光顕微鏡によるシナプス小胞タンパク質と融合した 1p-169 と吸収小胞の電子顕微鏡によるシナプス小胞エンドサイトーシスが検出されました。
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この記事について
サマリー
要約
エンドサイトーシス、時にシナプス小胞の融合は小胞リサイクルそしてこうして神経反復焼成時におけるシナプス伝達の維持を可能にする神経終末で取得されます。病理学の条件に障害エンドサイトーシスは、シナプスの強さと脳の機能の低下につながります。ここでは、我々 は哺乳類神経培養海馬シナプスにおけるシナプス小胞エンドサイトーシスを測定するために使用方法を説明します。我々 は pHluorin、増加 pH 敏感な緑色蛍光タンパク質を小胞の内腔側でシナプトフィジンと VAMP2/シナプトブレビンを含むシナプス小胞膜タンパク質を融合することでシナプス小胞タンパク質エンドサイトーシスを監視、pH として蛍光強度が増加します。エキソサイトーシス、時小胞内腔 pH が増加し、pH は酸性再エンドサイトーシス小胞内腔中。したがって、pHluorin の蛍光強度の増加は減少を示す標識のシナプス小胞タンパク質のエンドサイトーシスに対し融合を示します。PHluorin イメージング法を使用して、エンドサイトーシスを記録するに加え、膜小胞エンドサイトーシスの監視西洋わさびペルオキシダーゼ (HRP) 摂取量の電子顕微鏡検査 (EM) 測定による小胞によって。最後に、我々 は神経末端の穴を形成する高カリウム誘起脱分極後様々 な時を監視しました。HRP 吸収と膜ピット形成の時間的経過は、エンドサイトーシスの時間コースを示します。
概要
神経伝達物質は、シナプス小胞に格納され、エキソサイトーシスによってリリースされました。シナプス小胞膜および蛋白質は、エンドサイトーシス、によって、開口放出の次のラウンドで再利用します。シナプス小胞エンドサイトーシスは、細胞膜から突き出た小胞を削除しますシナプス小胞のプールを維持するため重要です。酸性情況で急冷、中性 pH で蛍光 pH 敏感な緑色蛍光タンパク質 pHluorin は、エンドサイトーシス時間コース ライブ セル1,2,3を測定する使用されています。PHluorin 蛋白質は通常シナプトフィジンや VAMP2/シナプトブレビンなどのシナプス小胞タンパク質の内腔側に接続されています。でも、pHluorin はシナプス小胞の 5.5 の pH ルーメンで急冷され。細胞膜に小胞の融合を公開、pH が 7.3 〜 細胞外の溶液に小胞の内腔 pHluorin 蛍光性の増加の結果します。エキソサイトーシス後、シナプス小胞蛋白質それら回復小胞内小胞再酸性化に続いてのエンドサイトーシスによる増加の蛍光が崩壊します。崩壊は、エンドサイトーシスと小胞の再酸性化を反映しているが、再酸性化がほとんど条件1,4エンドサイトーシスよりも速いのでそ....
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プロトコル
注: 次のプロトコルは、pHluorin イメージング法と培養海馬ニューロン pHluorin モニター シナプス小胞タンパク質吸収細胞内で使用されている EM 方法を説明しますと、EM はシナプス小胞の取り込みを検出し、。微細構造変化します
。動物のケアとプロシージャの NIH ガイドラインに従った NIH 動物ケアおよび使用委員会によって承認されました
。1 です。 pHluorin イメージング
- 海馬ニューロンの文化
- 4 mM NaHCO 3 と 5 mM HEPES を組み合わせることによって準備海馬バッファー (HB) 5 M NaOH で pH 7.3 に調整。Neurobasal、中 2 %b27、0.5 mM L グルタミンと 1% ペニシリン-ストレプトマイシンを混合することによって培養液を作る。さらに、HB バッファーと 20% の混合物を準備ウシ胎児血清 (FBS HB/20%).
注: この養殖のプロトコルは、Sankaranarayanan、ら に基づいてください。 29 日 呉 、ら 24 - 培養液に 2 日目に生後 0 日間マウスの子....
- 4 mM NaHCO 3 と 5 mM HEPES を組み合わせることによって準備海馬バッファー (HB) 5 M NaOH で pH 7.3 に調整。Neurobasal、中 2 %b27、0.5 mM L グルタミンと 1% ペニシリン-ストレプトマイシンを混合することによって培養液を作る。さらに、HB バッファーと 20% の混合物を準備ウシ胎児血清 (FBS HB/20%).
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結果
脂質キャリア メソッドを使用して、SpH に表現された海馬ニューロン ボタン (図 1 a) の同定を可能にします。電気刺激誘発細胞エキソサイトーシスと蛍光強度の増加に対応。蛍光 (ΔF) の増加は、刺激 (図 1 b) を終了することによって停止されました。増加の蛍光は、エンドサイトーシスにより、低速の減少が続いた。VAMP2-pHluorin の場合 VAMP2 を刺激4後、ブートンから軸索に沿って拡散します。Raw データは、任意の単位を使用し、崩壊と τ (図 2 a-c) のレートを取得するベースラインに正規化されました。測定値は、正規化されたトレースから作られた、ので減衰率はピーク ΔF (ΔF/秒) の割合で蛍光の初期崩壊を反映しています。私達の実験条件でエンドサイト.......
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ディスカッション
ここでは、シナプス小胞エンドサイトーシスを監視するための 2 つの方法を示します。最初のメソッドでは、pHluorin transfected ニューロンのシナプス小胞タンパク質と融合し、その後電気刺激を監視しました。第二に、kcl と HRP 取り込みの EM イメージングを使用しました。2 つの理由のためにさまざまな刺激を使いました。まず、高カリウム施肥は文化のすべてのニューロンの脱分極を誘導します。これは EM 検討を促進する私たち EM 法非刺激と刺激ニューロン間区別することがないことを考える。第二に、超構造の形態学的変化より確実にみ高カリウム刺激などの強烈な刺激の後の活動電位または単一のアクションも簡単な鉄道後 pHluorin 蛍光の変化を観察できるに対し可能性があります。
PHluorin を用いたイメージング光学顕微鏡は、生きている細胞のシナプス小胞タンパク質融合と高時間分解能の吸収を示しています。エンドサイトーシスの経過とシナプス小胞のプールのサイズを調節する機構を研究対象に使用できます。pHluorin イメージングのみ使用されていないシナプス蛋白質のエンドサイ.......
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開示事項
著者が明らかに何もありません。
謝辞
朱永陵先生にありがとう VAMP2 phluorin を提供するため、シナプトフィジン pHluorin2x 構造と博士ジェームズ e. ロスマンを提供します。彼らのテクニカル サポートおよびヘルプ、博士スーザン ・ チェンと組織プラスミノーゲンアクテベータ電子顕微鏡施設のバージニア クロッカーに感謝します。この作品は国立研究所の神経疾患と脳卒中学内研究プログラム米国の生命研究イニシアティブ プログラム (韓国生物医学科学者フェローシップ プログラム)、韓国研究所からの助成金によって支持されました。バイオ サイエンスとバイオ テクノロジー、大韓民国。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| リポフェクタミンLTX with Plus | Thermo Fisher | 15338-100 | シナプトフィジンまたはVAMP2-pHluorin神経基礎培地を含むプラスミドDNAのトランスフェクション |
| Thermo Fisher | 21103-049 | ニューロン用増殖培地、37°Cまで温めます。C 使用前のC | |
| B27 | サーモフィッシャー | 17504-044 | ニューロン分化のための勾配 |
| Glutamax | サーモフィッシャー | 35050-061 | ニューロン培養のための勾配 |
| ポリ-D-リジンコーティングされたカバースリップ | Neuvitro | GG-25-pdl | 細胞の成長とウシ膵臓からのpHluorin |
| トリプシンXI | グマ | T1005 | 培養消化海馬組織 |
| ウシ膵臓由来デオキシリボヌクレアーゼI | シグマ | D5025 | ニューロン培養阻害粘性細胞懸濁液 |
| パルス刺激装置 | A-Mシステム | モデル 2100 | 電気刺激を適用する |
| フィールド刺激付きスロットバス | ワーナーインスツルメンツ | RC-21BRFS | 電気刺激 |
| 刺激アイソレーションユニット | を適用するワーナーインスツルメンツ | SIU102 | 刺激 |
| 潤滑剤 | ウコーニング | 111 | pHluorinイメージングシールカバースリップとイメージングチャンバー付きシールを適用し、チャンバーAP5 |
| Tocris | 3693 | 生理食塩水、選択的NMDA受容体拮抗薬の勾配は、再発活動の可能性があるシナプス後活動を阻害します | |
| CNQX | Tocris | 190 | 生理食塩水、競合AMPA/カイニン酸受容体拮抗薬のグラジエントは、再発活動の可能性があるシナプス後活動を阻害します |
| イルミネーター | ニコン | C-HGFI | pHluorin |
| EMCCDカメラ | Andor | iXon3 | pHluorin イメージング、pHluorin 蛍光強度の検出 |
| 倒立顕微鏡 | Nikon | Ti-E | シナプトフィジンまたはVAMP2 pHluorinトランスフェクト細胞のイメージング |
| NIS-Elements AR | ニコン | NIS-Elements イメージング | 取得および解析用アドバンスドリサーチソフトウェア |
| Igor Pro | WaveMetrics | Igor pro | イメージング解析およびデータ表示用ソフトウェア |
| チャンバー | ワーナーインスツルメンツ | RC21B | pHluorinイメージング、生細胞 |
| にフィールド刺激を適用するpoly-l-lysine | Sigma | P4832 | 電子顕微鏡、ニューロン成長のための基質、室温で 1 時間マルチウェルプレートに適用し、滅菌水で 3 回洗 |
| 西洋ワサビペルオキシダーゼ (HRP) | Sigma | P6782 | 電子顕微鏡、過酸化水素の存在下で DAB を触媒することにより、エンドサイトーシスされたシナプス小胞の標識、最終濃度は生理食塩水で 5 mg/mL です。使用前に |
| 新鮮な Na カコジル酸 | 電子顕微鏡科学 | 12300 | 電子顕微鏡、固定剤および洗浄のための緩衝液、最終濃度は0.1 N |
| 3,3′-ジアミノベンジジン(DAB) | シグマ | D8001 | 電子顕微鏡、エンドサイトーシスシナプス小胞の標識、HRPの基質、最終濃度は重水素減少水で0.5 mg / mLであり、ろ過され、使用前に新鮮にしてください |
| 酸化水素溶液 | シグマ | H1009 | 電子顕微鏡法、HRP-DAB反応を誘導することによりエンドサイトーシスされたシナプス小胞の標識、最終濃度は重水素減少水で0.3%、使用前に新鮮に作る |
| グルタルアルデヒド | 電子顕微鏡科学 | 16365 | 電子顕微鏡法、固定剤、最終濃度はNa-カコジル酸緩衝液で4%、使用前に新鮮に作り、 |
| TEM | JEOL | 200CX | を使用する前によく振とう電子顕微鏡、エンドサイトーシス小胞のイメージング、超微細構造変化 |
| CCDデジタルカメラ | AMT | XR-100 | 電子顕微鏡、画像キャプチャ |
| クエン酸鉛 | ライカマイクロシステム | 16707235 | 電子顕微鏡、グリッド染色 |
参考文献
- Sankaranarayanan, S., Ryan, T. A. Real-time measurements of vesicle-SNARE recycling in synapses of the central nervous system. Nature cell biol. 2 (4), 197-204 (2000).
- Sun, T., Wu, X. S., et al. The role of calc....
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