このコンテンツを表示するには、JoVEへの購読が必要です。 または、無料トライアルをお申し込みください。

方法論記事

高速液体クロマトグラフィー分析とシナプトソーム ドーパミンによるマウスにおけるドーパミン作動性恒常性の評価

11.9K 閲覧数

⸱

DOI：

10.3791/56093

⸱

2017年9月21日

 ,  ,  ,  , 
1Molecular Neuropharmacology and Genetics Laboratory, Lundbeck Foundation Center for Biomembranes in Nanomedicine, Department of Neuroscience and Pharmacology, Faculty of Health and Medical Sciences, University of Copenhagen, 2Laboratory of Neuropsychiatry, Psychiatric Center Copenhagen and Department of Neuroscience and Pharmacology, University of Copenhagen

この記事について

サマリー

シナプトソーム ドーパミンやドーパミン ・ トランスポーターの機能と線条体組織中ドパミンのレベルを評価することによりマウスにおけるドーパミン恒常性を調査するため高速液体クロマトグラフィー分析を表す実験ツールそれぞれ。ここでドーパミン組織量を測定、ドーパミン ・ トランスポーターの機能を評価するプロトコルを提案する.

要約

ドーパミン (DA) は、運動、報酬プロセスおよび認知機能の制御調節神経伝達物質です。(ドーパミン) ドーパミン作動性神経伝達の障害がパーキンソン病、注意欠陥・多動性障害、薬物中毒1,2 などいくつか中枢神経関連疾患に強く関連付けられて ,3,4。DA の不均衡を含む疾患のメカニズムの輪郭を描くが、病気の面を模倣する動物モデルに大きく依存してこうして DA 恒常性の特定の部分を評価プロトコルは知見と可能な治療を提供することが重要です。これらの疾患のためのターゲット。

今回 2 つの有用な実験的プロトコルを組み合わせるとマウスのドーパミン系の機能読み出しを提供します。DA の恒常性の生化学的, 機能的パラメーターは、DA のレベルとドーパミン トランスポーター (DAT) 機能5の評価を通じて取得されます。DA システムを調査するときは、確実に大人の頭脳から DA の内因性のレベルを測定する能力が不可欠です。したがって、我々 は DA のレベルを決定するマウスから脳組織に高速液体クロマトグラフィー (HPLC) を実行する方法を提示します。背側線条体 (dStr) と側坐核 (NAc) から組織の実験を実施、他の DA 支配されている脳の領域に適していますまた。

DAT は DA のシナプス前終末に再取り込みのために不可欠にリリースされた DA の時空の活動を制御DA の恒常性を評価する際の主要な重要性はレベルと線条体で DAT の機能を知ることです。ここでは、表面レベルでシナプトソーム6 DA 取り込みアッセイを使用して関数情報を同時に推定することができますプロトコルを提供します。

標準免疫ブロット プロトコルと組み合わせて現在のメソッドは、ドーパミンのシステムを特徴づける関連ツールと研究者を提供します。

概要

ドーパミン (DA) は、モーターの挙動、報酬と認知機能1,7,8,9の重要な調節神経伝達物質です。DA の恒常性の不均衡は、注意欠陥多動性障害、薬物中毒、うつ病、パーキンソン病1などいくつかの脳神経疾患に関与しています。DA は、さらにそれにより信号を伝達、どこに、前及びシナプス後膜の受容体を活性化、シナプスの間隙にシナプス前ニューロンから解放されます。リリース後シナプスの DA のレベルは、DAT3,10によって空間的そして一時的に制御されます。トランスポーター sequesters DA 細胞外スペースから、こうして生理 DA レベル3,11を支えます。マウスで DAT の遺伝的除去 hyperdopaminergic 表現はシナプスの DA レベルが上昇によって特徴付けられる細胞内 DA プール、10、12をシグナル伝達シナプスのドーパミンの深遠な変更の枯渇が発生します。

ここでは、2 つの別々 のプロトコルが表示される、メジャー ダ組織コンテンツと別のガブリエルら13によって記述された表面ビオチン化アッセイとダット複合機能を評価する方法の 1 つこれらの 2 つの方法は、DA に関する情報を提供DA の恒常性の完全な査定の DAT のコンテンツと機能のレベル。これらのメソッドで様々 な遺伝子改変マウスや疾患モデルの DA 恒常性を特徴とし、説明できます。これらのツールを実装して最適化されており、当社の研究所で標準使用。現在の試金は DAT14の C 末端を改変、チロシン水酸化酵素 (TH) プロモーター 5下 Cre リコンビナーゼを発現の DA の恒常性に与える影響を調査するため提供しています。

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

プロトコル

デンマークの動物実験局のガイドライン (許可番号: 2017-15-0201-01160) 続いた実験動物愛護の監督の下で完全に AAALAC 認定施設で、委員会

。

1 シナプトソーム ドーパミン取り込み (法 1)

注: このプロトコルは 2 つの脳の並列評価が 4 脳シナプトソーム DA 吸収実験を実行する正常に使用することができます。並列

。
  1. 準備
    1. ラベル 48 1.5 mL マイクロ遠心チューブ 表 1 (各脳 24) あたり。それぞれの脳に属する管のサンプル間の混乱を防ぐために異なる色を使う
    2. ラベル 51 シンチレーション チューブ #1-51
      3. 。
    3. 場所のリン酸緩衝生理食塩水 (PBS) 氷の上。これは冷やして脳を保つために使用されます
      4. 。
    4. 事前に 4 クールを許可する遠心分離機をオンに ° C
    5. 事前シナプトソーム準備 (セクション 2.6) の間に正確な組織重量を取得する 2 つのマイクロ遠心チューブの重量を量ます
      6. 。
    6. 準備均質化バッファー 4 mM HEPES と 0.32 M ショ糖を混合することによって。PH 7.4 に調整し、氷の
      注: 均質化バッファー因数-20 ° C で保管でき、実験の日を解凍
      7. 。 次を組み合わせることで吸収バッファーを
    7. 準備: 25 mM HEPES、120 mM の NaCl、KCl、1.2 mM の CaCl 2、1.2 mM MgSO 4、5 mM 1 mM アスコルビン酸 (0.194 g/L)、5 mM D-グルコース (0.991 g/L)。水酸化ナトリウム (ナトリウムの濃度は約 130 mM リード) と 7.4 に pH を調整し、氷の
      注: 2 つの脳の 1500 mL 吸収バッファーを準備します。アスコルビン酸とブドウ糖 4 で保管せず原液 x 10 として吸収バッファーを準備 ° c. を 1 x 作業ソリューションたて当日は、アスコルビン酸とブドウ糖を補うこと。7.4 に NaOH で pH を調整します
      8. 。
    8. 準備吸収バッファー + 次を組み合わせることによりリガンド: 25 mM HEPES、120 mM の NaCl、KCl、5 mM 1.2 mM CaC l2、1.2 mM MgSO 4、1 mM アスコルビン酸 (0.194 g/L)、5 mM D-グルコース (0.991 g/L)、1 μ M pargyline、100 nM デシプラミン、10 nMカテコール-O-メチルトランスフェラーゼ (COMT) 阻害剤。NaOH で pH 7.4 に調整し、氷の
      注: は、50 mL 吸収バッファーを使用し、配位子を追加します。Pargyline は、モノアミン酸化酵素 (MAO) を酸化によって DA の劣化を防ぐために追加されます。COMT 阻害薬 (RO-41-0960) は、COMT によって DA (一般的にカテコールアミン) の劣化を防ぐために追加されます。ノルエピネフリンとセロトニンの運送者を再取り込みを阻害し、ダットの特定吸収の結果、それによってにデシプラミンを追加
    9. 準備吸収バッファー + 配位子、次を組み合わせることでコカイン: 25 mM HEPES、120 mM の NaCl、KCl、1.2 mM の CaCl 2、1.2 mM MgSO 4, 1 mM アスコルビン酸 (0.194 g/L)、D-グルコース (0.991 g/L)、5 mM 5 mM 1 μ M pargyline 100 nM デシプラミン、10 nM COMT 阻害剤、500 μ M のコカイン。7.4 NaOH で pH を調整し、氷の
      注: は、7 mL 吸収バッファー + 配位子を使用し、コカインを追加します。コカインは、(SERT とネットは、上記のようにデシプラミンによって抑制される) ので、DAT 固有吸収のみを残してデータから減算する非特異的 DA 取り込みのバック グラウンド測定を得るに追加されます。また、極めて強力な特定の DAT 阻害、GBR 12935 が代わりに使用できます
      。 重要: 氷さあ今から . のすべてを保つ
  2. シナプトソーム準備
    1. 頚部転位と斬首によって一度に 1 つのマウスを犠牲にします
      2. 。
    2. は、斬首から頭蓋骨の左の任意の過剰な組織の後方を切り、頭蓋骨を明らかにするはさみを使用して皮膚をカットしました。28azd-11 頭蓋骨縫合部形成 できるだけ前方終わるに沿って小さなまっすぐハサミで頭蓋骨をカットします
      3. 。
    3. はマウスのそれぞれの目で 2 つはさみヒントを置き、頭蓋骨とそのまま脳の残りの部分を削除する頭蓋骨を切っています。急速に脳を削除し、氷冷 PBS でそれを置きます。これは冷たい、それを維持、脳の解剖第二中です
      4. 。
    4. 線条体のコロナ 3 mm スライスを解剖脳行列を用いた (前後:-1.50 mm +1.5 mm)、パンチャーで細かい郭が続きます。パンチ エリアの 図 1 を参照してください
      5. 。
    5. 前進してすべての回で氷の上組織を維持します
      6. 。
    6. 重さ 1.5 mL マイクロ遠心管組織に転送します
      。 注: この重量は 1.2.14 の手順で使用されます
      7. 。
    7. 第二の脳を繰り返しステップ 1.2.1-1.2.6.
    8. 両方の脳の重量を取得すると、1 mL の冷たい均質化バッファーを含む均質ガラス組織に転送します
      9. 。
    9. 800 rpm、10 もストロークでモーター駆動の乳棒を使用して組織をホモジナイズしてください
      。 注: 1 つのストローク上下にアクション 1 つに等しい、最初のストロークが約 5 秒、等張な媒体で 3-4, 均質化シナプトソーム 6 の破裂を防ぐために重要な次。再シールそれを囲む細胞質、シナプス小胞、ミトコンドリア、細胞骨格、神経終末は、適切な力と等張な媒体を使用して 15
      10. 。
    10. 1.5 mL マイクロ遠心チューブにホモジュネートを転送し、0.5 mL 追加均質化バッファーで洗浄して均質化ガラスから残りの磨砕液を収集します
      11. 。
    11. 他の脳から組織を均質化しながら氷のサンプルを保ちます。手順 1.2.12-1.2.13 で同時に 2 つの頭脳を実行します
      12. 。
    12. 核をペレットし、遠心分離 (1,000 × g、10 分、4 ° C) を用いた細胞の破片
      13. 。
    13. 新しい 1.5 mL 遠心チューブに上清 (S1) (細胞膜と細胞質を含む) を転送し、4時 20 分 16,000 × g で遠心分離機 ° C
    14. (細胞質を含んでいる) 上澄みを廃棄し、40 μ L の均質化のバッファーでペレット (P2) (原油シナプトソームを含む) を再懸濁します/mg 組織 (ステップ 1.2.6 で得られた重量に基づく)。あまり力が壊れます、シナプトソーム、優しく p1000 ピペットの原油シナプトソーム割合を再懸濁します
      。 注: 少なくとも 280 μ L で終わるために重要です。ない場合は、mg 当たり以上 40 μ L で希釈する必要があります。手順 1.2.1-1.2.13 をできるだけ早く行う必要があります、すべて氷で保たれます。氷 6 , 15 , 16 に保持されている限り、原油シナプトソームが均質化バッファーに再停止されてすぐに彼らはかなり安定している
      15. 。

2。吸収実験

  1. 追加 440 μ 吸収バッファー + 配位子 + 指定 12 1.5 mL 容マイクロ チューブおよび 440 μ 吸収バッファーにコカイン + 1.5 mL 遠心チューブ (レイアウトの 表 1 を参照) を残り 36 リガンド
    。 注: は、氷への実験の開始前に 15 分からそれらを削除します。室温にそれらをもたらすが、阻害剤を節約するまで氷の上
    2. 。
  2. 準備飽和曲線 (ドーパミン (2, 5, 6-[3H]-DA) (3 H ドーパミン) (91.1 Ci/モル) 様々 な最終濃度 (0.031 インチ、0.0625、0.125、0.25、0.5、および 1.0 μ M)).
    1. 10、5、2.5、1.25、0.62、0.31 と 6 2 mL マイクロ遠心チューブ用のラベルします
      2. 。
    2. 追加 750 μ L 吸収バッファー + 最小の番号 5 の遠心管にリガンド
      3. 。
    3. 追加 1,455.4 μ L 吸収バッファー + 配位子、14.6 μ ドーパミン (1 mM) チューブに 30 μ l 3 H ドーパミン (11 μ M) 標識 10.
      4. チューブから
    4. 転送 750 μ L ラベル ラベル 5 管に 10 です。よく混ぜるし、2.5 管にこのチューブから 750 μ L を転送します。この残存管希釈を繰り返す
      5. 。
  3. 12 よくフィルター バケツでそれらを配置した後 4 mL 吸収バッファーを持つガラス マイクロファイバー フィルターをプレリンスします
    4. 。
  4. シナプトソーム膜サスペンションが最初の 24 の追加 10 μ L 1.5 mL マイクロ遠心チューブ (レイアウトには、表 1 を参照してください) 含む 440 μ L バッファーです。渦慎重と回転停止直後、シナプトソームがバッファーに沈んでいることを確認します。37 o C で 10 分間の
    注: 正確な吸収実験時の脳の間の公正な比較のために重要です。精度にはストップウォッチを使用します
    5. 。
  5. 追加 50 μ L ドーパミン濃度 10 と 5 μ m (セクション 2.2) 最初の 2 つの列、37 o C 揺れと 5 分のために残す。丁度 5 分後に 1 mL の氷冷吸収バッファーを追加して反応を停止します。濃度 2.5、1.25 μ M (セクション 2.2) と濃度 0.62 0.31 μ M、同じ操作を行います
    6. 。
  6. 中古リンス超極細繊維フィルターにサンプルを追加し、5 x 4 mL 冷たい吸収バッファーで洗浄します。最初 12 のサンプルは、フィルターに追加されている、シンチレーション チューブに、フィルターを移動します。次に 12 個の試料でこれを繰り返します
    7. 。
  7. 2.4 から 2.6 次の脳のため、手順を繰り返します
    8. 。
  8. シンチレーション管 49 51 の下部に超極細繊維フィルターを配置し、上 (10 μ M) 最大のドーパミン濃度を 25 μ l 添加の追加管準備 3 max カウントします
    9. 。
  9. 1 のための発煙のフードすべて 51 シンチレーション チューブのまま
  10. 各シンチレーション管と 1 h. のシェーカーで積極的な手ふれに追加 3 mL シンチレーション液
  11. カウント [3 H]-1 分のベータ カウンターで DA
    1. プログラムを開き、選択: ラベル: H-3、プレート/フィルター: 4 mL バイアル、4、6、アッセイ タイプ: 通常と時間をカウント: 1 分
      注: この手順実行すること次の日場合より便利。一晩スズ箔で覆われたサンプルのままにします
      2. 。
  12. 蛋白質の決定
    1. シナプトソーム fmol/分/μ g に分 (cpm) あたりのカウントから調整し、摂取量の適切な比較のためのタンパク質濃度を決定する標準 BCA タンパク質アッセイ キットを使用サンプル間
      2. 。

3。データ分析

飽和曲線の各グループのミカエリス ・ メンテン定数 (K M) と (V max) の反応率を計算する
  1. の取り込みからデータを使用して実験します
    。 注: K M 値 V max の半分に到達するために必要な基質濃度を反映しています。したがって、V max 直接の機能を反映 DAT (最大吸収容量)、表面および翻訳後修飾および/または相互作用の蛋白質によってだけでなく、その活動を変調されたかもしれない DAT の数に依存します。イオン勾配の変化。K M 値はトランスポーターの基質親和性の間接的な指標で重要なこともできるおよび/または相互作用の蛋白質翻訳後修飾によって変調されます。完全に機能的な変化を評価するために、例えば表面ビオチン化アッセイ、表面表現のレベルを直接確認することが重要ですしたがって。ドーパミン再取り込みと K M と V の 最大 値の意味の精緻化の説明は、シュミッツら 17 によって検討されている
    2. 。

4。高速液体クロマトグラフィー (法 2)

  1. 脳解剖
    1. ラベルと重さのマイクロ遠心チューブ用; マウスごとに地域ごとに 1 つです
      2. 。
    2. は、頚部転位と斬首によって一度に 1 つのマウスを犠牲します。急速に 1.2 節で述べたように脳を削除します。さらに郭清をすぐに実行します
      3. 。
    3. 線条体 NAc と、パンチャーと dStr の細かい両側郭清に続いての 3 mm コロナ スライスを解剖脳行列を用いたします。パンチ エリアの 図 3 を参照してください
      4. 。
    4. 1.5 mL 遠心チューブに組織を転送、すぐにドライアイスに。組織の重さし、ドライアイスに戻ってすぐにそれを配置します
      。 注: 組織重量濃度計算後に重要です
      5. 。 次のマウスを使って
    5. 繰り返し手順 4.1.1-4.1.4.
      注: は、さらなる処理まで 80 o C でティッシュを置きまたはティッシュの処理に進んでください
      6. 。

5。ティッシュの準備

  1. 中古 4 ° C に冷却するように遠心分離機をオンに
  2. 均質化ソリューション (0.1 N 過塩素酸 (山積みし 4)) を準備し氷の維持
  3. による均質化ソリューション準備 1 mM 原液 (10,000 倍希釈) から新鮮な 0.1 pmol/μ L ドーパミン標準
    。 注: 原液は 1 mm、約 1 ヶ月の 20 ° C に保つことができるストック濃度均質化バッファー内のドーパミンに溶解したとしています。脳の他の領域は、関心のある、標準濃度 prefrontral の皮質を含む他の頭脳区域以来、変更するが、海馬、中脳腹側被蓋野、線条体と比較して 100 倍少ない DA を所有している
    4. 。
  4. は各サンプル (すなわち NAc と dStr 組織; セクション 4.1) に 500 μ L の均質化ソリューションを加えて均質化中にフルスピードで約 30 s. 維持のため超ホモジナイザーを用いた試料氷水でサンプルを均質化します。各サンプル間きれいに水で超ホモジナイザー (フルスピード 30 s).
  5. 遠心分離機の 14,000 x g. 4 ° C で 30 分のサンプル
  6. 転送約 200 μ L サンプル 1 mL プラスチック注射器を使ってガラス 0.22 μ m フィルター (直径 1 cm) にします
    。 注: ガラス フィルターの使用は、重要な選択フィルターが 0.22 μ m 高分子量物質を除去する限り
    7. 。
  7. 電気化学的検出 (EC)、サンプルを分析-高速液体クロマトグラフィー法 18 セクション 6 で説明した
    8. 。

6。高速液体クロマトグラフィー分析

移動相の
  1. 次の準備ソリューション: 55 ミリメートル、オクタンスルホン酸 1 mM、ナ 2 EDTA 0.1 mM、アセトニ トリル 8% 酢酸 0.1 M 酢酸ナトリウム pH = 3.2
    。 注: は、0.1 M の酢酸で pH を調整します。PH を正確にすることが重要です。ソリューションは、degasse をする必要があります。d オンライン脱ガス装置 (高速液体クロマトグラフィー システムの統合された部分)。移動相の 2 L を作成し、月に一度変更 (変更、ノイズが顕著)。移動相を変更した後調整する約 24 時間がかかる変動
    2. 。
  2. 検出器のセットアップ: 700 mV、検出器オーブンの 32 ° C の温度出力、
    1. セット ボルト; これは非常に重要です。オンライン マニュアルを使用して範囲のプログラムを作る。詳細については、マニュアルを参照)。表 2 に従って時間プログラムを追加します
      。 注: この研究では、プログラムは保存期間の設定時に、最適な電流で HPLC を維持して、可能な限り、まだビュー内を拡大クロマト グラムのピークを維持するため、電流を自動的に変更する設定されます。これはマウスから線条体脳 lysates に最適化されています
      2. 。
  3. 検出器にプログラムを追加すると、3 点較正曲線を作成、標準を注入することによって 3 回 (5、10、15 μ).
    注: 標準 (10 μ L (0.1 pmol/μ L × 10 μ L = 1 pmol DA)) すべての 10 のサンプル、および最も近い標準にキャリブレーション サンプルに注入する必要があります。3 点標準を調整してクロマト グラムは、予想される範囲内で出てくるかどうかをチェック システム日前日の微調整をします。相当なノイズが発生した場合は、移動相を変更します。ピークは 990 mV、低ボリュームのサンプルを再注入より高いまたは新しい範囲のプログラムと新しい標準曲線を作るかどうか。検出限界は、3 回の各標準注入最低のピーク値に mV のノイズの値として測定 (NA、DOPAC、ダ、5-HIAA, HVA、3 MT と 5 HT)。
    1. セットアップ システム LC ソリューションを開くと、オンライン モードでの分析 1; この開始をアクティブ化します。ユーザー ID とパスワードを入力し、[ok] をクリックします。LC ソリューション機器に接続するを待ちます。バッチ テーブルに移動し、データ情報を入力 (例えば、サンプル タイプ: 標準、解析タイプのサンプルと std の不明な: それ QT、inj ボリューム: 10、ISTD amt: レベル 1 コン)。ファイルを保存 (ファイル - > - としてバッチ ファイルを保存 > 保存).
    2. を押すことによって最初のサンプルを注入システムを作る ' [スタート] バッチ '。これは溶剤配信モジュールとオートサンプラーによる 10 μ L の試料の注入になります
      。 注: は、反転相に 0.15 mL/min と C18 カラムのポンプ流量を使用します。ここで電気化学検出用アンペロ メトリック検出器が使用されました。グラッシー カーボン電極銀/塩化銀参照電極と 0.8 V に設定してください。ドーパミンを試金するためにクロマトグラフィー 3 μ を使用して ODS (3) C18 (DA 2 mm × 100 mm の粒子サイズ 3 μ m) クロマト グラフ分離を達成するために.
    3. は、記録と計算されるピーク領域を抽出します。
      1. サンプルを終えたとき、クロマト グラムに従うデータ集録に行く。Lc 分析 - を実行するポストに行く > (クロマト グラムが開きます) ファイル名 - を選んだ > ビューをクリックします。手動統合バーに統合される - すべてのピークを追加 > データ レポートに移動し、読み取りをプリント アウトします
        。 注: ここで LC ソリューション ソフトウェア使用されたデータ分析とシステム制御します
        2. 。
  4. ピーク面積から既知濃度標準を使用して、次のように、サンプルではドーパミンの濃度を計算:
    1. (= 1 pmol) 標準のピーク領域を使用して、A. の要因を取得
      figure-protocol-1
    2. 因子 A を使用してサンプルの濃度を取得します
      。 (10 μ L あたり pmol) のサンプルの濃度サンプルの要因 A × ピーク領域を =
    3. ng のサンプル濃度を得るための数式を使用します
      。 サンプル濃度 pmol/10 μ x 500 μ L ドーパミンの MW x ng のサンプル濃度を =
      (ng) の濃度をサンプル 500 μ L x (10 μ L あたり pmol) サンプル濃度を = ドーパミンの MW x
    4. ng のサンプル濃度を使用して t彼は pg/g 体内濃度サンプル (サンプル pg 濃度/組織 g = pg/g 組織).

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

結果

現在 DA 取り込みプロトコル (図 1) には、マウスから得たシナプトソームで DAT の機能を評価するために必要なすべての手順が含まれています。DA 吸収法 (図 2) の代表的なデータは、未調整のデータ (図 2 b) と飽和曲線を示しています、調整データ (図 2 a)。飽和曲線は、野生型マウスから摂取量を示しています。通常 1 つは DA 取り込み各遺伝子5の飽和曲線につながる変異マウスとの比較になります。その場合は、複数の要因によって 2A および 2B の野生型と変異マウスの違いを説明できます。徹底した実験者は差生 (2 b) とタンパク質調整 (2 a) データを描いた間があります、プロトコルのすべてのステップを次にです。The most 違いの明白な理由は i) 不正確な...

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

ディスカッション

本稿では、選択肢の任意のマウス モデルの DA 恒常性を記述する有用な実験的プロトコルについて説明します。ダット DA 輸送機能を評価するために高速液体クロマトグラフィーとシナプトソーム DA 吸収を用いたマウスから DA の脳組織のレベルを測定の詳しいプロトコルをいたします手順、プロトコルおよび高速液体クロマトグラフィーの実験とシナプトソーム DA 取り込みアッセイの制限、以下で詳述されるが。

シナプトソーム取り込みプロトコルは表面ビオチン化実験13ダット複合の機能に有用な洞察力を提供することができます、合計金額、表面のレベルと DAT の機能に関する知識を得ることができます。DAT と DA 伝送への影響と様々 な病気への参加の大きな役割を与えられて、それは DAT 関数モデルの試金を確立する主要な目標をされています。シナプトソーム DA 吸収実験の利点の 1 つはよう chemogenetic 操作またさまざまな生体内の薬物治療または行動に加えトレーニング時に生体内で操作実行ポストすることがで...

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

開示事項

著者が明らかに何もありません。

謝辞

この作品は、UCPH 2016 プログラムの卓越性 (アリフール、u. g. k. j.) によって支えられた、ルンドベック財団 (原産地) 膜のナノ医療 (u. g.)、国立研究所の健康補助金 P01 DA 12408 (u. g.)、デンマーク ルンドベック財団センター-医療科学 (u. g.) の独立した研究協議会。

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
COMT阻害剤シグマAldrich、ドイツRO-41-0960シナプトソームDA取り込みプロトコル[
3H]-ドーパミンPerkin-Elmerライフサイエンス、ボストン、マサチューセッツ州、米国NET67-3001MCシナプトソームDA取り込みプロトコルガラス
マイクロファイバーフィルターGF/ C Whatman、GEヘルスケアライフサイエンス、バッキンガムシャー1822-024シナプトソームDA取り込みプロトコルHiSafeの場合
シンチレーション液パーキンエルマー1200-437シナプトソーム DA 取り込みプロトコル
MicroBeta2パーキンエルマーシナプトソーム DA 取り込みプロトコル
BCA タンパク質アッセイキットサーモサイエンティフィック ピアス23225シナプトソーム DA 取り込みプロトコル
HEPESシグマライフサイエンスH3375シナプトソーム DA 取り込みプロトコル
スクロースシグマ生命科学S7903シナプトソームDAの取り込みプロトコル
NaClシグマの生命科学S3014シナプトソームDAの取り込みのプロトコル
KClのシグマの生命科学P9541シナプトソームDAの取り込みのプロトコル
CaCl2メルクKGaA10043-52-4シナプトソームDAの取り込みのプロトコル
MgSO4シグマの生命科学63065シナプトソームDA取り込みプロトコル
アスコルビン酸シグマライフサイエンスA0278シナプトソームDA取り込みプロトコル
D-グルコースシグマライフサイエンスG7021シナプトソームDA取り込みプロトコル
PargylineSigma AldrichP-8013シナプトソームDA取り込みプロトコル
デシプラミンシグマAldrichD3900シナプトソームDA取り込み用プロトコル
ドーパミンシグマ ライフサイエンスH8502シナプトソーム DA 取り込みプロトコル
コカインシグマ ライフサイエンスC5776シナプトソーム DA 取り込みプロトコル
脳マトリックスASI 機器RBM2000Cシナプトソーム DA 取り込みプロトコル
カファノ メカニカル テフロン ディスラプターブーフ &Holm製造中止シナプトソーム DA 取り込みプロトコル (均質化)
Antec Decade (アンペロメトリック検出器)Antec、ライデン、オランダ製造中止: 新モデル DECADE Elite / Lite™電気化学検出器 タイプ 175 および 176HPLC プロトコル用
Avantec 0.22 μmガラスフィルターFrisenette ApS、デンマーク13CP020ASHPLCプロトコル
用カラム:Prodigy 3 μODS-3 C18Phenomenex、YMC Europe、Chermbeck、Germany部品番号:00A-3300-E0HPLCプロトコル用
LCソリューションソフトウェア島津製作所 LabSolutionsシリーズ ワークステーションHPLCプロトコル用
Perchlor acid 0.1MFluka Analytical35418-500mlHPLCプロトコル用(組織調製)
EDTASigmaE5134-50gHPLCプロトコル用
ナトリウム二水素リンスファーBie&Berntsen1.06346 1000gHPLCプロトコル用
ナトリウム1-オクタンスルホン酸一水和物Aldrich74885 -10gHPLCプロトコル
用 アセトニトリル、アイソクラティックHPLCグレードScharlauAC03402500HPLCプロトコル用
Filtre 0.22umFrisenette ApS、デンマークAvantec 13CP020ASHPLCプロトコル用(組織調製)
オルトリン酸 85%メルク1.00563. 1000mlHPLCプロトコル用
電極Antec、ライデン、オランダAN1161300HPLCプロトコル用(マニュアルオンラインを参照)
DECADE II電気化学検出器の検出器プログラムAntec、ライデン、オランダLite™電気化学検出器タイプ175および176HPLCプロトコル用

参考文献

  1. Tritsch, N. X., Sabatini, B. L. Dopaminergic modulation of synaptic transmission in cortex and striatum. Neuron. 76, 33-50 (2012).
  2. Cartier, E. A., et al. A biochemical and functional protein complex involving dopamine synthesis and transport into synaptic vesicles. J Biol Chem. 285, 1957-1966 (2010).
  3. Kristensen, A. S., et al. SLC6 neurotransmitter transporters: structure, function, and regulation. Pharmacol Rev. 63, 585-640 (2011).
  4. Gainetdinov, R. R., Caron, M. G. Monoamine transporters: from genes to behavior. Annu Rev Pharmacol Toxicol. 43, 261-284 (2003).
  5. Runegaard, A. H., et al. Preserved dopaminergic homeostasis and dopamine-related behaviour in hemizygous TH-Cre mice. Eur J Neurosci. 45, 121-128 (2017).
  6. Whittaker, V. P., Michaelson, I. A., Kirkland, R. J. The separation of synaptic vesicles from nerve-ending particles ('synaptosomes'). Biochem J. 90, 293-303 (1964).
  7. Hornykiewicz, O. Dopamine (3-hydroxytyramine) and brain function. Pharmacol Rev. 18, 925-964 (1966).
  8. Schultz, W. Behavioral dopamine signals. Trends Neurosci. 30, 203-210 (2007).
  9. Beaulieu, J. M., Gainetdinov, R. R. The physiology, signaling, and pharmacology of dopamine receptors. Pharmacol Rev. 63, 182-217 (2011).
  10. Giros, B., Jaber, M., Jones, S. R., Wightman, R. M., Caron, M. G. Hyperlocomotion and indifference to cocaine and amphetamine in mice lacking the dopamine transporter. Nature. 379, 606-612 (1996).
  11. Torres, G. E., Amara, S. G. Glutamate and monoamine transporters: new visions of form and function. Curr Opin Neurobiol. 17, 304-312 (2007).
  12. Jones, S. R., et al. Profound neuronal plasticity in response to inactivation of the dopamine transporter. Proc Natl Acad Sci U S A. 95, 4029-4034 (1998).
  13. Gabriel, L. R., Wu, S., Melikian, H. E. Brain slice biotinylation: an ex vivo approach to measure region-specific plasma membrane protein trafficking in adult neurons. J Vis Exp. , (2014).
  14. Rickhag, M., et al. A C-terminal PDZ domain-binding sequence is required for striatal distribution of the dopamine transporter. Nat Commun. 4, 1580(2013).
  15. Dunkley, P. R., Jarvie, P. E., Robinson, P. J. A rapid Percoll gradient procedure for preparation of synaptosomes. Nat Protoc. 3, 1718-1728 (2008).
  16. Whittaker, V. P. Thirty years of synaptosome research. J Neurocytol. 22, 735-742 (1993).
  17. Schmitz, Y., Benoit-Marand, M., Gonon, F., Sulzer, D. Presynaptic regulation of dopaminergic neurotransmission. J Neurochem. 87, 273-289 (2003).
  18. Yang, L., Beal, M. F. Determination of neurotransmitter levels in models of Parkinson's disease by HPLC-ECD. Methods Mol Biol. 793, 401-415 (2011).
  19. Earles, C., Schenk, J. O. Rotating disk electrode voltammetric measurements of dopamine transporter activity: an analytical evaluation. Anal Biochem. 264, 191-198 (1998).
  20. Wu, Q., Reith, M. E., Kuhar, M. J., Carroll, F. I., Garris, P. A. Preferential increases in nucleus accumbens dopamine after systemic cocaine administration are caused by unique characteristics of dopamine neurotransmission. J Neurosci. 21, 6338-6347 (2001).
  21. Schonfuss, D., Reum, T., Olshausen, P., Fischer, T., Morgenstern, R. Modelling constant potential amperometry for investigations of dopaminergic neurotransmission kinetics in vivo. J Neurosci Methods. 112, 163-172 (2001).
  22. Hoover, B. R., Everett, C. V., Sorkin, A., Zahniser, N. R. Rapid regulation of dopamine transporters by tyrosine kinases in rat neuronal preparations. J Neurochem. 101, 1258-1271 (2007).
  23. Hansen, F. H., et al. Missense dopamine transporter mutations associate with adult parkinsonism and ADHD. J Clin Invest. 124, 3107-3120 (2014).
  24. Damier, P., Hirsch, E. C., Agid, Y., Graybiel, A. M. The substantia nigra of the human brain. II. Patterns of loss of dopamine-containing neurons in Parkinson's disease. Brain. 122 (Pt 8), 1437-1448 (1999).
  25. Atack, C. V. The determination of dopamine by a modification of the dihydroxyindole fluorimetric assay. Br J Pharmacol. 48, 699-714 (1973).
  26. Yoshitake, T., et al. High-sensitive liquid chromatographic method for determination of neuronal release of serotonin, noradrenaline and dopamine monitored by microdialysis in the rat prefrontal cortex. J Neurosci Methods. 140, 163-168 (2004).
  27. Decressac, M., Mattsson, B., Lundblad, M., Weikop, P., Bjorklund, A. Progressive neurodegenerative and behavioural changes induced by AAV-mediated overexpression of alpha-synuclein in midbrain dopamine neurons. Neurobiol Dis. 45, 939-953 (2012).
  28. Huot, P., Johnston, T. H., Koprich, J. B., Fox, S. H., Brotchie, J. M. L-DOPA pharmacokinetics in the MPTP-lesioned macaque model of Parkinson's disease. Neuropharmacology. 63, 829-836 (2012).
  29. Mikkelsen, M., et al. MPTP-induced Parkinsonism in minipigs: A behavioral, biochemical, and histological study. Neurotoxicol Teratol. 21, 169-175 (1999).
  30. Salvatore, M. F., Pruett, B. S., Dempsey, C., Fields, V. Comprehensive profiling of dopamine regulation in substantia nigra and ventral tegmental area. J Vis Exp. , (2012).
  31. Van Dam, D., et al. Regional distribution of biogenic amines, amino acids and cholinergic markers in the CNS of the C57BL/6 strain. Amino Acids. 28, 377-387 (2005).
  32. Barth, C., Villringer, A., Sacher, J. Sex hormones affect neurotransmitters and shape the adult female brain during hormonal transition periods. Front Neurosci. 9 (37), (2015).
  33. Corthell, J. T., Stathopoulos, A. M., Watson, C. C., Bertram, R., Trombley, P. Q. Olfactory bulb monoamine concentrations vary with time of day. Neuroscience. 247, 234-241 (2013).
  34. Zhuang, X., et al. Hyperactivity and impaired response habituation in hyperdopaminergic mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 98, 1982-1987 (2001).
  35. Ungerstedt, U., Pycock, C. Functional correlates of dopamine neurotransmission. Bull Schweiz Akad Med Wiss. 30, 44-55 (1974).
  36. Wickham, R. J., Park, J., Nunes, E. J., Addy, N. A. Examination of Rapid Dopamine Dynamics with Fast Scan Cyclic Voltammetry During Intra-oral Tastant Administration in Awake Rats. J Vis Exp. , e52468(2015).
  37. Phillips, P. E., Robinson, D. L., Stuber, G. D., Carelli, R. M., Wightman, R. M. Real-time measurements of phasic changes in extracellular dopamine concentration in freely moving rats by fast-scan cyclic voltammetry. Methods Mol Med. 79, 443-464 (2003).
  38. Callaghan, P. D., Irvine, R. J., Daws, L. C. Differences in the in vivo dynamics of neurotransmitter release and serotonin uptake after acute para-methoxyamphetamine and 3,4-methylenedioxymethamphetamine revealed by chronoamperometry. Neurochem Int. 47, 350-361 (2005).

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

再版と許可

タグ

高速液体クロマトグラフィー分析とシナプトソーム ドーパミンによるマウスにおけるドーパミン作動性恒常性の評価
お問い合わせ
図書館への推薦

プライバシー

利用規約

ポリシー

著作権 © 2026 MyJoVE Corporation. 無断転載を禁じます。