方法論記事

単離されたラット心臓からのインタースティシャル透過性収集のための逆心モデル

DOI：

10.3791/55849

⸱

2017年6月20日

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1Department of Anesthesiology, Changhai Hospital, Second Military Medical University, 2Department of Molecular Cardiology, Heinrich Heine University, 3Department of Clinical Biochemistry and Pathobiochemistry, German Diabetes Center, Heinrich Heine University

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

このプロトコルは、単離され、灌流されたラット心臓から心臓間質液を収集する方法を記載している。冠状静脈流出液灌流液から間質液透過液を物理的に分離するために、Langendorff灌流心臓を反転させ、心臓表面上に形成された経液透過液（間質液）を軟質ラテックスキャップを用いて収集する。

要約

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本プロトコルは、単離された生理食塩水灌流ラット心臓からの心臓通過液（CT）の収集を可能にする独自のアプローチを記載している。 Langendorff技術による心臓の単離および逆行灌流の後、心臓は逆さまの位置に反転され、左心室に挿入されたバルーンカテーテルによって機械的に安定化される。次に、薄いラテックスキャップ（ラットの心臓の平均サイズと一致するように予めキャスト）を心外膜表面に配置する。ラテックスキャップの出口は、シリコンチューブに接続されており、遠位開口部は心臓の基底レベルより10cm下にあり、わずかな吸引力を生じさせる。心外膜表面上で連続的に産生されたCTを、さらなる分析のために氷冷バイアル中に集める。 CT形成速度は、対照および梗塞心臓では17〜147μL/分（n = 14）であり、これは冠動脈静脈流出液灌流液の0.1〜1％に相当する。プロテオーム分析および高PERFO液体クロマトグラフィー（HPLC）は、収集されたCTが広範囲のタンパク質およびプリン代謝産物を含むことを明らかにした。

概要

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心不全（HF）は、世界中のヒトの主要死因である1 。 HFは、心筋炎、心筋への虚血性傷害、および左心室リモデリングのためにしばしば起こり、心臓の収縮機能および患者の生活の質が漸進的に悪化する。心臓病および心臓手術の進歩はHFの死亡率を著しく低下させるが、重大な病的状態を伴う必然的に進行する疾患プロセスの一時的な遅延因子として機能するだけである。したがって、有効な治療の現在の欠如は、HFを予防または逆転することができる新規な分子標的を同定する必要性を強調している。これには、細胞外マトリックスの変化、制御されない心臓免疫応答、および心臓と非心臓の細胞との相互作用が含まれる2 。

心臓の細胞がdirecにさらされる微環境負傷した心臓の免疫応答および再生応答を形成する。単離された生理食塩水灌流心臓において、CTは、生理学的および病態生理学的条件下で、間質液空間（ すなわち微小環境）に由来する小さな液滴の形態で心臓表面上に生成される3,4,5 。したがって、CT（ すなわち、間質液）の分析は、心臓の代謝および収縮機能を調節する因子を同定するか、または損傷した心臓に移動した後に免疫細胞の機能に影響を与える因子を同定するのに役立ち得る。潜在的に、これは、HFの治療のための新規治療戦略の開発につながる可能性がある。

マウスの心臓からのCTの収集は技術的に困難です。通常のランゲンドルフ灌流心臓では、CTの独占的収集は困難である。なぜなら、CTとコロナ静脈流出物の灌流液は、間質腔から放出された代謝産物/酵素の濃度を予測して希釈する。この制限を克服するための1つの可能な戦略は、肺にカニューレを挿入し、同時に肺静脈を結紮することによって静脈流出液を排除することである。しかしながら、この方法は、肺動脈および静脈のカニューレ挿入および結紮に伴う困難に直面し、静脈流出液の心臓滲出液への潜在的な漏出を引き起こす。逆心モデルを使用するという概念は、隔離された灌流された心臓を逆さまにし、心外膜表面に薄いラテックスキャップを置き、静脈流出物の汚染なしに連続的にCTをサンプリングするKammermeierのグループによって初めて導入された8,9 。この手順を使用して、CTは、心臓9から放出された代謝産物の非常に敏感な尺度を提供することが示されたが、脂肪酸8 、およびウイルス粒子10の毛細管移動を含む。

より最近では、局所免疫応答を調節し、心血管新生を増大させるパラクリン因子が、心臓病の幹細胞に基づく治療の有益な効果に関与している。逆心臓におけるCTの分析は、これらの個々のパラクリン因子を化学的に同定するのに役立ち得る。さらに、CTは、心臓における免疫細胞のインビボ活性化に関与する因子を同定するのに役立ち得る。

本明細書で提供される、心臓表面からのCT収集の詳細な説明は、免疫細胞、線維芽細胞、内皮細胞および心筋細胞の全体的な心機能との相互作用を研究する研究者にとって実験的に有用である。上述したように、間質液は、心臓内の細胞間通信のための情報を運び、whCTの収集によって簡便に評価することができる。逆心臓からCTを収集する方法のビデオプロトコルを含む詳細な技術的説明は、この独特な技術の将来の適用を容易にするはずである。

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プロトコル

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すべての実験は、地方の規制当局（ LANUV of Nordrhein-Westfalen、Germany）によって承認され、動物使用のガイドラインに従って実施された。動物に標準食餌を与え、 自由に水道水を与えた 。実験の各ステップに必要なすべての機器および化学物質は、 表の表に記載されています。

1.ラテックスキャップと脳室内バルーンの準備

  1. ラットの心臓の平均サイズ（300-350gの体重）に適合するフライス盤を使用してアルミニウムの型を作る。極端な（10/0）エメリー紙で型を磨く。
    注記：モールドの詳細なメトリックを図1Aに示します 。
  2. アルミモールドのネックをフライス盤に垂直に固定してラテックスキャップを準備する。
    注記：フライス盤は金型をゆっくり回転させます。あるいは、電気モータを使用することもできる。 >
  3. 20 mLの液体ラテックス（市販品、 表を参照）を50 mLガラスビーカーに注ぎます。
  4. モールドの本体全体がラテックス溶液に浸されるまでモールドを下げます。
  5. 回転しながら金型をゆっくりと持ち上げます（5 cm /分）。
  6. モールドの表面のラテックスが凝固するまで、モールドをさらに15分間回転させ続けます。
  7. 剥がしている間の損傷を防ぐために、タルク粉末約1gをモールドの表面に加えます（すでに薄いラテックスフィルムで覆われています）。
  8. すでに乾燥されたラテックスキャップを指先でカビ表面から静かに取り外します。ラテックスキャップはすぐに使用できる状態になります（ 図1B ）。
  9. ラテックスキャップの出口を15 cmシリコンチューブ（ID = 0.2 mm）に接続し、後でCTの収集に使用します。
  10. 心室ラテックスバルーンを水で満たし、1mLの水で満たされたシリンジに接続されたL字形の金属カニューレにしっかりと固定する。>図1C）。
    注：これは、心臓の直立した位置を保証するために使用されます（下記参照）。
  11. 添付の1 mLシリンジで数回の収縮/膨張試験を行うことにより、バルーンが気密であることを確認します。
  12. 心房発達圧の将来の測定のために、カニューレを三方停止装置を介して圧力変換器に接続する（ 図1C ）。

Krebs-Henseleit Buffer（KHB）およびLangendorff灌流システムの調製

  1. 一定流量（ローラーポンプで駆動）または定圧（ガラスカラムでの静圧で生成）モードのいずれかを使用して、Langendorff灌流システムをセットアップします。
    注：Langendorff心臓準備の詳細は、以前に記載されています12 。
  2. 修飾されたKHB（mM単位：116.02 NaCl、4.63 KCl、1.10 MgSO 4・7H 2 O、1.21 K 2 HPO 4 2・2H 2 O、24.88NaHCO 3、8.30D-グルコース、および2.0ピルビン酸ナトリウム）を含む。
    1. CaCl 2以外のすべての化学物質を秤量し、2Lフラスコ中で1.8Lの二重蒸留水に溶解する。
    2. 磁気撹拌下で、カルバゲン（95％O 2 /5％CO 2 ）で少なくとも5分間平衡化（pH：7.4）するために培地を泡立てる。
    3. 0.74gのCaCl 2・ 2H 2 Oを加え、二回蒸留水で全量を2Lにする。
    4. 培地をさらに5分間、撹拌し、カルベーゲンで泡立てる。
    5. 0.2μmフィルターを通してKHBをろ過して、心臓の微小循環を妨害し得る小さな粒子を排除する。
  3. ランゲンドルフ灌流システムの準備。
    1. ろ過したKHBを予め温めた水浴（38℃）に入れる。 100cmH 2 O insidの圧力を発生させるためにカルボゲンを泡立たせ続けるKHB貯水池。
    2. リザーバーをガラスカラムに接続して、KHBによるランゲンドルフ灌流のために100cmH 2 O静水圧を確立する。 carbogenでカラム内にKHBをバブリングし続けます。
    3. 大動脈カニューレの出口の温度が37℃になるように加温システムの温度を調整する。
    4. 配管システムにバブルがないことを確認してください。
    5. KHB中のPO 2が500〜600mmHg（血液ガス分析器で測定）に達するまで、カルボゲンでKHBをさらに5分間酸素化する。
  4. 灌流システムを、100cmH 2 Oの一定の圧力で、または手動切り替えを用いて約10〜20mL /分の一定流量で実行するように設定する。あるいは、交換可能なSTHポンプコントローラを使用して、灌流モードに即座に切り替えることができます。

3.心の隔離とカニュレーション

注：30匹の体重を有する雄Wistarラット心臓のサイズがプレキャストラテックスキャップに合うように0~350gを使用した。ラットは左動脈の結紮（LAD）を50分間行った後、再灌流を行ったか、または偽手術した。心筋梗塞（MI）の誘導のための方法論の詳細は他のところで報告されている13 。梗塞動物における逆心臓実験は、手術後5日目に行った。

  1. 動物の保持チャンバー（20L）に接続したイソフルラン気化器（2％V / V）を用いてラットを麻酔する。
  2. 深い麻酔に達した後、ラットを手術台（温度制御されていない）に移す。
  3. 鉗子を使用して胸骨のすぐ下の皮膚と筋肉を持ち上げ、肋骨の下縁を重いはさみで切る。
  4. 細かいハサミを使用して、リブの縁にあるダイアフラムに小さな切れ目を付けます。肋骨を尾側に切断して、胸壁全体のフラップを作る。
  5. 優しく親指で心をつかむ指および中指を持ち上げ、ゆっくりと持ち上げて、心臓血管をわずかに引き伸ばす。
  6. 大動脈が完全に露出するまで心臓を切除する。
  7. 50mLの氷冷KHB（4℃）を含む100mLビーカーに心臓を置き、それを灌流装置に移す。
  8. 直ちに、大動脈を介して滴下カニューレに心臓を取り付け、縫合糸（4-0）でしっかりと締め付ける。心臓に入る気泡を避けてください。
  9. 一定の灌流圧（100cmH 2 O）を加える。あるいは、フル流速（20mL /分で開始）を適用することもできます。
    注：胸郭の開口部から灌流カニューレへの心臓の取り付けまでの時間は、経験豊富なオペレーターの手に約3分かかるはずです。

4.逆心モデル

  1. 心臓の後壁が正面図になるまで、静かに大動脈カニューレを回転させる。
  2. はさみで結合組織を除去する左心房の開口部を露出させ、心室内カニューレ挿入の準備をする。
  3. 硬質カテーテルに取り付けられた収縮したラテックスバルーンを左心房を介して左心室に挿入する。
  4. 心室の空洞全体を満たすまでバルーンを膨らませます（膨張したボリュームはシリンジにあらかじめマークされています）。
  5. 心臓を逆さになるまで反転させ、心室内バルーンカテーテルで心臓を支えます。
  6. 図1Cに示されているように、硬質金属カテーテルを備えた心室内バルーンを用いて、逆位心臓を直立位置で機械的に安定化させる。
  7. 大動脈根の過度のねじれを避けるために、心臓の位置を調整する。
  8. 拡張期圧を3〜5 mmHgに調整する（心内バルーンで測定; 図1C参照）。
  9. 心臓の心外膜表面を観察し、小さな液滴が形成されることを確実にする。
  10. ラテックスキャップを置く軽く指を使って心臓全体を覆うように押して、心臓の表面に触れる。
  11. ラテックスキャップが心室の表面のほとんどを覆っていることを確認してください。
  12. 静かに1mLシリンジで吸引することによって、キャップとチューブの内部に気泡があればそれを取り除きます。
  13. CTを出しているチューブの遠位開口部を、心臓の水平レベルの10cm下に調整する。
    注：この手順では負の静水圧によるわずかな吸引が保証されます。
  14. NaClで1：1に混合した氷中に置いた1.5mLの採集管にCTの滴を集める。約0.15-1.5mLのCTを収集する。
    注：氷/ NaCl混合物は、採取チューブ内の温度をゼロ（約-4℃）以下に安定化させます。
    注：サンプリング時間は実験目的によって異なります。 CTの流速は、偽手術動物（n = 3）では約27±20μL/分であり、冠動脈結紮動物（n = 11）では100±47μL/分である。
  15. CTサンプルを秤量しスナップフリーズする液体窒素中で保存し、その後の測定のために-80℃で保存する。

5. CTの分析

  1. 科学的な質問に応じて、代謝産物の分析にCT液を使用します。
    注： 図2および図3に示すデータは、定圧灌流（100cmH 2 O）から収集し、約0.15〜1.5mLのCT液を10分以内に収集した。この時間と量は、様々なプリンのプロテオーム（最小：50μL; 図2 ） 14およびHPLC（最小：20μL; 図3 ）分析に十分であった。

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結果

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逆心モデルは、単離された再潅流されたラット心臓（ 図 1A〜C）における心臓間質液透過物の収集を可能にする。 100cmH 2 Oの一定の圧力で灌流すると、間質液形成速度は、17〜147μL/分の範囲であり、孤立した心臓の冠状静脈流出物の0.1〜1％に及んだ。

ビシンコニン酸（BCA）アッセイで測定したCTのタンパク質含量は、1.08±0.40mg / mL（n = 6）であることが判明した。一次元ゲル電気泳動分析（SDS-PAGE）は、心臓の透過液中に存在する広範囲のタンパク質を明らかにした（ 図2A ）。 50分間の虚血/再灌流を受けた心臓からのCTについて、二次元蛍光差異ゲル電気泳動（2D-DIGE）を行った。図に示すように図2Bに示すように、いくつかのタンパク質が虚血心臓のCTにおいて上方制御されることが...

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ディスカッション

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逆心モデルは、十分に確立されたLangendorff心臓灌流技術12に基づいており、心臓を逆さまの位置に単純に反転させ、剛体の心室バルーンカテーテルを使用してこの位置を保持することによって実行される。このようにして、心臓間質液透過物は、心臓9の基部から重力によって滴下する冠状静脈流出物灌流液から物理的に分離することができる。 CTは、心臓全体の表面に配置された薄く柔軟なラテックスキャップによって連続的に収集することができる。

この方法は、Langendorff装置に加えて、最小限のコストで実施が容易である。それにもかかわらず、再現可能で安定した結果を得るためには、技術的に重要なステップがあります。これには、ラテックスキャップが心臓の形状に適切に適合し、心房ではなく心室の表面の約90％を覆うことが含まれます。 excからの時間長時間の虚血が心臓代謝および心臓攣縮の形成のリスクを負うので、3分未満でなければならない。心室内バルーンによって測定される拡張期左心室圧は、心室腔（3-5mmHg）を...

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開示事項

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著者らは競合する金銭的利益がないと宣言している。

謝辞

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この研究は、NSFC 81570244、FoKo 23/2013、およびSFB 1116 / B01および心臓血管研究所デュッセルドルフ（CARID）によって資金提供された。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
ラテックス溶液ProChemieZ-ラテックスLA-TZhttp://kautschukgesellschaft.de/%E2%80%A8z-latex-la-tz
アルミ金型自家製-リバースハートモデル
ユニバーサルオーブンメンメルトUNB 400ハートモデル
ラテックスバルーンゴサックスサイズ4ハートモデル
フライス盤ProxxonMF70逆心臓モデル
塩化ナトリウムシグマSZBD0810V化学薬品
炭酸水素Roth68852化学薬品
塩化カリウムメルク49361化学薬品
硫酸マグネシウム 七水和物メルク58861化学薬品
リン酸二水素カリウムメルク48731化学薬品
D(+)-グルコース無水メルク83371化学薬品
塩化カルシウム二水和物Fluka21097化学
薬品バランスVWRSE 1202計量化学薬品
二重蒸留水ミルポア- 溶解薬品
医療圧力トランスデューサゴールド-ランゲンドルフ装置
医療用フロープローブ遷音速3PXNランゲンドルフ装置
暖房循環バスHaake B3 ;DC1ランゲンドルフ装置
実験室および真空チューブタイゴンR-3603ランゲンドルフ装置
動物研究 流量計トランソニックT206ランゲンドルフ装置
PowerLab データ収集装置AD機器チャート 7.1ランゲンドルフ装置
LabChart データ収集ソフトウェアAD機器チャート7.1ランゲンドルフ装置
蠕動ポンプグリゾンMINIPULS 3ランゲンドルフ装置
ガラス ウォーターカラム自家製-ランゲンドルフ装置
ウォーターバス保護剤VWR462-7000ランゲンドルフ装置
滅菌済み使い捨てフィルター (0.2 & micro;m)Thermo Scientific595-4520ランゲンドルフ装置
血液ガス分析装置放射計ABL90 FLEX PLUSガス分析器
70% エタノールVWR UN1170洗浄  チューブ
100% エタノールメルク64-17-5洗浄チューブ
Wistar RatsJanvier-Animals
ステンレスハサミAESCULAPBC702R手術器具
ステンレスハサミAESCULAPBC257R手術器具
大型鉗子AESCULAP-手術器具
8m/m ステンレス鉗子F.S.T11052-10手術器具
超微細 (10/0) エメリーペーパー3M051111-11694リバースハートモデル
リバースヒューリバースナトリウム

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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HPLC

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