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方法論記事

ビーズ ベースの涙サイトカイン解析マルチプレックス アッセイ

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⸱

DOI:

10.3791/55993

⸱

2017年10月13日

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1National Healthcare Group Eye Institute, Tan Tock Seng Hospital, 2Singapore Eye Research Institute (SERI), 3Institute of Molecular and Cell Biology, A*STAR, 4GROW Research Laboratory, Narayana Nethralaya Foundation, 5Vimta Labs Limited

この記事について

サマリー

涙映画サイトカインの解析は、様々 な眼疾患の勉強に役立ちます。ビーズによるマルチプレックスアッセイは簡便かつ高感度、少量サンプルの複数のターゲットのテストを有効にします。ここで涙映画サイトカインを使用してプロファイリングするためのプロトコルを説明ビーズ基づくマルチプレックス アッセイ。

要約

涙液膜は、潤滑、栄養、基になるセルに保護を実現、目の外部表面を覆う脂質、タンパク質やミネラルの複雑な混合物です。涙の分析は、予測、診断、および様々 な眼疾患の予後バイオ マーカーの同定のための新興エリアです。涙は簡単にアクセスできる、非侵襲的な彼らのコレクション。したがって、高度なテクノロジは変化タンパク質や代謝物組成と病態との関連を研究する涙の複数検体の同定に隆起を集めています。涙サイトカインは、眼の表面の健康を研究するための理想的なバイオ マーカーでもドライアイと春季カタルのような別の眼表面疾患のメカニズムを理解するのに役立ちます。ビーズによるマルチプレックスアッセイは、感度の高いサンプルの少量の複数検体の検出の能力を持っています。ここで涙サンプル コレクションの標準化されたプロトコルについて述べる、サイトカインは、ビーズを使用したプロファイリングの抽出と分析による多重アッセイ。

概要

涙は、涙腺と付属腺によって生成され、眼の外側の表面をコートします。涙液膜は外側の脂質層の可溶性タンパク質が含まれています内部の水層で構成され、ムチンと膜結合ムチン。涙は、微生物の侵入を防ぐため栄養素を供給し、眼の表面に潤滑を提供します。涙は、空気と角膜への酸素輸送のための組織間のインターフェイスとして機能します。1涙液層はタンパク質、炭水化物、脂質、電解質の成ってです。緑内障、ドライアイ、春季カタル、糖尿病のような眼と全身疾患との涙液タンパク質間の関連付け、甲状腺関連眼窩と癌がいくつかの研究で確認されました。2,3,4涙のサンプルが収集できるマイクロキャピ ラリー チューブまたは涙の流れストリップ (シルマー ストリップ)。また、シルマーのテストは、角膜・屈折矯正手術診療所、結果はサイトカイン解析アッセイに使用可能性があります実行される標準的な手順です。非侵襲的なサンプルのコレクション、バイオ試料のアクセシビリティと様々 な生理学的、病理学的条件と組成物を引き裂く協会作る映画いくつかの眼と全身疾患のバイオ マーカーの潜在的なソースを引き裂きます。4,5,6

サイトカインは、涙は、眼表面の健康と様々 な眼疾患の炎症性条件の研究に重要な役割を果たしています。7涙のサンプルでいくつかのサイトカインの異常な濃度は、ドライアイ、春季カタル (VKC)、アトピー性角結膜炎 (AKC)、季節性アレルギー性結膜炎、ぶどう膜炎に関連する報告されました。8,9,10,11,12,13涙液タンパク質は、質量分析法、ウェスタンブロット法・酵素抗体法 (elisa 法) のような従来の方法で分析できます。14,15しかし、これらのメソッドの制限、感度不良、各患者における複数の涙サイトカインの解析に必要なサンプル量が多い。16,17ビーズによるマルチプレックスアッセイ複雑な混合試料の複数検体を分析するために開発され正常に異なった病気で複数のサイトカインを分析する涙サンプルに適用。6,サンドイッチ elisa 法の18 A の組み合わせと流れ cytometry 技術は、単一サンプル複数検体の定量化のための ELISA よりも敏感になることこれらのアッセイを有効にします。19様々 ないくつかの病態生理学的条件における免疫応答における臨床サンプルや細胞培養上清にこの方法を適用できます。20,21,22,23,24

ELISA の試金方法の相関を報告している比較ビーズによる多重いくつか研究がなされています。トイレらに比べてビーズ レジスチン、人間の血清または血漿試料中のグレリンとレプチン、アディポネクチンの検出のため従来 elisa 法による多重アッセイをベースし、強い相関を報告 (r > 0.9)、アッセイの間。25デュポンらの il-1 β の検出ビーズによるマルチプレックスアッセイと ELISA との間の強い相関関係を報告した IL 4、IL-5、IL-6、IL-10、IFN-ϒ、TNF-α フィトヘマグルチニンでリポ多糖刺激全血妊娠中の女性から収集されます。26 ・ ピカリングら報告ヘモフィルス インフルエンザb 型多糖類に対する血清抗体の検出のためビード基づくマルチプレックス アッセイと ELISA との間別の強い相関 (r = 0.96)、のトキソイド破傷風(r = 0.96)、およびジフテリア(r = 0.91)。27ビアジーニら報告高い正の相関 (r = 0.852) 基づくビーズ マルチプレックス アッセイと炭疽アンチ PA の IgG 血清試料中の検出のための ELISA の間。28王ら報告アミロイド β 42 のアルツハイマー病バイオ マーカーの検出のためビード基づくマルチプレックス アッセイと ELISA の相関 (r = 0.77)、総タウ (r = 0.94)、およびアミノ酸 181 にリン酸化タウ (r = 0.82) で脳脊髄液のサンプル。29これらの研究はビーズの適用によるマルチプレックスアッセイ様々 な有望なビードによるマルチプレックスアッセイを作る臨床サンプル、小さいサンプル ボリュームの要件、標準的な elisa 法との相関を示しています。異なる疾患表現型のサンプルの型が異なる場合の複数検体の検出のための従来の ELISA 法に代わる。ここでサイトカインのシルマー ストリップを使用して健康な被験者から集められた涙サンプルの 41 検体プロファイリングのビーズによる多重試金のための標準化されたプロトコルについて述べる。

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プロトコル

、シンガポールのタン ・ トク ・ セン病院倫理委員会で承認された本研究で使用するプロトコル

。

1 涙サイトカイン解析

  1. 涙のコレクション:
    1. 試験椅子座ると彼/彼女の頭はヘッドレストを配置する件名をお願いします。
      2. 。
    2. 見て、慎重に開いて (ワットマン濾紙号 41 製) シルマー ストリップ ストリップの丸い端を眼の下の円蓋に置き、5 分間目を閉じて主題を指示する対象を求めます。涙を収集しながら、眼の表面の接触を最小限に抑えるため細心の注意を取る。 30
    3. ストリップを削除し、滅菌 1.5 mL 遠心チューブに彼/彼女の目を開いて件名をお願いします。サイトカインのプロファイリングのテストまで研究室または-80 o C でストアにチューブをすぐに転送します
      4. 。
  2. Tear サンプル涙流れストリップからの溶出:
    1. 涙流れストリップを (テストする涙の量を標準化) に 0.5 cm の長さにカットし、滅菌 1.5 mL 遠心チューブに配置
      2. 。
    2. 追加 30 μ l
    3. 別 1.5 mL 遠心チューブに上清を移すし、ストリップを破棄します。氷の上の管を含んでいるサンプルを置き、サイトカイン プロファイリング溶出 tear サンプルをすぐに利用します
      4. 。
  3. 試薬の調製:
    注: ビーズ基づくマルチプレックス アッセイによって各サンプルでテストされる 40 の 1 つがインターロイキン (IL)-1 α、il-1 β、IL Rα、IL-2、IL 3、IL 4、IL-5、IL-6、IL-7、イリノイ 8、IL 9、IL-10IL 12 p40、IL 12 p70、IL-13、IL-15、IL-17A インターフェロン-α IFN (インターフェロン-α) 2、IFN-γ-γ-誘導マクロファージ由来のタンパク質 10 (IP 10, CXCL10)、ケモカイン (MDC)、マクロファージ炎症性タンパク質 (MIP)-1 α と MIP 1 β、単球走化性タンパク質 (MCP)-1、MCP-3、腫瘍壊死因子-α (TNF-α)、TNF β、増殖に制御される遺伝子 (GRO)、腫瘍増殖因子アルファ (TGF-α)、血管内皮増殖因子 (VEGF)、上皮成長因子 (EGF)、繊維芽細胞成長因子 (FGF)-2、血小板由来成長因子 (PDGF)-AA、PDGF-AB/BB、顆粒球コロニー刺激因子 (G-CSF)、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子 (GM-CSF)、エオタキシン フラクタルカイン、可溶性の CD40 リガンド (sCD40L)、Fms のようなチロシン キナーゼ 3 配位子 (フェルマーの最終定理-3 L) 起動時に規制されており、通常 T 細胞発現し、分泌 (RANTES)。
  4. 部屋の温度 (20-25 o C) と渦に抗体ビーズ溶液 (50 X) バイアル 1 分のバイアルをもたらす
    1. アッセイに必要な井戸の数をカウントし、合計抗体ビーズ カクテル溶液 (25 μ L/ウェル) とアッセイに必要な各抗体ビーズ溶液 (50 X) の量を計算します
      2. 。
    2. は、希釈ビーズの残りの金額を追加することによって目的の最終的なボリュームに各抗体ビーズ ソリューションおよび塗りつぶしの金額を追加することによってカクテルのソリューションを準備します。各抗体のカクテルでの最終濃度が 1 X であることを確認します。少なくとも 20% を常に準備ピペッティング エラーの場合カクテル ソリューションの余分なボリューム
      。 注: 例として、96 ウェルの試金のための準備抗体ビーズ カクテル溶液の 3000 μ L。各抗体ビーズ ソリューションの必要量 = 3000/ストック濃度各抗体ビーズ ソリューション;3000/50 = 各抗体ビーズ ソリューション
      1. 41 抗体ビーズ ソリューションのそれぞれの追加 60 μ L の 60 μ L (60 × 41 = 2460 μ L) カクテルにボトルし、最終の 3000 μ L にする抗体ビーズ混合物にビーズの希釈溶液の 540 μ L を追加実用的なソリューション (1 X).
      2. ミックス ビーズ カクテル ソリューションが適切使用、する前に。アッセイは最大 30 日間の 2 8 o C で残りのボリュームを保存後
        3. 。
    3. 1 QC や QC 2 株を 250 μ L の脱イオン水を追加することによって品質管理 (QC) を準備します
      4. 。
    4. ミックスが適切数回ボトルを反転して渦 10 s. 転送のためにソリューション ポリプロピレン マイクロ遠心チューブ用に正しくラベルし、最大 30 日間使用できる-20 ° C で残りの溶液を保存します
      5. 。
    5. 10 X 30 mL に 270 mL の脱イオン水を加えて洗浄バッファーの準備は緩衝液を洗浄し、よく混ぜる (希釈する前に部屋の温度に 10 X バッファーをもたらすと混合することによってすべての塩の析出物を溶解)。30 日間使用することができます 2-8 ° C で未使用の洗浄バッファー (1 X) を格納します
      6. 。
    6. は、ストックのバイアルに 250 μ L の脱イオン水を追加してヒトサイトカイン標準在庫 (すべての検体 10,000 pg/mL) を準備します。いくつかの時間と渦 10 バイアルを反転で混ぜる米 10 分間放置し、ポリプロピレン マイクロ遠心チューブ用に正しくラベルに原液を転送すること。アッセイ後-20 ° c は、30 日間使用することができます残りの溶液を格納します
      7. 。
    7. 割増シリアル希薄によって作業ヒトサイトカイン標準を準備 (50 μ L - > 200 μ L)、2000 を取得するアッセイバッファーで 400、80、16、および 3.2 pg/mL
      8. 。
    8. 標準的な準備の後 60 分以内の作業標準を使用し、空白/背景としてアッセイ バッファーを使用 (-pg/mL).
  5. マルチプレックス アッセイを用いたサイトカインがビーズでプロファイリング:
    1. 96 ウェル マイクロ プレートにそれらを追加する前に 5 〜 10 秒の室内温度と渦にすべての試薬をもたらします。O C 試金、前に氷上冷凍涙抽出物を解凍し、1000 X g で 5 分間遠心分離機-80 で溶出涙サンプルが格納されている場合
    2. ヒトサイトカイン基準を操作するための垂直方向の設定で分析作業シートを準備 [0 (空白)、3.2、16、80、400、2,000、10,000 pg/mL] QC1、QC2 とサンプル
      3. 。
    3. それぞれに洗浄バッファー X 1 の追加 200 μ L プレートのプレート シーラーでは封印、室温 (20-25 o C) 10 分でプレート シェーカーでそれを維持
    4. プレートを反転して 1 X 洗浄バッファーをデカントし、タップそれ吸水タオルに数回井戸の洗浄バッファーの任意の残留量を削除します
      5. 。
    5. 各作業ヒトサイトカイン標準、QC1、QC2、空白の追加 25 μ L を (アッセイバッファー) と適切な井戸にサンプル
      6. 。
    6. 追加 25 μ L を各ウェルにアッセイバッファー
      7. 。
    7. 1 X の追加 25 μ L 抗体ビーズ カクテル溶液を各ウェルに。抗体ビーズ溶液は光に敏感、プレート板シーラーでシール、アッセイ中光からそれを保護するためにアルミ箔でカバーします
      8. 。
    8. 4 o C 一晩シェーカーでプレートをインキュベートします
      9. 。
    9. は、自動磁気プレート ワッシャー プレート ラックに板を配置します。井戸の底で磁気ビーズを解決し、よく内容を吸引する 1 分間座ってみましょう。200 μ L/ウェル洗浄バッファーを追加し、1 分間座っているし、よく内容を吸引せてください。もう一度洗浄を繰り返します (プレート洗浄、次のキットの製造業者 ' の指示).
    10. 各検出抗体ソリューションの追加 25 μ L まあ、プレート シール、アルミ箔でカバー、シェーカーで 60 分間室温でインキュベートします
      11. 。
    11. 追加 Streptavidi の 25 μ L各ウェルに n フィコエ リスリン ソリューション プレート シール、アルミ箔でカバー、シェーカー上で 30 分間室温でインキュベートします
      12. 。
    12. は、洗濯機は磁気プレートにプレートを配置します。それは 1 分間座っているし、よく内容を吸引してみましょう。200 μ L/ウェル洗浄バッファーを追加します。それは 1 分間座っているし、よく内容を吸引してみましょう。もう一度洗濯を繰り返します
      13. 。
    13. もそれぞれ、抗体ビーズを再懸濁しますに室温で 5 分間シェーカーにプレート シース液の追加 150 μ L.
    14. は、ビーズを使って直ちにプレート ベース多重アッセイ プレート リーダーを読むし、5 パラメーター曲線近似アルゴリズムを用いたサイトカイン濃度を分析します。涙サイトカイン プロファイリングのフロー図は、 図 1 に示す
      15. 。
  6. アッセイ プレート (楽器を設定) とデータ分析を読む:
    1. ビーズのスイッチ ベースの多重アッセイ リーダーと前暖かい 30 分レーザー
    2. は、ビーズによる多重分析ソフトウェアを起動します。下で、' 自動メンテナンス ' タブを選択し、' 校正検証 ' オプション。各試薬は 30 s の場所 5 の校正及び検証のビーズのバイアル渦滴各試薬指定の井戸に。脱イオン水、70% エタノールで指定された貯水池を埋める
      3. 。
    3. 新しいプロトコルを作成する
      1. を開く、' プロトコル ' ページし、' プロトコル ' タブをクリックします " を作成する新しい ProtocolŔ、' 設定 ' タブが開きます
        2. 。
      2. で、' 名 ' ボックスに、プロトコルの名前を入力します
        3. 。
      3. の右側のボックスに説明を入力、' 名前 ' ボックス
        4. 。
      4. で、' バージョン ' ボックスに、プロトコルのバージョンを入力します
        5. 。
      5. で、' メーカー ' ボックスに、プロトコルの製造元の情報を入力します
        6. 。
      6. 定義の設定、' 取得設定 ' 次のようにセクションします。設定 ' ボリューム ': 100 μ ' タイムアウト ': 60 s;' DD ゲート ': 8,000 に 15,000;' レポーター利得 ': 標準的な光電子増倍管;' 型ビーズ ': 磁気ビード
        7. 。
      7. 定義の設定、' 分析の設定 ' セクションでは、選択する ' 定量 ' 分析の種類として。設定 ' 規格番号 ': 6;' コントロールの数 ': 0;ダニ、' 複製の意味 ' ボックス;
        ダニ、' サンプルを取得しながら結果の分析 ' ボックス
        8. 。
      8. をクリックして " NextŔ、' 検体 ' タブが開き、検体番号付きグリッドの目的検体 (ID ビーズ) をクリックします
        9. 。
      9. クリック アンド タイプに対応する試料名、' 名 ' 試料グリッドの右側にある列 (検体 ' 名とその対応するビーズ地域の詳細については、表 1 に記載された).
      10. クリックで (すなわち pg/mL) の測定単位を入力、' ユニット ' の左にあるボックス、' すべて適用 ' ボタン。クリックして " すべて適用 ".
      11. クリック アンド タイプ希望のビーズで (すなわち 50) 各試料のカウント、' カウント ' ボックス。クリックして " のすべてを適用 ".
      12. クリック " NextŔ プレート レイアウト] タブが開きます。基準と選択のための井戸を強調 " 2 " 下でカウントを複製しをクリックして、" S " 標準のボタン。背景にこの手順を繰り返します " B " とサンプル " U " 井戸
        13. 。
      13. をクリックして " を保存 ".
    4. 新しい基準/コントロールの多くを作成
      1. オープン、' プロトコル ' ページ、そして、' 標準 & コントロール ' タブをクリックします " 新しい標準/コントロール多くの作成 ".
      2. オープン、' プロトコルの選択 ' ボックス。1.5.3 のステップで作成したプロトコルを選択します
        3. 。
      3. 規格の情報に応じてキー: Std/Ctrl キット番号、Std/Ctrl キット名、有効期限、および製造元
        4. 。 各検体 (すなわち 10000 pg/mL) の最も高い標準の値でキーを
      4. 。希釈下 5 で鍵をつけ " すべて適用 " 予想される濃度基準の残りの部分を自動的に生成する.
      5. をクリックして " を保存 ".
    5. 既存のプロトコルからの新しいバッチを作成する
      1. オープン、' バッチ ' ページし、クリックして " 既存のプロトコルから [新しいバッチ] タブを作成 " です
        2. 。
      2. にバッチ名を入力、' バッチ名 ' のバッチについての説明を入力、' オプションの説明を入力してください ' ボックス
        3. 。
      3. 以前 (手順 1.5.3) で生成されたプロトコルをクリックします
        4. 。
      4. クリックして " を開く次のタブは、NextŔ、' 性感染症 & Ctrls ' タブ表示測定基準および選択の詳細 " 次 ".
      5. に、' プレート レイアウト ' タブ、このバッチのよくコマンドを割り当てるし、クリックして " 保存 " バッチ情報を保存、' 保留中のバッチ ' リスト
        6. 。
      6. は、ビーズによる多重アッセイ プレート リーダーにプレートを読み込む 5 分振る、保留中のバッチ リストからバッチを実行します。取得したデータを .csv ファイル形式で保存されます
        7. 。
  7. データ解析
    1. rbx の変換ソフトウェアを使用して .rbx の結果データ (ファイル) の形式に基づくビーズ マルチプレックス アッセイ ソフトウェアから生成された .csv ファイルを変換します。変換ソフトを起動選択 xPONENT ファイル下 .csv ファイルを選択し、クリックして、、" を生成する " ボタン;.rbx ファイルは、選択した出力フォルダーに保存されます
      2. 。
    2. 解析ソフトウェアを起動し、.rbx ファイルを開きます
      3. 。
    3. 4 pl/5PL カーブ フィットを使用して標準的な曲線を最適化します。
      1. 選択で次、' 標準曲線 '] タブ: ' 回帰型 ': ' 物流 5PLƆ ' 軸変換 ': ' ログ - 線形 (y) Ɔ ダニ、' 濃度範囲線を表示 ' ボックス; ダニ、' 表示不明なサンプル ' ボックス。ダニ、' 表示コントロールのサンプル ' ボックス。ダニ、' すべての検体に適用 ' ボックス。ダニ、' ショー レポート最適化後 ' ボックス
        2. 。
      2. をクリックして、" 最適化 " 自動最適化のためのボタン
        3. 。
    4. ラベルの下でサンプルの id ' サンプル情報の入力 '] タブ
    5. で観察された濃度を取得、' レポート テーブル ' タブし、クリックして、" レポート テーブルをエクスポート " さらに分析用のスプレッドシート ファイルにデータを生成します
      6. 。

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結果

涙流れストリップを使用して 4 健常者の 8 件目から採取した涙とサイトカイン レベルは、上記のプロトコルを使用して分析しました。すべての被験者は男性および 4 人の被験者の年齢は 36、42、44、52 歳それぞれ。眼表面の健康とドライアイ疾患を評価した臨床試験 (涙映画解散時間、シルマー テスト、角膜染色、結膜染色、蓋/マイボーム腺検査、角膜の涙徴候と視覚的な兆候と症状) によると、国際ワーク ショップ目乾燥、2007 年ガイドラインおよび科目のどれも任意の徴候やドライアイの症状を示した。31

分析 41 サイトカインのうち 31 サイトカインが検出しました。 すべての涙のサンプルで IL 17A、MIP 1 β、TNF α が 4 科目の 7 目で IL 4 は IFN-γ は IL-1 a 3 subj の 5 目で検出された 3 科目の 6 の目で検出された 4 学科の 6 の目で検出されました...

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ディスカッション

サイトカインは、小さな細胞から分泌されるタンパク質と免疫応答を調節する強力な免疫変調器です。32涙目と病気の発症のメカニズムを理解し、眼の健康の状態を判断するために役立つプロファイル サイトカインに関する研究の様々 な病態に関連しているサンプルで様々 なサイトカインの発現疾患の重症度、診断と進行。2,5低蛋白質濃度と小さなサンプル ボリューム涙サイトカインの分析のための ELISA のような試金の使用を制限する従来の方法の主要な課題であります。33ビーズによるマルチプレックスアッセイが免疫は、elisa 法に明確な利点があります。ビーズによるマルチプレックスアッセイ複数検体の分析のため少量のサンプルを必要とする、機密性の高い、体液蛋白質の picogram 濃度の検出が可能です。34

ここでビーズ基づくマルチプレックス アッ...

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開示事項

著者が明らかに何もありません。経済的利害関係や利害の対立はありません。

謝辞

研究活動は、タン ・ トク ・ セン病院個別のシード資金調達プログラム 2015; からセンターの助成金によって支えられました。シンガポールの目の研究所パイロット助成と基金のタン ・ トク ・ セン病院ピッチを付与します。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
Milliplex MAP ヒトサイトカイン/ケモカイン磁気ビーズパネル -1 kitMerck, USAHCYTOMAG-60K-41
Flexmap 3D luminex instrument Luminex Corp, Austin, TX, USA
xPonent software Luminex Corp, オースティン, テキサス州, 米国
RBXGenerator ソフトウェアBIO-RAD, フランス
Bio-Plex Manager 6.1BIO-RAD, フランス
プレート シェーカーコーニング, 米国
TECAN マイクロプレート ウォッシャーTecan, スイスHydroSpeed
Vortex Genie 2Scientific Industries inc, 米国G560E
ピペットメトラー・トレド、カリフォルニア州、米国
1.5ml 微量遠心チューブAxygen、米国MCT-150-C
シルマー 涙流試験ストリップアイケア&キュア、米国101657
Flexmap 3D キャリブレーションキットLuminex Corp、米国テキサス州オースティン40-028
Flexmap 3D 検証キットLuminex Corp、米国テキサス州オースティン40-029
眼科用検査用アームチェア

参考文献

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