ひと臍帯血由来の血管内皮前駆細胞の分離

サマリー

このプロトコルの目的は、臍帯血由来の血管内皮前駆細胞を分離することです。一部のアプリケーションは虚血性疾患の治療、心血管のリスクを持つ患者を識別するためのバイオ マーカーとしてこれらの細胞を使用して、作成組織設計の血管や心臓の弁を構築あります。

要約

末梢血血管内皮前駆細胞 (Epc) の存在とその血管関与 Ashara と同僚¹によって報告されました。後で、他の人は骨髄^2,3から発信された Epc の類似の種類の存在を記載されています。最近では、ヨーダとイングラム臍帯血由来の Epc を示した可能性があった、高い増殖大人周辺から分離されたものと比較して血の^4,5,6。生後の発生に関与しているから離れて Epc また組織設計血管や心臓弁構造^7、8を作成するための細胞源として約束を示しています。様々 な隔離のプロトコルが存在、内皮細胞および造血のマーカーの助けを借りて、上記のソースから派生した単核細胞 (多国籍企業) のセルの並べ替えや養殖専門内皮増殖とこれらの多国籍企業を含むいくつか媒体、またはこれらの技術⁹の組み合わせ。ここでは、隔離のためのプロトコルを提案する、Epc を使用しての文化専門血管内皮成長因子、西部にしみが付くことを使用して隔離されたセルの特性評価に続いて immunosorting を使用せず培と免疫染色。

概要

いくつかの調査官は、特性と人間 Epc^{5,10、11,12,13}の可能性を勉強しています。Epc は、循環血管内皮組織低酸素、虚血、外傷、あるいは腫瘍形成のサイトに従うし、新しい血管構造^4,14の形成に貢献する能力を持っている細胞として記述することができます。観測へ生後発生の形での血管新生の関与は、これらの細胞とその治療への応用^4,15,の病態生理の理解につながっている¹⁶. 心血管の病理学^9,15,16,17,と^{18,19 相関する個々 の Epc の数が示されています。 ,20}。他の研究も Epc を弁線維芽細胞のような表現型に分化して組織工学心臓弁^7、21のこれらの細胞を使用できることを提案しました。

調査⁴間の不一致のための Epc を分離するために必要な特定の細胞表面分子が明確に識別されていません。いくつかグループ^1,17,22,23, Epc の推定される可能性があることを示唆によって実行された多国籍企業のさまざまな培養条件への露出で、特定のマトリックスへの接着異なる表現型プロパティを表示します。これらのプロパティには、貪食能力、マトリゲル、管形成と Dil アセチル化低密度リポタンパク質の摂取量の不足が含まれます。高いクローンと増殖能は、どの Epc と階層化された⁵をすることができます 2 つのプロパティです。Epc はまた⁴ひと胎児肺線維芽細胞の遊走と、体外に尿細管を形成できます。これらの細胞は、血管内皮細胞表面マーカーを表現して造血マーカー^13,24,25のいくつかを共有するために知られています。フェノタイピング Epc の広く受け入れられている積極的に表現されたマーカーは CD31 CD34、血管内皮増殖因子受容体 2 (VEGFR2)、フォン ・ ヴィレブランド因子 (vWF)、CD133、c キットと血管内皮細胞のカドヘリン (VE カドヘリン)^4,18. 共同 CD90、CD45、CD14、CD115、または α-平滑筋アクチン (α SMA) を発現する細胞が貪食、細菌およびde novo人間を形成することができない限られた増殖、潜在的な能力のため Epc をするとは見なされません船生体内で^4,7。この資料では、プロトコルをソートの任意のセルを必要とせず人間の臍帯血から血管内皮前駆細胞の分離のための修正されたプロトコルについて説明します。この記事の負のインジケーターとして α SMA との肯定的なマーカーとして VEGFR2、CD34、CD31 を使いました。

この記事での分離及び細胞を使用して選別することがなく臍帯血由来の血管内皮前駆細胞を培養法特化成長因子 (EGM) と内皮増殖培を提案する.この EGM には、血管内皮増殖因子 (VEGF) と線維芽細胞成長因子 (FGF)、生存、増殖、および内皮細胞²⁶の移行を強化が含まれています。セルの石畳の形態を維持するために責任があるアスコルビン酸も含まれていますインスリン様成長因子-1 (IGF-1 の)、血管新生と渡り鳥関数を提供します。成長因子の長期的な安定性の向上は、中型²⁶ヘパリン。血管内皮細胞の培養液に追加他の成長因子には EGF^{26 に細胞の感受性を高める、ヒドロコルチゾンと分化、細胞増殖を刺激するのに役立ちます表皮の成長因子 (EGF) の補充が含まれています}.この特定の成長媒体の使用の Epc 内皮細胞基本培地 (EBM) またはダルベッコ変更イーグル培地 (DMEM) と比較して高い数値を生成することを示す.

プロトコル

アーカンソー制度検討委員会 (承認番号 16-04-722) の大学の承認を得て本研究を行った。クエン酸リン酸ブドウ糖 (CPD) ソリューション アーカンソー臍帯血バンクでの臍帯血の単位が採集し、ストレージの要件を満たしていないユニット研究寄付しました。臍帯血の単位が周囲温度でコレクションの 24 h 内のラボに取った

。

1 臍帯血から血管内皮前駆細胞の分離

1. 試薬の準備。。
   1. インスリン様成長因子 (IGF) の 20 ng/mL、1 μ G/ml アスコルビン酸、5 ng/mL 組換えひと上皮増殖因子 (rhEGF)、22.5 μ G/ml を添加した内皮細胞基本培地 (EBM) を 10% 牛胎児血清 (FBS) に追加することで EGM を準備ヘパリン、および 0.5 ng/mL 血管内皮増殖因子 (VEGF)、10 ng/mL 組換えひと線維芽細胞成長因子 B の (rhFGF-B)、0.2 μ g/mL ヒドロコルチゾン 2% ペニシリン-ストレプトマイシン-グルタミンと。0.2 μ m ポリエーテルサルホン (PES) 膜の真空フィルターを用いた培養培地を滅菌します
   。
   2. 準備ラットの尾私コラーゲン液 0.02 N 酢酸を使用して 50 μ g/mL の濃度で。0.2 μ m のシリンジ フィルターを使用してこのソリューションを滅菌します
   。 準備されたラットの 2 mL で
   3. 前コート 6 ウェル プレートは私に各ウェルのコラーゲン溶液を尾します。播種前に 5% CO ₂ 1 h 以上の 37 ° C で維持されるインキュベーター内に配置します
   。
   4. 臍帯血とハンクス平衡塩ソリューション (HBSS) 1:1 の濃度の約 25 mL の希釈します
   。
   5. 準備ラジオ免疫沈澱試金塩化ナトリウム 150 mM、1% トリトン X-100, デオキシ コール酸ナトリウム 0.5%、1 mM の β-グリセロリン酸、0.1 %sds と 50 mM トリス (pH 8.0) を使用して (RIPA) バッファーします
   。
2. 血管内皮前駆細胞の単離。
   1. 暖かいすべて準備隔離前の 37 ° C で維持水浴の試薬
   。
   2. 密度勾配中の試薬の 20 mL を 50 mL の遠心管に追加します
   。
   3. 慎重にチューブの側の壁に向かってピペットを目指すことでこの層を壊すことがなく密度勾配媒体を含む遠心管中の希薄臍帯血 20 mL をレイヤーします
   。
   4. は、オフ遠心ローターのブレーキと、室温で 30 分間 800 × g で遠心分離によって血液の密度 ( 図 1) に基づくコンポーネントを区切ります。異なるレイヤーを邪魔しないでください
   。
   5. は、慎重にピペット チップが MNC に到達できるまでのレイヤー層 ( 図 1 を参照)、他のセルを乱すことがなくチューブからそれをピペッティングによるプラズマ層を削除します。削除されたプラズマを破棄します
      。 注: プラズマを削除するピペット チップを使用している間プラズマ MNC 層擾乱を抑える ( 図 1) の上の小さい層のままにします
   。
   6. 18 g 針に装着する注射器を使用して多国籍企業を含むバフィー コートを収集し、新鮮な遠心管にそれを転送します
   。
   7. EBM の等量に追加収集した遠心多国籍企業これらの管 500 × g 10 分間で 4 ° c. 破棄上澄み。
      。 注: 細胞ペレットが表示されます赤い赤血球・赤血球の存在のため
   。
   8. は、赤色の血液細胞を溶解する塩化アンモニウム溶液 5 mL を追加します。時折揺れとの 5-10 分のための氷にこのチューブをインキュベートします
      。 注: 注意が必要このステップの間に時間の長さを超えないように多国籍企業に有害することができます
   。
   9. (500 g) x 4 ° C で 10 分間のチューブを遠心分離し、上澄みを廃棄します。赤血球が持続する場合手順を繰り返して 1.2.8 と 1.2.9 ペレットでは赤い色は認められなかった
   。
   10. 準備 EGM でペレットを再懸濁し、多国籍企業をカウントするため、検定を使用します
   。
   11. 吸引ラット尾私 (ステップ 1.1.3) からのコラーゲン膜 6 ウェル プレート、リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) × 1 で 3 回洗浄します
   。
   12. 種子 1 x 10 ⁷ 各ウェルの多国籍企業の濃度のコラーゲン プレートに EGM で再停止される多国籍企業ペレットです。37 ° C、5% CO ₂ インキュベーターにそれを配置します
   。
   13. 後 24 h、培地を吸引、EGM で一度洗浄します。各ウェルに EGM 培地 3 mL を追加し、37 ° C、5% CO ₂ インキュベーターに戻した
   。
   14. は、毎日 7 日間新鮮な EGM 媒体とプレートを補充します。7 日後 EGM 媒体に他の毎日を変更します
   。
   15. 血管内皮細胞コロニーの進行を追跡するため、毎日 6 ウェル プレートの画像を取る明視野顕微鏡を用いたします。マーク プレート、コロニーが彼らの成長を追跡するため発生します
       。 注: それは通常文化に表示する植民地、5 ~ 9 日かかります
   。
3. 血管内皮前駆細胞の拡張。
   1. コート T-25 培養用フラスコのラット尾私のコラーゲン (50 μ g/mL) 37 ° C、5% CO ₂ インキュベーター、少なくとも 60 分吸引それを置くし、T-25 細胞培養用フラスコ、細胞を播種する前に 1x PBS で 3 回洗う
   。
   2. は、各ウェルに 0.05% トリプシン EDTA 溶液を 150 μ l 添加を使用サイズ約 3 mm に達すると内皮細胞コロニーを trypsinize します。6 ウェル プレートを 37 ° C、2-3 分のため 5% CO ₂ インキュベーターに配置
   3. は、添付の細胞を除去する 6 ウェル プレートを軽きます。すぐに EGM の 2 mL を加えて 15 mL 遠心管の細胞を回復します
   。
   4. 診断を使用してセルをカウントし、初期播種密度を計算します
   。 400 x g で 5 分間
   5. スピン 15 mL 遠心管は EGM で細胞ペレットを再懸濁しますで 〜 500,000 細胞 T-25 フラスコをシードします。通路 1 としてこのフラスコをマークし、37 ° C、5% CO ₂ インキュベーターに戻って T-25 フラスコを配置します
      。 注: セルは EGM の成長を比較する EBM と DMEM でめっきすることをがします
   。
   6. さらに通路のフラスコでは、90% の合流点に達すると、手順 1.3.1 - 1.3.5 と T-75 または T-175 細胞培養フラスコに 10 の ⁴ セル/cm ² で細胞を再シードします。隔離されたセル (手順 2 および 3) の評価に進みます
   。

2。隔離されたセルを使用して西部にしみが付く特性

隔離されたセルを特徴付ける拡張手順に従うときすべての通路に

1. 追加 50-100 μ L の換散バッファー。約 500,000 以上の細胞から蛋白質を収集します
。
2. の細胞を破壊し、蛋白質を解放する精力的にピペットを上下。収集し、遠心管にバッファーを転送します
。
3. は 500 × g で遠心管を回転し、新しい微量遠心チューブに上清を慎重に転送します。ラベル付けし、長期保存用-80 ° c チューブを保存します
。
4. いずれかのブラッドフォードを使用して各チューブの蛋白質の量を定量化する ' s または BCA アッセイ ^{27 , 28 , 29}
。
5. は、ウエスタンブロット標準手順 ^{27 , 28 , 29} を使用して実行します。総蛋白質 CD31、CD34、VEGFR2、α SMA の表現のための 5 μ g を分析します。データの正規化のため α-チューブリンを使用します
。

3。間接蛍光抗体法

1. 50% エタノールで 18 mm ガラス coverslips に超音波を照射して乾燥させる。それらを殺菌する光 uv クリーン coverslips を残すバイオ セーフティ フードで一晩 12 ウェル プレートで
。
2. コート 50 ・ #18 と coverslips1; グラム/mL のラットの尾私のコラーゲンと 37 ° C, 60 分、少なくとも 5% CO ₂ インキュベーターにプレートを転送
3. は、コラーゲンを吸引し、洗浄、coverslips に 12 ウェル プレートに 1 mL の 1x PBS を追加します。1 × PBS を吸引し、2 回繰り返します
。
4. シード 250,000 培養も 37 ° C では、免疫染色を行う前に、少なくとも 3 日間 5% CO ₂ インキュベーターに戻ってそれらの場所で Epc
。
5. 1x PBS で 3 回洗浄します。各ウェルに冷たいメタノール 1 mL を追加し、セルを修復するのに 15 分間、室温でインキュベートします
。
6. は、標準プロトコル ^{27 , 28 , 29} を使用して染色を行います。抗体を使用して、彼らの適切な希薄で (例えば CD31 (1:20)、CD34 (1:50)、α SMA (1: 100) と VEGFR2 (1:50)).
7. 落射蛍光顕微鏡を用いた immunostained coverslips の画像を撮影します
。

結果

分離と血管内皮前駆細胞の拡張:
総合的なプロトコルを描いた模式図 (図 1) を提供します。次の密度勾配媒体でひと臍帯血の密度勾配遠心法別の血コンポーネント レイヤーが観察されました。コラーゲン治療プレートに多国籍企業を播種時にコロニーの副産物が最初日 5 と 7 (図 2A) の間観察されました。これらの植民地は成長を続け、石畳のような形状 (図 2E 2 階) に進んで後初期の段階で紡錘形細胞の形態 (図 2A 2 D) を持っていた。図 3A文化、時間対セルの合計数を示しています、各データ ポイント...

ディスカッション

前述したように、付着性の Epc は、石畳の形態を所有しています。私たちの孤立した多国籍企業から進歩した紡錘形細胞コロニー (図 2A 2 D) 初期段階で石畳の植民地 (図 2E 2 階) に 10 日間の培養期間。Epc ラベル付けされている異なる研究グループによって異なる後期の血管内皮前駆細胞の¹⁰、としてすなわち内皮細胞コロニー形成細胞⁵、または血管内皮前駆細胞¹²。それは、これらの細胞は機能的に同じと類似の細胞表面マーカーを表現こと注意してください。ほぼ 10⁸セル、前の出版物に類似して、Epc^3、5の高い増殖能の典型的な増資文化期間 (

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
A) 分離および培養用
EGM-2 BulletKit	ロンザ	CC-3162	この製品には、内皮成長培
ウシ血清	サーモフィッシャー サイエンティフィ	26140079
ペンシルリン-ストレプトマイシン-グルタミン (100x)	サーモフィッシャー サイエンティフィ	10378016を作るために必要なすべての成長因子が付属しています
Ficoll-Paque	GE Heatlhcare	17-1440-02
Hank's Balanced Salt Solution	Thermofisher Scientific	14170-112
Ammonium Chloride	Stem Cell Technologies	7850
1x Phosphate Buffer	Saline Thermofisher Scientific	14190250
Rat Tail I Collagen	Corning	354236
氷酢酸	Amresco	0714-500ML
0.05% トリプシン-EDTA	サーモフィッシャー サイエンティフィック 25300054
HEPES バッファー	サーモフィッシャー サイエンティフィ	15630080
ダルベッコ モディファイド イーグルス ミディアム	サーモフィッシャー サイエンティフィ	10566-016
B) 抗体および細胞溶解物
CD31	Abcam	ab28364	1:250希釈  ウェスタンブロッティング
用 CD34	Santa Cruz Biotechnology	sc-7045	1:100 ウェスタンブロッティング
用希釈&α;-SMA		abcam ab5694	1:100 ウェスタンブロッティング
用希釈&α;-tubulin	abcam	ab7291	1:2,500 ウェスタンブロッティング用
VEGFR2	abcam	sc504	ウェスタンブロッティング
ヒト臍帯静脈内皮細胞溶解物	サンタクルス	バイオテクノロジーsc24709
バルブ間質細胞ライセート			初代細胞株を自身の研究室で培養し、RIPAバッファー
で溶解<ストロング>C) ウェスタンブロッティングおよび免疫染色
10x トリス/グリシン/SDSバッファー	Biorad	161-0772	ランニングバッファーとして使用
10x トリス/グリシンバッファー	Biorad	161-0771	トランスファーバッファーとして使用
Immobilon-FL転写膜	Merck Millipore	IPFL0010	これは、45 µmの細孔のサイズは、ウェスタンブロット膜としてプロトコルに記載されています
4x Laemmli サンプルバッファー	Biorad	161-0747
2-mercaptoethanol	Biorad	161-0710
10% 基準 TGXプレキャストゲル	Biorad	5671033
Prolong Gold 退色防止	Thermofisher Scientific	P36930	長期保存のための免疫染色カバースリップの取り付けに使用されます
メタノール	VWR分析	BDH1135-4LP