。脂質蓄積はまた、脂質色素を染色するかまたは含まない全細胞のパーセンテージを観察可能にする、カメラを備えた倒立顕微鏡で行われる脂質色素染色およびイメージングによって定性的に測定される。 485nmでの励起および572nmでの発光で蛍光を測定することができる任意のプレートリーダーnmは、デジタル画像を取り込むことができるカメラを備えた顕微鏡と同様に、分析にも適しています。

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結果

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前脂肪細胞の増殖能力および脂肪細胞前駆体の脂肪生成能は、インビトロで維持される特性である11 。定量的DNAアッセイを用いてプレーティングした8,24,48および96時間後に、雄ラットのaPVAT、mPVAT、およびGONから単離したSVFおよびAPCのin vitro増殖を評価した。同じサイトのSVF細胞（ 図1 ）と比較して96時間の増殖が少ないaPVAT由来のAPCを除いて、SVF増殖率の部位差は、いかなる時点においても観察されなかった。

Bone Morphogenic Protein 4（BMP4）で刺激されたコンフルエントなAPCは、標準的な誘導の48時間前に分化を示した。これは、蛍光脂質取り込みアッセイ（ 図2A

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ディスカッション

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本実験の中心的な焦点は、PVATデポからのAPCの単離、拡大、および脂肪生成誘発である。ここでは、表面マーカーCD34およびPDGFRαを発現する細胞の同定に基づいて、APCの単離のためのプロトコールを提示する。これらの表面タンパク質は、APC上で、高い増殖速度および様々な脂肪貯蔵庫14,15中の白色または褐色脂肪細胞に分化する可能性を伴って以前に同定された。これらの特異的マーカーに基づいて細胞を選択することにより、我々は選択されたPVATで観察される脂肪細胞表現型と一致する複数の脂肪蓄積から同様のAPC集団を単離することができた。我々の実験では、成長因子BMP4を補充することによってAPCの分化を改善した。これまで、Macotelaらは、内臓脂肪細胞由来の特定のAPC集団が、培養培地に脂肪増殖性成長因子BMP2またはBMP4が補充されない限り、分化した場合の皮下デポー12,16,17,18。

脂肪組織からの個々の細胞の単離は細胞の脆弱性のため困難であるため、MCSを使用することにより、消耗品、機器、およびトレーニングリソースのより少...

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開示事項

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著者は何も開示することはない。

謝辞

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Contreras and Watts Laboratoriesとウィリアム・ラファエル博士。これらの実験は、NHLBI F31 HL128035-01（組織消化プロトコル標準化）、NHLBI 5R01HL117847-02および2P01HL070687-11A1（動物）およびNHLBI 5R01HL117847-02（細胞単離および培養）によって支持された。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
組織解剖
解剖皿シリコン
培養ペトリ皿パイレックス7740ガラス
シリコーンエラストマーダウコーニングシルガード170キット
編組シルク縫合ハーバード装置51-7615SP104
実体顕微鏡 MZ6ライカ10447254
ステレオマスター顕微鏡 光ファイバー光源フィッシャーサイエンティフィック12562-36
バンナスハサミジョージ・ティーマン &Co160-150
スプリンター鉗子ジョージティーマン&Co160-55
ティッシュはさみジョージティーマン&Co105-400
KRBB Solution
塩化ナトリウムSigma-Aldrich7647-14-5
塩化カリウムSigma-Aldrich7447-40-7
硫酸マグネシウムSigma-Aldrich7487-88-9
リン酸カリウム二塩基性Sigma-Aldrich7758-114
グルコースSigma-Aldrich50-99-7
抗生物質/抗真菌コーニング30-004-CI
HEPESコーニング25-060-CI
ストロング>ティッシュ 消化
コラゲナーゼ 1 型ワージントン 生化学LS004196
ウシ血清アルブミン (BSA)フィッシャーサイエンティフィ9048-46-8
赤血球溶解バッファーBioLegend4203011Xワーキングソリューション
ウォーターバスサーモフィッシャーサイエンティフィック2876振とうバス
バイオセーフティキャビネットサーモフィッシャーサイエンティフィック1385
ロティサリーインキュベーターダイガーEF4894C
100 &マイクロ;m細胞ストレーナーサーモフィッシャーサイエンティフィック22-363-549
イエロー40µm Cell StrainerThermo-Fisher Scientific22-363-547Blue
HemocytometerCole-ParmerUX-79001-00
Trypan BlueSigma-Aldrich93595
Cell Isolation
OctoMACS KitMiltenyi Biotech130-042-108
(DMEM):F12 MediumCorning90-090ミディアムベース
フェタル ウシ セラム (FBS)コーニング35016CVUSA オリジンズ
ノーマル ロバ セラムAbCamAB7475
アンチ CD34サンタクルーズSC-7324FITC 標識
抗 PDGFR&α;サーモフィッシャーサイエンティフィックPA5-17623
バ抗ウサギIgGジャクソン免疫研究712-007-003
リン酸緩衝生理食塩水(PBS)10Xコーニング46-013-CM1Xワーキングソリューション
EDTAフィッシャーサイエンティフィック15575020
細胞培養
CO2 セルインキュベータThermo-Fisher Scientific51030285Heracell 160i 
6ウェルプレートコーニング3516TC 処理
48 ウェルプレートコーニング3548TC 処理
96 ウェルプレート、黒壁コーニング353376TC 処理
重炭酸ナトリウムSigma-Aldrich144-55-8TC 処理
子牛胎児血清 (FCS)コーニング35011CV米国原産
アスコルビン酸Sigma-Aldrich50-81-7
ビオチンSigma-Aldrich58-85-5
パントテーネートSigma-Aldrich137-08-6
L-グルタミンCorning61-030
骨形態形成タンパク質 4 (BMP4)Prospec BioCYT-081
上皮成長因子 (EGF)PeproTech400-25
白血病抑制因子PeproTech250-02
血小板由来成長因子 BBProspec BioCYT-740
塩基性線維芽細胞成長因子 (bFGF)PeproTech450-33
インスリンコーニング25-800-CRITS Solution
IBMXSigma-Aldrich28822-58-4
デキサメタゾンSigma-Aldrich50-02-2
T3 (トリヨードチロニン)Sigma-Aldrich6893-023
Cell Analysis
CyQUANT Proliferation Assay AssayThermo-Fisher ScientificC7026
AdipoRed Fluorescence Assay ReagentLonzaPT-7009
Oil Red O Lipid Dye 試薬Sigma-AldrichO1391In Solution
M1000 マイクロプレート リーダーTecan
Eclipse 倒立顕微鏡Nikon
Digital Sight DS-Qil カメラNikon
で手作り<ック相互ロー

参考文献

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CD34PDGFR

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