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方法論記事

二層流体プラットフォームシロイヌナズナ実生の根毛の形態のイメージング

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DOI：

10.3791/55971

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2017年8月15日

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1Bredesen Center for Interdisciplinary Research and Graduate Education, University of Tennessee, 2Bioscience Division and Center for Nanophase Materials Sciences, Oak Ridge national Laboratory, 3Department of Biochemistry and Cellular and Molecular Biology, University of Tennessee, 4Department of Microbiology, University of Tennessee

この記事について

サマリー

この資料は、主根と 1 つの光学的平面に根毛を閉じ込めた 2 層流体プラットフォームでシロイヌナズナ実生植物を培養する方法を示します。このプラットフォームは、他の手段によって細根形態同様高分解能イメージングについての実時間イメージングに使用できます。

要約

根毛は、良い水の摂取量と植物の栄養塩吸収根表面積を増やします。サイズが小さいとしばしば彼らの自然環境によって隠されている、根毛の形態と機能、勉強は難しいと多くの場合植物研究から除外されました。近年、マイクロ流体プラットフォームは、イメージング システムに転送中に根を妨げないで高解像度でのルート システムを視覚化する方法を提供しています。マイクロ流体プラットフォーム紹介ビルド前のチップ上の植物研究にシロイヌナズナの主根根毛と同じ光学平面に限定する 2 層デバイスを組み込むことによって。この設計により、携帯電話の根における根毛の定量化とオルガネラ レベルとも漂流の実験的治療の追加中に z 軸を防ぎます。我々 は含まれている水分環境の苗を無菌環境を維持しながら流体ポンプを必要とせずにデバイスを格納する方法について説明します。光イメージング実験デバイスが分解され原子間力や細根構造をそのままに保ちながら走査電子顕微鏡の基板として使用します。

概要

細かい根の機能を高める水と新しい土壌空間を探索し、総根表面積の増大、植物の栄養獲得。これら細根機能の売り上げ高1地下の食物連鎖を刺激することで主要な役割を果たしているし、特定の植物の根の数は上昇の大気中の二酸化炭素の下で倍増すると予想2。細根は一般に定義と、直径 2 mm より小さいが新しい定義を提唱、関数3細根を特徴付けるため。多くの細根のような根毛吸収および吸収の機能を提供するが、ミクロン オーダーの直径を持つ多くの小さなスペースを占有します。サイズが小さい、根毛はその場でイメージしにくいし、フィールド実験とモデルのアーキテクチャ全体のルートの一部としてしばしば見過ごされています。

ルート毛テラ exは、寒天上に成長した苗などを研究、細胞増殖およびトランスポート4,5に関する貴重な情報と科学的なコミュニティを提供しています。寒天は、非破壊的かつリアルタイムでイメージングするルート システムをできるように、彼らは、栄養素、植物ホルモンや細菌などの実験的治療の追加高環境制御を提供しません。また動的環境制御を affording 中高分解能観察を促進する新たなソリューションは、植物研究のためのマイクロ流体プラットフォームの出現をされています。これらのプラットフォームは、非破壊的な成長と高スループット フェノタイピング6,7,8,9, 分離化学療法のいくつかの植物種の可視化を有効にしています。10、力測定11,12、および微生物13を追加。マイクロ流体プラットフォーム設計の根に伝播すること、成長や治療中に光学フォーカスのうちドリフトする根毛を許可する単一のオープン スペース流体層の使用に焦点を当てています。

主根と同じ撮像面に苗根毛を拘束による前工場にチップの設計を構築する写真とソフト リソグラフィ手法を用いた二層流体プラットフォームを開発するための手順をご紹介します。これにより、リアルタイム、高解像度で、実験的な治療プロセス全体で根毛の発生を追跡できます。私たちの養殖方法は、プラットホームとシリンジ ポンプ装置の使用を必要としない水和と無菌環境で週まで培養種子から発芽するシロイヌナズナ実生を許可します。タイムラプス イメージング実験が終了後は、細かい根の機能の位置を乱すことがなく紹介プラットフォームを開くことができます。これは、他の高解像度イメージングの方法を使用をできます。ここで提供代表結果の定量化とその視覚化このプラットフォームで根毛の形態の光、走査型電子顕微鏡 (SEM)、原子間力顕微鏡法 (AFM)。

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プロトコル

1. 2 層プラットフォーム作製

  1. 多層マスターの作製
    1. スピン コート エポキシ系ネガ型フォトレジスト (~63.45% 固体、1,250 cSt) 製造元の仕様に従って (2,000 rpm 45 s) 最初の層の設計を 20 μ m の高さを取得する 4 インチ口径シリコンウェーハ上に。
    2. ソフト焼 95 ° C で 4 分用レジスト コーティング基板5 分公開紫外線 15 にウェハをクールにウェーハを許可する s (~ 150 mJ/cm2 365 nm) uv フォトマスクを通して下のレイヤーのジオメトリを定義するアライナにお問い合わせください。
    3. 露光後ベーク 95 ° C で 5 分間ウェーハ開発することがなくウェハをスピンコーター ・ スピンにエポキシ系ネガ型フォトレジストの 2 番目の層に戻る (~76.75% 固体、80,000 cSt) 150-200 μ m の第 2 層の高さを達成するために 3,000 の rpm で。
    4. 45 分の 95 ° C のホット プレートに転送する前に 5 分の残りの部分にウェーハを許可します。ホット プレートの上で焼く後、ウェハを削除し、冷却してフラット レベルの表面上の別の 5 分間室温で硬化レジストを許可します。合わせ、30 の第 2 層のフォトマスクにウェーハを公開 UV:mems (約 300 mJ/cm2の線量) で s。
    5. 95 ° C で 15 分間ホット プレートにウェハを置くことによって露光後ベークを実行し、開発する前に 5 分フラット レベルの表面上に冷却するウェーハします。
    6. プラスチックの皿にウェハを配置し、適切な開発者にウェーハを水没によって両方のレジストのレイヤーを同時に開発 (材料表を参照してください)。ウエハにわたって新鮮な開発者を洗うために時々 料理にそっと差し込みます。
    7. 17 分後に、イソプロパノール (IPA) によるウエハをすすいでください。白のフィルムが表示されます、映画が消えるまで、開発者と IPA ウエハを洗浄の間反復処理に進みます。窒素によるパターン化された si ウエハを乾燥させます。
  2. ポリジメチルシロキサン ソフト リソグラフィ
    1. 30 空気プラズマにシリコンウェハを公開プラズマ クリーナーで s 高に設定 (表を参照) をきれいにします。Silanize 2 時間シラン (85 ° C) の引火点以下鉄板化学フード (1 H, 1 H, 2 H, 2 H ペルフルオロ n-オクチル) トリクロロ シラン ウェーハ。
    2. マスター シリコンウェーハ上に硬化剤をポリジメチルシロキサン (PDMS) の比率 10:1 を注ぐ。真空チャンバー内で混合 PDMS をドガし 1 時間または、PDMS が完全に硬化するまで 70 ° C のオーブンでポリマーを治します。
    3. メスを使用して、PDMS デバイスをカットし、マスター シリコンウェーハからそれらの皮をむきます。1.5 mm 生検パンチを使用すると、シードと治療の入り江、メイン チャンネルに根の成長を奨励するのに 45 ° の角度で種子入口をパンチを作成できます。
    4. PDMS デバイスからの残骸を削除し、ガラス基盤にデザイン面でデバイスを置く明確な粘着テープを使用します。オートクレーブ組み立て装置。

2. デバイスの植栽

  1. シロイヌナズナ種子の準備
    1. 表面は、滅菌水で 4 回 7 分洗浄種子の脱イオン水と 0.1% トリトン X 洗剤の希釈 30% 市販の漂白剤の解決とおよび microfuge の管でシロイヌナズナ種子を殺菌します。
    2. 夜間または最大 4 ° C で 1 週間におよび microfuge の管を冷凍で種子を階層化します。
  2. デバイスの準備
    1. ガスから空気を除去するチャンバーの脱気真空滅菌装置を配置充填のしやすさを改善するために透過性 PDMS と流路。
    2. 真空チャンバーからデバイスを削除し、ph 5.7 ¼ 強度植物性メディアが液体で満たされたシャーレ内のデバイスをすぐに水没します。
    3. ピペットを使用して、デバイスに合わせて入口を通して液体を引き上げます。空気の泡が残っていないチャンネル内で目視によることを確認します。
    4. 個々 のデバイスを新しい乾いたシャーレに転送します。注ぐまたはピペットの熱い寒天寒天レベルまで装置のまわりは、PDMS 装置の一番上とほぼ同じ高さです。寒天を固めることを許可します。
      メモ: デバイスは種まきの準備が整いました、必要になるまでの 4 ° C で保存できます。
  3. デバイス内の種を植える
    1. 無菌環境で 1 つの種子を滅菌を小ピペットを使用して各デバイスの入口に転送します。
    2. カバー ワックスでペトリ皿 (表を参照) を映画し、光/暗いサイクリング成長室または室温で窓辺に置きます。デバイスは垂直であり、重力は、チャネルを通じて成長する根を奨励する、ペトリ皿に合わせます。

3. 治療

  1. 実験的治療
    1. 苗の開発で必要な時に、ピペットを介して 8 側のポートの各治療の所定の金額を追加することで苗に実験的治療を追加します。
    2. ペトリ皿を再シールし、成長室または窓辺に戻る。
    3. イメージングのサンプル希望時に個々 の時間ポイントをキャプチャまたはタイムラプス イメージングを開始に進みます。

4. 光学イメージング

  1. 解像度 (4-20 X) イメージングを下げる
    1. デバイスと低解像度 (4-20 X) 明るいフィールドまたは差動干渉の対照 (DIC) のイメージングの倒立明視野顕微鏡下における苗を含む全体のペトリ皿を配置します。露出時間、ランプの明るさ、絞り、そして光の極性を調整することによって関心の形態学的特徴を明らかにする照明条件を最適化します。ルートまたは関心の root hair(s) ステージ ルートと焦点の目的の領域にドライブします。
    2. 単一の時間ポイントまたは時系列の画像を取得します。根における根毛の生長を視覚化するには、分に一度成長根毛をイメージします。主根の成長を可視化するイメージング後ペトリ皿と成長室または垂直に窓辺に苗に戻り 30 分ごとに 1 つのイメージを取得は完了です。
  2. 高解像度 (20-63 X) イメージング
    1. 希望の時間には、苗が成長していたら、寒天から coverslip とデバイスを削除するのに鉗子を使用します。エタノールを用いた coverslip の下部をきれい研究所組織で湿らしました。
    2. 顕微鏡のレンズ メーカーが推奨として客観的に推奨される浸漬媒体を適用します。顕微鏡ステージ上、coverslip を置くし、目的で浸漬媒体に連絡する段階を上げます。露出時間、ランプの明るさ、絞り、そして光の極性を調整することで照明条件を最適化します。興味の root hair(s) の目的の領域、フォーカスをステージをドライブします。
      注: DIC は細胞質のストリーミングを視覚化する必要、オルガネラの動きを可視化する蛍光マーカーが必要があります。
    3. 時間をかけて毛根の毛成長を定量化するには、分ごとに 1 つのイメージを取得します。オルガネラの動きを可視化、細胞小器官から特定できる蛍光信号を保持したまま蛍光露光時間を最小限にします。露出時間の許す限り早く細胞小器官の画像を取得します。もはやタイムラプス イメージング、周囲温度および湿気を維持するために生細胞イメージング段階インキュベーターを使用します。
      注: イメージング根毛細胞内小器官のためには、63 X 石油目的の使用をお勧めします。

5. 非光学イメージング

  1. デバイスの準備
    1. 希望の時間の苗が成長していたら
デバイスおよび coverslip のシャーレから削除します。
  • デバイスを裏返し、そっと離れて皮をむく、coverslip ルート PDMS チャネル内に収まるようにします。
  • 高分解能原子間力走査型電子顕微鏡のルートの基板として PDMS デバイスを使用して続行します。
  • 走査電子顕微鏡観察
    1. 薄い沈殿物 (~ 20 nm) ルートとその周辺の PDMS デュアル銃電子ビーム蒸発室を使用しての上にクロムの層。
    2. ルートと PDMS デバイスを走査型電子顕微鏡室に転送します。
      注: は、特定のアプリケーションの目的の解像度を達成するために最適化する必要がありますイメージング条件、すなわち電圧、電流と作業距離。
  • 原子間力顕微鏡 (AFM)
    1. PDMS デバイス ルート側を AFM ホルダーをマウントします。カメラのコントラストを向上させ、PDMS からルートをより簡単に識別、AFM 試料ホルダーにデバイスをマウントする前に (などでコーティングした雲母) フラット反射基板上 PDMS 装置を配置します。
    2. PDMS デバイス上に液体も添付ファイルを確保し、根の画像中の水分を保つために水でそれを埋めます。
    3. AFM 試料ホルダーに読み込みます。PDMS デバイスの厚さ z コントロールを調整し、指導のためのカメラを使用してルートの関心領域にカンチレバーをドライブします。
    4. カンチレバーの先端にレーザーを合わせます。コンタクト モード イメージングで最良の結果、スキャン中にルートに最小限の力を発揮するのに 0.01 または 0.03 N/m のバネ定数のカンチレバーを使用します。
    5. スキャン メカニズムをゆっくりと下げるカンチレバーまでだけになりますがサンプルにお問い合わせください。目的の地域のスキャン サイズの調整、ラインあたり 256 電圧ポイント 1 行/秒のスキャン速度を選択します。スキャンを取得します。

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    結果

    ここで説明した 2 層 PDMS マイクロ流体デバイスは、メインのシロイヌナズナ根と 20 μ m の高い商工会議所横方向成長根毛 (図 1 a) を限定するため 200 μ m 高チャネルを持っています。この設計ルート径が同じような植物のとしてはシロイヌナズナと異なるサイズ.の種に合わせて容易に変更することができます。デザインには、工場の入口だけでなく、任意の必要な化学または生物学的治療のための 8 側面の入口が組み込まれています。メディア デバイスを設定しやすくなって、デバイスの周囲の寒天を注いで外部流体機器を必要とせずテスト期間のため水和ルート環境を保持します。(図 1 b)寒天は、メインのチャンネルを根の成長を奨励する垂直方向に成長する実生植物を許可するシャーレ内のデバイスを安定させます。ペトリ皿は無菌環境に含まれている苗を保持し、最大 20 倍の倍率にペトリ皿をイメージを作成するルート シス...

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    ディスカッション

    工場にチップのプラットフォームを作成するは、この資料で説明する方法は、ユニークな 2 層設計範囲単一画像平面とプラットフォームに根毛を解体し、高分解能非光学イメージングの基板として使用される可能性があります。.高分解能非光学イメージングを使用すると、単独での光イメージングから取得できませんでした植物組織に関する貴重な情報が提供できます。たとえば、AFM イメージングは開発中または特定の化学的または生物学的治療後に根組織の弾力性を計算する力測定を提供できます。同様に、SEM イメージング根組織の表面地形の高解像度の詳細を提供することができ、ケミカル イメージングによる結合組織の組成に関する情報を提供します。19このマイクロ流体システムの未来の世代は、マトリックス支援レーザー脱離イオン化-質量分光法 (MALDI-MS) とコヒーレント ・ アンチストークス ・ ラマンなど他の化学イメージング システムとの互換性のための最適化分光 (車)。

    この方法の重要な手順を含む寒天培地を使用してデバイスをセキュリティで保護し、複雑な流体フロー手順を...

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    開示事項

    著者が明らかに何もありません。

    謝辞

    この原稿が UT バテル、契約番号の下で LLC によって作成されて米国エネルギー省の 00OR22725 ・ デ ・ AC05アメリカ合衆国政府を保持し、パブリッシャー、パブリケーションのアーティクルを受け入れることによってアメリカ合衆国政府が発行または公開された形態を再現する非独占的、払込、取消不能、世界的なライセンスを保持することを認める本稿では、またはそうアメリカ合衆国政府の目的のために他の人を許可します。エネルギー省は、DOE のパブリック アクセス計画 (http://energy.gov/downloads/doe-public-access-plan) に基づき連邦政府主催、研究のこれらの結果へのパブリック アクセスを提供します。

    この作品は、ゲノム科学プログラム、米国エネルギー省、事務所の科学、生物、植物微生物インターフェイス科学分野 (http://pmi.ornl.gov) の一部として、環境研究によって部分的に支えられました。マイクロ流体プラットフォームの作製を行った中心にナノ加工研究所でのナノ相物質科学は、科学ユーザー施設 DOE のオフィスです。JAA は NSF 大学院研究員 DGE-1452154 によってサポートされて

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    材料

    この記事で使用された材料の一覧
    名前会社カタログ番号コメント
    シリコンウェーハWRS材料100mm、厚さ500-550um、プライム、10-20抵抗率、N / Phos<100>
    Quintel Contact AlignerNeutronix Quintel CorpNXQ 7500 Mask Aligner
    蛍光顕微鏡NikonEclipse Ti-U
    Laboratory tissueKimberly ClarkKimwipe KIMTECH SCIENCE Brand, 34155
    Negative Photoresist EpoxyMicrochemSU-8 2000s series
    フォトレジスト現像液MicrochemSu-8 現像剤
    トリクロロ(1H,1H,2H,2H-パーフルオロオクチル)シランシグマ Aldrich化学フードでの使用
    エアプラズマクリーナーハリックプラズマ
    PDMSダウ コーニングシルガード 184 シリコーンエラストマーベース
    PDMS 硬化剤ダウ コーニングシルガード 184 シリコーンエラストマー硬化剤
    デシケーターBel-ArtF42010-000
    メスX-actoナイフ
    バイオプシーパンチテッドペラ15110-15
    粘着テープホチキス止め インビジブルテープ
    マイクロフュージチューブエッペンドルフ
    トリトン XJ.T.Baker XI98-07
    漂白剤クロロックス濃縮
    植物由来の培地フィトテクノロジー研究所M524
    寒天テクノバA7777
    ワックスフィルムパラフィルム
    顕微鏡オリンパスIX51
    原子間力顕微鏡キーサイトテクノロジーズ 5500 PicoPlus AFM
    ペトリ皿VWR
    走査型電子顕微鏡JEOL7400
    デュアルガン 電子ビーム蒸発器サーミオニクスカスタムデュアル電子ガン 蒸発システム
    直径

    参考文献

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