分離抵抗性ラットの動脈のビデオ顕微鏡を用いた血管制御機構の評価

Summary

本稿では、ラット脳の抵抗血管での血管の機能を評価するためのビデオ顕微鏡検査のプロトコル体外について説明します。原稿もレーザー レーザードップラー血流計を用いた蛍光に分類されたレクチンと組織潅流と微小血管密度を評価するための手法を説明します。

Abstract

このプロトコルの分離脳抵抗動脈 (と他の船舶) の血管機能を評価するための in vitroテレビ顕微鏡の使い方について説明し、レーザー ドップラー血流計 (LDF を使用して組織の血流を評価するための手法について説明します) と蛍光を用いた微小血管密度グリフォニア simplicifolia (GS1) レクチンをラベル付けします。現在の勉強方法貫圧力発生体内抵抗血管を分離、実質細胞の影響のない状態で生体内での研究と分子から得られる情報との間の重要なリンクを提供個体レベルでの統合的な応答に限られた洞察力を提供する還元主義的アプローチ。LDF とテクニックは、GS1 の蛍光標識レクチンと細動脈と毛細血管を選択的に識別するためには、分離抵抗血管の研究から得られた知識を拡張する捜査官を可能にする実用的なソリューションを提供します。本稿血管生理学一般実験モデルとしてラットの病理学の基礎的知識を得るためにこれらの技術の応用と専門の様々 な提供することができます「デザイナー」ラット系統遺伝子組み換え特定の遺伝子が重要な血管表現型に与える影響の重要な洞察力。ノックアウト マウス モデルで開発した科学的前提の厳しさを拡大する選択的な繁殖戦略と、ラットの遺伝子ノックアウト モデルを生産するための新しい技術によって開発されたラット系統でこれらの貴重な実験的アプローチを活用し、人の知識をよく理解の生理学的背景とサイズが大きいため生体への適合性、関連性の高い動物モデルを拡張します。

Introduction

多くの利用動脈導管動脈における血管機能の初期の研究の場合、大動脈です。太い動脈の力発生一般的に動脈のリング セグメントを組織内の力覚センにアタッチすることにより検討しました。大動脈の場合ヘリカル切削によってストリップ容器の平滑筋線維間の接続点との収縮によって発生する力の最良推定値を提供するために、力覚セン縦方向に指向されたので、その縦軸に沿って平滑筋。大動脈のヘリカル ストリップを切断するための標準的な方法は、血管の内腔にガラス棒を置いて、希望の角度で血管壁に切れ込み、カットは全体を生成する拡張された血管壁の露出の端の端につかまって容器のヘリカル ストリップ。その時点では、血管の内皮側だった容器ストリップを合力トランスデューサーに接続して、酸素の準備を水没前に破片を削除する一般的に消された、温度制御組織バス。最終的には、アプローチが Furchgott、Zawadski¹、すなわち内皮の役割によって生理学の歴史の中で最も有名で重要な発見の一つにつながった由来リラックス因子 (EDRF)、その後に窒素酸化物で識別されます。血管機能を調節します。その発見につながる重要なイベントは調査官が外部表面と動脈の内皮側との接触を避けることでそのまま血管内皮細胞を維持し、大動脈のストリップは予想される展示していないことに気づいた状況アセチルコリン (ACh) が、ACh の応答の代わりにリラックスに収縮します。その観察に基づいて、調査官大動脈の標準はすばのストリップを (しかし、収縮力を生成できません) そのまま内皮と大動脈セグメントを接続いる「サンドイッチ」準備を開発し、ACh による変換緩和に収縮します。

この分野で現在広く使用されている 2 つの主要な進歩は、小さな抵抗動脈^2,3でアクティブな収縮力を測定する製剤の開発(小腸間膜³のものなど) と抵抗動脈準備^4,5,6を cannulated。最も早いレポートのいずれか、Mulvany とハルパーン³は自然発症高血圧ラット (SHR) の小腸間膜から分離抵抗血管の収縮力を勉強するワイヤー第 1 報準備の使い方を説明し、正常血圧 WKY コントロール。ワイヤー第 1 報システムの開発後、● キャニュレイテッド抵抗動脈準備は生体内での条件^4,5,6に近い血管の研究を許可するように開発されました。 両方のアプローチは、貴重な結果を提供する、効果的な動脈の本質的なアクティブな調子を維持以上の追加のメリットがあります ● キャニュレイテッド動脈準備経壁圧と容器のレスポンス流量と血管内皮のせん断応力の変化の変化に筋活動を研究する研究者を許可して (を参照してくださいハルパーンとケリー⁶レビュー)。

本稿の主要な目標は重要なこれらのアクティブなトーンを調節するメカニズムに関する正確な情報を得るために分離、● キャニュレイテッド抵抗血管を用いたビデオ顕微鏡の昔ながらの手法を採用する方法を説明します血管、神経、体液、または実質のセルの独立に影響します。この基本情報は、採用の標準ラット モデルとの私たちの研究から例を新しい遺伝子ラット系統を設計、テレビで得られる血管の機能に関する洞察力の種類の考えを読者に提供します顕微鏡のアプローチ、およびすべてのコントロールおよび治験責任医師の選択、選択的近親交配によって生成される強力な新しいラット実験的モデルを含むと新開発の遺伝の実験グループを含む研究を用いることができます。エンジニア リング技術。

テレビ顕微鏡アプローチの精度のおかげで準備 ● キャニュレイテッド動脈径変化の測定は、血管の内皮依存性および内皮非依存性のメカニズムに関する非常に貴重な情報を提供できます。リラクゼーションだけでなく、高血圧、塩分の高い食事やその他の実験的介入で発生している血管の制御機構に重要である (および時々 予期しない) 変更。さらに、圧径関係の測定が分離し、Ca^{2 +}との処置で最大限にリラックスして抵抗血管を cannulated-無料のソリューションまたは薬理学的血管拡張薬、評価を使用できます動脈血管リモデリングにより、動脈機能に影響を与えることができます動脈の受動的な機械的性質の変化の重要な洞察を提供することができる受動的な応力-ひずみ関係⁷を計算するための構造変化アクティブな制御機構の独立の (またはに加えて) を変更します。また、分離抵抗血管の研究から得た情報をことができます LDF、個体レベルの^{8,9 組織灌流の評価のための実用的な方法を利用した得られた情報によって補われることに注意してくださいすることが重要です。 ,10}GS1 の蛍光標識レクチンを用いた微小血管密度の評価から得た情報によっては、具体的には、小細動脈と毛細血管の¹¹の基底膜の糖鎖に結合して^,12します後者のメソッドは、船生体内で、たとえば非灌流を数えることで微小血管密度の推定に古典的な困難を受けにくい微小血管密度の非常に正確な見積もりを提供します。血管の細動脈のアクティブな閉鎖のための血流の停止場所。これらのアプローチが分離抵抗動脈微小循環レベルでの組織の血流の変化に与える機能的変化を関連付けるための重要な洞察力を提供できる一緒に使用する場合● キャニュレイテッド動脈技術と組み合わせてこれらの貴重なアプローチの使用のいくつかの例は、本稿も提供されます。

本稿はザイモグラムの Sprague-dawley ラットの動脈の血管の変化を評価するビデオ顕微鏡検査の技術の使用に焦点を当てください。ただし、これらのテクニックが非常に貴重な品種改良や遺伝子技術を使用して、編集によって作成された専門性の高い遺伝子組み換えラット系統の表現型の変化を解明する証明されていることに注意してくださいすることが重要です。本稿では、どのようにビデオ顕微鏡検査の技術の例は最も広くダール食塩感受性 (SS) ラットの近交系ラットの歪みを含むモデル数貴重なラットの血管機能に関する重要な情報を提供しているを提供します。塩の機密 hypertenson^{18,19,20,21,22,23}; のメカニズムを研究するのに実験モデルを使用塩を区別しないブラウン ノルウェー (BN) ラット系統 SS ラットの選択的な育成によって作成されるコンソミック ラット。コンソミック ラット パネルでブラウンのドブネズミからすべての染色体は、ダール SS^24,25,26遺伝的背景に個別に交雑をされています。コンソミック ラット パネルの使用は、血圧と血管反応性^{24,25,26 を含む他の表現型の塩の感受性に貢献する特定の染色体に関する貴重な手がかりを提供しています。 ,,2728}。

SS ラットおよび個々 の BN の染色体を運ぶコンソミック ラットを用いた選択的な繁殖戦略もダール SS 遺伝的に個々 のブラウン ノルウェー染色体交雑の小さなセグメント狭窄コンジェニック系統の世代を有効にしています。背景^22,29。これらは、非常に貴重な入力の特定の遺伝子を提供したり、血圧、腎障害、血管反応性^22,29などの重要な生理学的変数に影響を与えることができる染色体の地域を絞り込みます。ラットの遺伝ツールボックスに別の強力な追加、編集テクニック ZFNs、転写活性化ようなエフェクター核酸分解酵素 (TALENS) を含む高度な遺伝子を利用したラット遺伝子ノックアウト モデルの開発と最近 CRISPR Cas9^{13 ,14,15,16,17}。ラットをノックアウトする遺伝子を有効にこれらの強力な技術の出現は非常に重要な開発、遺伝子ノックアウト研究 (および使用し続ける) マウスを使用しているためほとんど専ら。本論文では実験的なコンポーネント別 ● キャニュレイテッド動脈技術とビデオ顕微鏡マスター抗酸化と細胞保護転写を欠けてノックアウト ラットの生理学的制御メカニズムを評価するための値を示します係数、核因子 (赤血球由来 2) - のような - 2 (NRF2)^30,31, Sprague-dawley 遺伝的背景¹⁷TALEN 技術を使用して開発されました。NRF2 遺伝子の損失の機能検証を提供し、NRF2 を介した抗酸化物質の直接のアップレギュレーションに基づく可能性がある貴重な治療アプローチをテストに使用されたビデオ顕微鏡技術の in vitro実験、防御。NRF 2 は、ビタミン C や E³²など抗酸化物質の直接投与を含む臨床試験の期待はずれの結果に照らして、人間の血管の酸化ストレスを闘う相当な治療の重要性の。

Protocol

大学のウィスコンシン州機関動物医療および使用委員会 (IACUC) 承認本稿に記載されているすべてのプロトコルとすべての手順に準拠して、国立衛生研究所 (NIH) オフィスの実験室の動物福祉 (OLAW)規制。

1. ソリューションおよび容器室の準備

1. 一連の実験を行う前に準備 278 g/L; 塩化ナトリウムから成る塩ストック溶液 x 20 の 2 L14 g/L 塩化カリウム;11.52 g/L MgSO₄^.7 H₂O;9.4 g/L CaCl₂^.2 H₂o.また 80.8 g/L NaHCO₃と 0.4 g/L, EDTA から成る濃縮緩衝在庫 × 20 の 2 L を準備し、20 倍の 2 L が集中して Ca^{2 +}-無料原液 281.6 グラム/L の NaCl; から成る14 g/L KCl と 11.52 g/L MgSO₄^.7 H₂o.
   注: 原液 X 20 は、使用するまで冷蔵庫に格納することができます。
2. 実験の日、準備 2 L 生理的食塩水 (PSS) の濃縮原液 x 20 から次のように: 1,800 mL の脱イオン水 2 L 三角フラスコまたは電動攪拌板のビーカーに加える塩在庫 x 20 の 100 mL。バランスを N₂、および磁気攪拌棒でかき混ぜ、21% O₂, 5% CO₂を含む混合ガスによるソリューションを継続的に, 中 20 x 緩衝在庫の 100 mL を追加します。の pH を監視しながらゆっくりと 0.28 g NaH₂PO₄を追加します。パスツール ピペットから 6 N 塩酸または 6.5 N NaOH 溶液の滴を追加することによって pH 7.4 に必要に応じて調整します。PSS の準備し、pH の調整、PSS にグルコースの 1.98 g を追加します。
   注意: ゆっくり最後ので PSS の pH を監視しながら NaH₂PO₄を追加するが重要です NaH₂PO₄アルカリ溶液添加 (pH > 7.4) によって示されるリン酸カルシウムの沈殿物を形作ることができる、曇りのソリューションまたはコンテナーの底に白い沈殿物の外観。
   注: PSS の最終的な組成は 119 mM/L 塩化ナトリウム;4.7 mM/L 塩化カリウム;1.17 mM/L Mg₂₄;1.6 mM/L CaCl₂;1.18 mM/L NaH₂PO₄;24 mM/L NaHCO₃;0.03 mM/L EDTA;5.5 mM/L ブドウ糖。研究所の中で、PSS の組成が異なるが、このレシピは血管緊張、血管内皮機能と分離抵抗血管における血管作動性反応の維持に最適。
3. 最大径を決定して容器の最大拡張を生産して動脈のアクティブ トーンを評価するには、Ca^{2 +}の 500 mL を準備-25 mL 20 X Ca^{2 +}を追加することで、PSS を無料-無料の 450 mL の脱イオン水に塩のストック、上記 1.2 のステップに三角フラスコやビーカーと同様で緩衝在庫 x 20 の 25 の mL に続いて。監視と、溶液の pH を調整しながら NaH₂PO₄ 0.07 g をソリューションに追加します。Ca^{2 +}の細胞内 Ca^{2 +}ストア通常 PSS の血管反応に影響を与える可能性を破壊を避けるために実験の終わりに PSS 貯水池と容器室に無料 PSS が追加されます。Ca^{2 +}-PSS にグルコースを追加する必要はありません、動脈の最大緩和を生成する実験の終わりに無料のソリューションが追加されます。
   注: が完了したら、最終的な組成の Ca^{2 +}-無料の PSS は 120.6 mM/L 塩化ナトリウム;4.7 mM/L 塩化カリウム;1.17 mM/L Mg₂₄;1.18 mM/L NaH₂PO₄;24 mM/L NaHCO₃;0 mM/L CaCl₂;0.03 mM/L EDTA。
   注: 動脈の最大の拡張を必要とする多くの研究、ベラパミル (1 μ M) などカルシウム エントリ ブロッカーおよび/またはニトロプルシド ナトリウム (10 μ M) などの一酸化窒素ドナーを PSS からの Ca^{2 +}の削除に加えて、ソリューションに追加ができます。
4. 継続的に, 分離大動脈リング、腸管の平滑筋や他の組織 (図 1) を研究するために使用標準的な器官風呂で容器室に流れる PSS で PO₂PCO₂PSS の pH を維持します。テトラフルオロ エチレン チューブの合成フッ素樹脂を使用して、チューブのこのタイプは、ガス管、例えばラテックスの多くの他の形態と対照をなして、不浸透性ためオルガンお風呂にガソリン タンクを接続します。
5. 小さな空気石の場所は PSS ガス組成を維持するために容器チャンバーで平衡ガス混合物に接続されています。
   注: PO₂変化に対する血管応答は O₂、例えば21% O₂, 10% O₂5 %o_{2 の様々 な割合を含む混合ガス容器室内腔液で PSS を平衡させることでテストできます。}と 0% O₂5% CO₂とバランス N₂^33,34,35。厚い壁、どこ血管壁の中心に酸素の拡散には、制限があります、大きい動脈の酸素、例えば95% O₂の割合が高いを使用できます。
6. 容器燃焼温度を密接に監視の伝熱特性の個々 の部屋が異なる場合があります。
   メモ: ● キャニュレイテッド抵抗血管の研究のため多くの商業的に準備された容器室利用ガス平衡貯水池から酸素の PSS を提供し、風呂の温度の非常に正確な制御との酸素を提供する蠕動性ポンプPSS。
7. ストッパーと加熱し、ガスある容器室 (図 1 a) に流れる PSS オルガンお風呂に PSS を継続的に提供するための貯水池として機能するセントラル硝子管の大きい (2 L) の上のボトルに PSS を配置します。
8. オルガンのバスソルトの PSS 配信用静水圧ヘッドを維持するためにオルガンお風呂で PSS の上部と同じレベルで上のボトルにセントラル硝子管の開口部を配置します。使用ポリエチレン チューブは、J 型のガラスまたは器官風呂にマリオット瓶から PSS を提供するプラスチック製のチューブに接続。
9. 内腔潅流 (図 1 a)、「ポリエチレン チューブを使用して 60 cc のプラスチック注入目的流入圧力 (通常 80 mmHg ラット脳の研究を維持する位置に高架から成る PSS 貯水池に流入ピペットを接続動脈)、圧力で測定したトランスデューサー、活栓を介してシステムに接続されています。
10. 圧力勾配に対応容器を通過する PSS を許可するポリエチレン管に流出ピペットと貯水池流入貯水池のように流出の線を接続します。流出の圧力を測定するのにと同様の活栓と圧力トランスデューサー接続を使用します。
    注: 経壁圧を設定し、船を介してフローを制御するための手順は、下記のセクション 2。
11. 実験の終わりには、商工会議所、配信線、蒸留水タンク システム徹底的にすすいでください。頻繁な間隔でクリーン チューブと配信行を置き換えるまたはシステムで、活栓を置き換えるし、定期的に細菌や汚染を引き起こす他の微生物の増殖を防ぐために酸洗する任意のガラスの PSS の貯留層を対象と血管の反応性に影響を与えます。

2. ● キャニュレイテッド動脈準備

1. 5% イソフルラン Sprague-dawley ラットの麻酔し、1.5-2.5% 医療用酸素³⁶を使用して麻酔を維持します。また、ケタミン (75.0 mg/kg)、アセプロマジン (2.5 mg/kg)、およびキシラジン (10.0 mg/kg); を含む筋肉内注射を管理します。ペントバルビ タール (50-60 mg/kg); の腹腔内投与またはプロトコルおよび/または捜査官設定に応じて麻酔の他の承認された方法。
2. 深麻酔下でラットの首をはねるし、脳の抵抗血管の研究脳を削除します。
3. 脳を除去した後慎重に隔離中大脳動脈 (MCA) (または興味、例えば、脳底動脈や後大脳動脈の他の動脈)^37,38。岩国を分離するには、脳を冷たい PSS (図 2) でいっぱいのガラス シャーレに仰臥位にして配置します。
4. 脳から MCA を切除するのに Vannas はさみとデュモン #5 ファインチップ鉗子を使用します。 鉗子を使用して MCA から任意の残留脳組織をきれいにし、先ほど説明した PSS を含む温度制御容器チャンバーに動脈を転送します。^33,34 .
5. 容器室に動脈を転送するには、ACA または後部の通信動脈セグメントによる切除の容器を軽くつかみ、慎重に商工会議所に置きます。
   注: MCA、に加えて、● キャニュレイテッド容器システムはさまざまな骨格筋抵抗動脈^33,39,40, 腸間膜動脈をなど小型船舶の準備に最適です。^38,41,42、および大きい (一次) クレマスター筋⁴³、細動脈と同様にひと冠動脈細動脈と殿部生検^{44,45、中に皮下の脂肪組織から得られた人間の細 46,47}。
6. MCA の内腔に先に進むヒントまでピペット基部に向かって引っ張ることで動脈を流入マイクロ ピペットに接続します。10-0 縫合糸 (図 1 b) 動脈周囲から以前からかわ単一繊維繊維から調製したループを結ぶことによって流入ピペットの動脈を保護します。2 番目の縫合糸ループ (図 1 b) 容器の周りを引き締め、流出ピペットに MCA の反対側の端を固定します。
   注: 容器をマウントする前にマイクロ ピペットに縫合糸のループを配置、添付ファイルの最終的なポイントの近くに配置のリスクを最小に動脈で簡単にスリップして船が位置するときに迅速に保護できるように、動脈は、ピペットをオフにスライドします。
   注: マイクロ ピペット ホウケイ酸ガラス キャピラリー管 (2 mm 外径; 内径 1 mm、長さ 10 cm) から準備が垂直マイクロ ピペットの引き手を使用しています。動脈をアタッチする前に、マイクロ ピペットの先端の直径と灌流システムの流入と流出の抵抗のミスマッチを防ぐためにできるだけ密接に一致します。
7. 動脈は安全に、マイクロ ピペットに縛ら後、その場で長さに動脈をストレッチするのに流入ピペット ホルダーに接続されているマイクロメータを使用します。
8. 動脈に一定圧力を維持するために 10-0 縫合糸からからかわ単一繊維のすべての側枝を縛る。
9. 内圧 (貫) は、一時的に流入ピペットを閉じた後は一定であることを確かめて、リークの有無を確認します。任意の枝を結ぶまたは圧力が落ちる場合は、容器の穴をチェックします。経壁圧が一定であることを確認した後血流を復元します。
   注: 絶縁抵抗動脈カニュレーション手先の器用さと実践が必要です。観察される主な注意事項は、ピペットを破ることを避けるし、動脈が、ピペットをスライドされませんを確認してください。それは容器に外傷は、血管内皮細胞を損傷することが、全体の手順中に孤立した動脈に優しくすることが重要血管平滑筋の正常な機能を妨害および/または。
10. 解剖顕微鏡に接続されているし、ビデオのマイクロメータとテレビ モニター (図 1 b、1 C) に接続しているビデオカメラから成るビデオ顕微鏡セットアップ (図 1 a) を使用して動脈の内径を測定します。これにより、動脈の内側の壁に可動式の参照線を配置することによって手動で容器の直径を測定する観測者同様に、動脈の外側壁、血管壁の厚さを測定するために必要であれば。
    注: いくつかのビデオのマイクロメータは、容器寸法の自動追跡を提供しています。
    注: 顕微鏡ステージ マイクロメータと流入ビデオ マイクロメータの校正し、の正確な測定を保証するために実験の間の水銀マノメータ (0 mmHg、50 mmHg、100 mmHg、150 mmHg、200 mmHg) と圧力トランスデューサーを流出容器の直径、管腔内の圧力。
    注: ラット MCA 実験のため標準的な制御の経壁圧は 80 mmHg です。上位と下位の圧力レベルの校正は最大限に拡張した動脈圧と受動圧径曲線筋貫壁性の変化に対する研究の精度を保証します。
11. 一定のレベルで目的の経壁圧を維持する流入と流出の貯水池の高さを調整します。少量 (< 5 mmHg) によって流入貯水池を上げ、同じ量によって流出油層を下げる平均経壁圧を維持し、血管内腔⁶で血流を作成します。
    注: 流入貯水池を上げ、等しい量によって流出油層を下げる、動脈内の圧力を distending 同じ平均貫を維持しますが、流れとせん断応力は、船は、静水圧勾配を生成することができます、さまざまな実験グループ⁴⁸腔内せん断応力の変化に内皮依存性応答を評価する調査。
12. 筋原性反応と血管拡張刺激に対する血管反応を評価するために動脈が実験前にアクティブ トーン (約 40%) の適切なレベルを示すことを確認します。容器、例えば、アクティブな休息トーンを通常示さない小の腸間膜動脈を除いて安静時アクティブ トーンを欠けている任意の動脈を破棄します。
    注: 通常自発的なトーンを示さない、船のノルエピネフリンやフェニレフリンなどの血管収縮薬アゴニストを利用した相当額によって動脈を事前収縮します。事前動脈を収縮させるためアゴニストの投与量を選択するよい方法は、血管収縮剤、例えば、ノルエピネフリン^41,42EC₅₀線量を利用することです。しかし、薬理学的血管収縮剤は、安静時の条件自然アクティブ トーンを示す動脈に適用されませんする必要があります。
13. ACh 濃度の増加添加時血管径を測定することにより ● キャニュレイテッド抵抗動脈の内皮依存性反応性をテスト (10^-10 M-10^-5 M) 容器室へ。添加濃度 (10^-10 M-10^-5 M) に一酸化窒素ドナーのニトロプルシド ナトリウムの増加時血管径を測定することにより一酸化窒素内皮非依存性血管平滑筋の感度をテスト、容器室。
    注: 血管収縮剤やその他の血管拡張薬への感受性は、容器チャンバーにアゴニストの濃度を上げるを追加して同様の方法でテストすることができます。
    注: 血管作動物質に加えて様々 な薬、阻害剤、およびその他の薬理学的エージェント追加できます内腔液および/または組織のお風呂に。PO₂ (PCO₂と pH と同様) の変更選択、管理できます内皮側または動脈の余分の内腔側に内腔液の分離の平衡によって校正ガスの混合物に接続されている空気石組織バス^33,34,49で PSS を平衡に使用される混合物とは異なる。経壁圧の変化に筋の応答は流出ピペットを閉じるを上げることにより学ぶことができます (または下げる) PSS 貯水池の高さに流入のピペット^49,50,51に接続腔内の圧力を軽減します。
14. 特定の刺激に血管応答を仲介することで、内皮の役割をテストするため血管内皮を削除および血管内皮細胞の存在の有無でそれら刺激に対する血管反応を比較します。血管内皮細胞を削除するには、慎重に流出ピペットから動脈をほどくし、ゆっくり空気塊と動脈の内腔を灌流 (0.5 〜 1.0 mL)。空気潅流後再流出ピペット⁴³船を結ぶ前に細胞の残骸を消去する PSS 灌流を復元します。
    注: 内皮細胞の侵食手順だ血管内皮細胞が内皮依存血管拡張反応その容器の種類を生成する知られている血管作動薬 (通常 ACh) レスポンスをテストすることによって削除されていることを確認することが重要。ただし、特定の病理学の条件の場合は、内皮除去に続いて収縮反応を除去することを確認することが重要だ内皮依存性血管収縮薬は解放されます。
15. 実験の最後に、Ca^{2 +}を追加することによって、動脈の最大径を決定-出納および superfusate は PSS を無料します。アクティブな休息トーン (%) ((D_max-D_残り)/D_max) として、D_maxが Ca^{2 +}の存在下で最大直径 100 x を計算する-無料のソリューション、D_残りは休憩コントロール直径。
    注: 異なる実験グループに最大限にリラックスした動脈の直径測定、アクティブな休息トーン、構造改造 (すなわち壁の厚さと内腔の直径の変化)、受動的な機械的性質の比較で貴重です(経壁圧の異なるレベルでパッシブの直径から計算応力-ひずみ関係)。

3. LDF と脳血流量の応答の評価

1. 5% イソフルランと動物の麻酔、脳定位固定装置^9,10でラットを固定します。
2. 呼吸頻度、最後の潮 CO₂、およびつま先ピンチ³⁶と麻酔の深さを監視しながら一定の麻酔下の動物を維持します。
3. 光結合¹⁰を提供するために歯科用ドリルを低速と鉱物油を使用して半透明に頭蓋骨を慎重に薄い。過度の熱が生成されないようにし、骨を貫通しないように注意します。
   注: 移動粒子 (すなわち、赤い血液細胞) の数で決まる、ドップラー シフトを測定するために、プローブに戻って反映される基になる組織に到達するレーザー光により、頭蓋骨が薄くなるとその速度。
4. マイクロマニピュレーターの LDF プローブを確保し、頭蓋骨の間伐面積の上に直接位置します。実験では、LDF の組織の 1 つの制限された領域内の流れを測定するように設計し、は動きの人工物に非常に敏感、LDF プローブまたは自体、準備の動きを防ぐために非常に重要です。
   注: 初期位置からプローブの動きは比較は除外して、組織の別の領域で血流の推定値を提供します。LDF は絶対フロー値を提供しません、科目間の比較には適していません、それは個々 の科目で実験的介入への応答の組織灌流の変化を非侵襲的評価する優れた方法コントロールの値から LDF 信号の相対的な変化の平均および他の実験グループのコントロールから LDF 信号の変化に比較が可能します。
   注: LDF は異なる実験的グループ^8,9,10の全血管床のレベルで血流を規定する要因に洞察力を得るために便利な方法です。LDF と組織灌流の評価は、全体のベッドの観点に分離容器研究から得られた知識を吸収するための実用的なアプローチを提供します。抵抗動脈微小循環の血管制御機構の地域差を除いて LDF と得られる測定提供により得られた結果と概ね一致して組織血流コントロールの良い兆候● キャニュレイテッド動脈準備。

4. GS1 レクチンと骨格筋の微小血管密度の評価

1. 挙睾筋を雄ラットから標準微細手術用ハサミで陰嚢を切開し、筋肉を把握するデュモン #5 鉗子を使用して削除します。
   注: 薄い筋肉 (例えば挙睾筋と同様、伸筋総指筋と前脛骨筋前脛骨筋雄および雌ラットに見られる) に適している使用全体マウント レクチン研究として組織がセクションは、厚い組織に使用できます。
2. シングル カットを使用して睾丸から挙睾筋を削除します。冷たい PSS に配置し、底部の内側表面にシリコーンのエラストマー裏地付きシャーレにピンでアウト。優しく・ デュモン #5 鉗子を使用して距離の結合組織をいじめます。
3. 2 ml のバッファーに格納された PSS の筋サンプルをすすぐと、ローダミン標識 GS1 レクチン 12 ウェルの細胞培養プレート 2 mL で 50 分間 (20 μ g/mL PSS) に浸って/よく光を除外するアルミ箔に包まれています。
4. レクチン溶液から組織を削除、ロッカーの上 5 分の「洗う」孵化と PSS で 3 回すすぎ、顕微鏡のスライドにそれらをマウントします。暗闇の中で組織をインキュベートし、蛍光性の損失を防ぐために暗闇の中でスライドを保存ことを確認します。
   注: スライドをすぐに使用できない場合、保つことができる蛍光性の損失なしで冷蔵庫に。長期貯蔵スライドは劣化¹¹を防ぐために冷凍庫で保存できます。
5. ⁵²の画像上にスーパーイン ポーズ コンピューター生成グリッド線またはスライドを表示する使用されているモニターに重なって表示されるグリッドのクリア オーバーレイとラベル付きの微小血管の交差点の数をカウントすることによって微小血管密度を評価します。
   注: GS1 レクチンのアプローチは実証に使用されている: 塩誘起微小血管膨張⁵³塩を防止する保護効果による塩供給動物^{17 における微小血管密度の復元におけるアンジオテンシン II 抑制、53,54};塩で飼育されたラット¹⁷で微小血管膨張を防ぐために低用量アンジオテンシン II 注入の保護効果を仲介する NRF2 の役割またアンジオテンシンの役割を評価する塩の慢性的な筋肉刺激による血管新生反応を維持するために II 飼育ラット^54,55.GS1 レクチン技術の利点の 1 つは、同じ動物 ● キャニュレイテッド抵抗動脈または LDF の研究のための微小血管密度を評価するために使えます。

Results

● キャニュレイテッド抵抗血管の培養顕微鏡は、小さな抵抗動脈 (および大きい細動脈) のアクティブなトーンに影響を及ぼす要因の検討経壁圧正常生体内で実質細胞の不在影響します。種々 の血管拡張薬と血管収縮薬の刺激に血管と通常 PSS、Ca^{2 +}の経壁圧上昇に対する筋の反応性を評価するとともに-無料 PSS を出納し、superfusate の終わりに追加できます最大容器の径や壁の厚さを決定する実験。後者の測定が血管の改造は、すなわち血圧や薬理学的エージェントの管理の変更への応答で発生する壁/ルーメン比の変化を評価する上で非常に貴重です。Ca^{2 +}で最大限に拡張した血管径の計測-無料 PSS が 100、x ((D_最大の -D の_残り)/D_max) として本質的なトーンを計算する便利な D_maxと D_残りが最大 (Ca^{2 +}-PSS を無料) 制御の...

Discussion

述べる導入で説明した、ようテレビ顕微鏡を使用し、分離抵抗動脈だけでなく、標準ラットモデル (とビデオで採用)、血管機能評価へのアプローチがまたで専門性の高い遺伝子設計されたラット系統は、小説を示し、これらのアプローチを活用した得ることができる強力な洞察力。アクティブ トーンを評価するこれらの強力な技術の使用と受動的な機械的性質抵抗小動脈内皮依存性規制を含む血管制御メカニズムの広いスペクトルに関する重要な情報を提供できます。抵抗血管でアクティブなトーンの正常と病態生理学的条件、受動性動脈の血管平滑筋機能は血管リモデリングに関連し、血管壁の力学の変化します。内皮機能不全は心血管関連死⁶³, を含む人間の複数の不利な心血管イベントの強力な予後指標が示されているし、● キャニュレイテッド抵抗動脈準備がで特に貴重なもの内皮機能不全により、内皮機能障害のメカニズムの私達の理解を高めることです。

分離抵抗血管を用いたビデオ顕微鏡技術の in vitroの有効性を示すためには、我々 は例を新規コンソミック、ダール食塩感受性 (SS)...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
ウィスコンシン	SSラット	SS / JHs / Mcwi株	連絡先博士アロンGeurts博士(ageurts@mcw.edu)
SS.5BN	ウィスコンシン	SS-Chr 5BN/Mcwi株	お問い合わせ博士アロンGeurts博士(ageurts@mcw.edu)
SS.13BNウィスコンシン州のコンソミックラット	医科大学	SS-Chr 13BN/Mcwi株	お問い合わせDr.アロンGeurts(ageurts@mcw.edu)
Ren1-BNウィ	スコンシンSSの	。BN-(D13HMGC41-D13)hmgc23 / Mcwi株	連絡先博士Aron Geurts(ageurts@mcw.edu)
Ren1-SSAウィ	スコンシンSSの	。BN-(D13RAT77-D13RAT105 / MCWI株	連絡先博士アロンGeurts(ageurts@mcw.edu)
REN1-SSBウィ	スコンシンSSの	。BN-(D13RAT124-D13RAT101/Mcwi株	連絡先博士アロンGeurts（ageurts@mcw.edu)
Nrf2（-/-)ノックアウトラットと野生型同腹仔ウィ	スコンシン医科大学	SD-Nfe212em1Mcwi株	連絡先博士Aron Geurts（ageurts@mcw.edu)
低塩ラットチョウ）(0.4%NaCl)-AIN-76A	デエッツ株式会社
高塩ラットチョウ(4%NaCl)-AIN-76A	Dyets, Inc.
113756 コロラドビデオキャリパー	コロラドビデオ株式会社	モデル308
カメラ	日立	KPM1AN
顕微鏡	オリンパスライフサイエンス	CKX41
テレビモニター	パナソニック	WVBM1410
圧力トランスデューサー	ストールティング	56360
血圧表示ユニット	ストールティング	50115
カニューレ付き動脈チャンバー	リビングシステム計装	CH-1	一般用シングルチャンバー
シングルチャンバー用温度調節器	リビングシステム計装	TC-09S
ガス分散管、ミニチュア、ストレート	リビングシステム計装	GD-MS	容器バス内の曝気を提供
ガス交換酸素供給器、ミニチュア	リビングシステム計装	OX	灌流水とのガス交換が可能
レーザードップラー流量計	Perimed	PeriFlux 5000 LDPM
GS1 Lectin	Vector Labs	RL-1102
マイクロピペット用ガラスキャピラリーチューブ	Fredrich Haer Co.	27-33-1	2 mm ODX1 mm
ID垂直ピペットプーラー	David Kopf Instruments	Model 700C
ナイロン縫合材料 (10/0)-3 PLY	Ashaway Line and Twine Manufacturing Co.	114-ANM-10	血管で使用するためにからかわれた 3 層ナイロン縫合糸の 1 本鎖
Dumont #5 Forceps-Inox	ファイン サイエンス ツール	11254-20
Vannas はさみ	ファイン サイエンス ツール	15003-08
プロタンディム	プロタンディム		NRF2 インデューサー: ジョー・マッコード博士 (JOE.MCCORD@UCDENVER.EDU)
塩化ナトリウム	フィッシャー バイオ試薬	BP358-212
重炭酸ナトリウム	ッシャーケミカル	S233-3
キストロース(d-グルコース)無水フィ	ッシャーケミカル	D16-500
マグネシウム(MgSO4-7H2O)	シグマアルドリッチ	M1880-500G
塩化カルシウム(CaCl2-2 H2O)	シグマ	C5080-500G
リン酸ナトリウム-一塩基性(NaH2PO4)	シグマ	S0751-500G
塩化カリウム(KCl)	フィッシャーケミカル	P217-500G
エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム塩二水和物(EDTA)	シグマ	ED255-500G