本稿では、ラット脳の抵抗血管での血管の機能を評価するためのビデオ顕微鏡検査のプロトコル体外について説明します。原稿もレーザー レーザードップラー血流計を用いた蛍光に分類されたレクチンと組織潅流と微小血管密度を評価するための手法を説明します。
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この記事について
サマリー
要約
このプロトコルの分離脳抵抗動脈 (と他の船舶) の血管機能を評価するための in vitroテレビ顕微鏡の使い方について説明し、レーザー ドップラー血流計 (LDF を使用して組織の血流を評価するための手法について説明します) と蛍光を用いた微小血管密度グリフォニア simplicifolia (GS1) レクチンをラベル付けします。現在の勉強方法貫圧力発生体内抵抗血管を分離、実質細胞の影響のない状態で生体内での研究と分子から得られる情報との間の重要なリンクを提供個体レベルでの統合的な応答に限られた洞察力を提供する還元主義的アプローチ。LDF とテクニックは、GS1 の蛍光標識レクチンと細動脈と毛細血管を選択的に識別するためには、分離抵抗血管の研究から得られた知識を拡張する捜査官を可能にする実用的なソリューションを提供します。本稿血管生理学一般実験モデルとしてラットの病理学の基礎的知識を得るためにこれらの技術の応用と専門の様々 な提供することができます「デザイナー」ラット系統遺伝子組み換え特定の遺伝子が重要な血管表現型に与える影響の重要な洞察力。ノックアウト マウス モデルで開発した科学的前提の厳しさを拡大する選択的な繁殖戦略と、ラットの遺伝子ノックアウト モデルを生産するための新しい技術によって開発されたラット系統でこれらの貴重な実験的アプローチを活用し、人の知識をよく理解の生理学的背景とサイズが大きいため生体への適合性、関連性の高い動物モデルを拡張します。
概要
多くの利用動脈導管動脈における血管機能の初期の研究の場合、大動脈です。太い動脈の力発生一般的に動脈のリング セグメントを組織内の力覚センにアタッチすることにより検討しました。大動脈の場合ヘリカル切削によってストリップ容器の平滑筋線維間の接続点との収縮によって発生する力の最良推定値を提供するために、力覚セン縦方向に指向されたので、その縦軸に沿って平滑筋。大動脈のヘリカル ストリップを切断するための標準的な方法は、血管の内腔にガラス棒を置いて、希望の角度で血管壁に切れ込み、カットは全体を生成する拡張された血管壁の露出の端の端につかまって容器のヘリカル ストリップ。その時点では、血管の内皮側だった容器ストリップを合力トランスデューサーに接続して、酸素の準備を水没前に破片を削除する一般的に消された、温度制御組織バス。最終的には、アプローチが Furchgott、Zawadski1、すなわち内皮の役割によって生理学の歴史の中で最も有名で重要な発見の一つにつながった由来リラックス因子 (EDRF)、その後に窒素酸化物で識別されます。血管機能を調節します。その発見につながる重要なイベントは調査官が外部表面と動脈の内皮側との接触を避けることでそのまま血管内皮細胞を維持し、大動脈のストリップは予想される展示していないことに気づいた状況アセチルコリン (ACh) が、ACh の応答の代わりにリラックスに収縮します。その観察に基づいて、調査官大動脈の標準はすばのストリップを (しかし、収縮力を生成できませ....
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プロトコル
大学のウィスコンシン州機関動物医療および使用委員会 (IACUC) 承認本稿に記載されているすべてのプロトコルとすべての手順に準拠して、国立衛生研究所 (NIH) オフィスの実験室の動物福祉 (OLAW)規制。
1. ソリューションおよび容器室の準備
- 一連の実験を行う前に準備 278 g/L; 塩化ナトリウムから成る塩ストック溶液 x 20 の 2 L14 g/L 塩化カリウム;11.52 g/L MgSO4.7 H2O;9.4 g/L CaCl2.2 H2o.また 80.8 g/L NaHCO3と 0.4 g/L, EDTA から成る濃縮緩衝在庫 × 20 の 2 L を準備し、20 倍の 2 L が集中して Ca2 +-無料原液 281.6 グラム/L の NaCl; から成る14 g/L KCl と 11.52 g/L MgSO4.7 H2o.
注: 原液 X 20 は、使用するまで冷蔵庫に格納することができます。 - 実験の日、準備 2 L 生理的食塩水 (PSS) の濃縮原液 x 20 から次のように: 1,800 mL の脱イオン水 2 L 三角フラスコまたは電動攪拌板のビーカーに加え....
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結果
● キャニュレイテッド抵抗血管の培養顕微鏡は、小さな抵抗動脈 (および大きい細動脈) のアクティブなトーンに影響を及ぼす要因の検討経壁圧正常生体内で実質細胞の不在影響します。種々 の血管拡張薬と血管収縮薬の刺激に血管と通常 PSS、Ca2 +の経壁圧上昇に対する筋の反応性を評価するとともに-無料 PSS を出納し、superfusate の終わりに追加できます最大容器の径や壁の厚さを決定する実験。後者の測定が血管の改造は、すなわち血圧や薬理学的エージェントの管理の変更への応答で発生する壁/ルーメン比の変化を評価する上で非常に貴重です。Ca2 +で最大限に拡張した血管径の計測-無料 PSS が 100、x ((D最大の -D の残り)/Dmax) として本質的なトーンを計算する便利な Dmaxと D残りが最大 (Ca2 +-PSS を無料) 制御の.......
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ディスカッション
述べる導入で説明した、ようテレビ顕微鏡を使用し、分離抵抗動脈だけでなく、標準ラットモデル (とビデオで採用)、血管機能評価へのアプローチがまたで専門性の高い遺伝子設計されたラット系統は、小説を示し、これらのアプローチを活用した得ることができる強力な洞察力。アクティブ トーンを評価するこれらの強力な技術の使用と受動的な機械的性質抵抗小動脈内皮依存性規制を含む血管制御メカニズムの広いスペクトルに関する重要な情報を提供できます。抵抗血管でアクティブなトーンの正常と病態生理学的条件、受動性動脈の血管平滑筋機能は血管リモデリングに関連し、血管壁の力学の変化します。内皮機能不全は心血管関連死63, を含む人間の複数の不利な心血管イベントの強力な予後指標が示されているし、● キャニュレイテッド抵抗動脈準備がで特に貴重なもの内皮機能不全により、内皮機能障害のメカニズムの私達の理解を高めることです。
分離抵抗血管を用いたビデオ顕微鏡技術の in vitroの有効性を示すためには、我々 は例を新規コンソミック、ダール食塩感受性 (SS).......
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開示事項
著者は競合する金融興味を持ってないです。
謝辞
著者は表現、心からケイティ Fink とリン Dondlinger のおかげで、この原稿の準備のために貴重な援助。
助成: NIH #R21-OD018309;#R56-HL065289;#R01 HL128242。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| ウィスコンシン | SSラット | SS / JHs / Mcwi株 | 連絡先博士アロンGeurts博士(ageurts@mcw.edu) |
| SS.5BN | ウィスコンシン | SS-Chr 5BN/Mcwi株 | お問い合わせ博士アロンGeurts博士(ageurts@mcw.edu) |
| SS.13BNウィスコンシン州のコンソミックラット | 医科大学 | SS-Chr 13BN/Mcwi株 | お問い合わせDr.アロンGeurts(ageurts@mcw.edu) |
| Ren1-BNウィ | スコンシンSSの | 。BN-(D13HMGC41-D13)hmgc23 / Mcwi株 | 連絡先博士Aron Geurts(ageurts@mcw.edu) |
| Ren1-SSAウィ | スコンシンSSの | 。BN-(D13RAT77-D13RAT105 / MCWI株 | 連絡先博士アロンGeurts(ageurts@mcw.edu) |
| REN1-SSBウィ | スコンシンSSの | 。BN-(D13RAT124-D13RAT101/Mcwi株 | 連絡先博士アロンGeurts（ageurts@mcw.edu) |
| Nrf2（-/-)ノックアウトラットと野生型同腹仔ウィ | スコンシン医科大学 | SD-Nfe212em1Mcwi株 | 連絡先博士Aron Geurts（ageurts@mcw.edu) |
| 低塩ラットチョウ）(0.4%NaCl)-AIN-76A | デエッツ株式会社 | ||
| 高塩ラットチョウ(4%NaCl)-AIN-76A | Dyets, Inc. | ||
| 113756 コロラドビデオキャリパー | コロラドビデオ株式会社 | モデル308 | |
| カメラ | 日立 | KPM1AN | |
| 顕微鏡 | オリンパスライフサイエンス | CKX41 | |
| テレビモニター | パナソニック | WVBM1410 | |
| 圧力トランスデューサー | ストールティング | 56360 | |
| 血圧表示ユニット | ストールティング | 50115 | |
| カニューレ付き動脈チャンバー | リビングシステム計装 | CH-1 | 一般用シングルチャンバー |
| シングルチャンバー用温度調節器 | リビングシステム計装 | TC-09S | |
| ガス分散管、ミニチュア、ストレート | リビングシステム計装 | GD-MS | 容器バス内の曝気を提供 |
| ガス交換酸素供給器、ミニチュア | リビングシステム計装 | OX | 灌流水とのガス交換が可能 |
| レーザードップラー流量計 | Perimed | PeriFlux 5000 LDPM | |
| GS1 Lectin | Vector Labs | RL-1102 | |
| マイクロピペット用ガラスキャピラリーチューブ | Fredrich Haer Co. | 27-33-1 | 2 mm ODX1 mm |
| ID垂直ピペットプーラー | David Kopf Instruments | Model 700C | |
| ナイロン縫合材料 (10/0)-3 PLY | Ashaway Line and Twine Manufacturing Co. | 114-ANM-10 | 血管で使用するためにからかわれた 3 層ナイロン縫合糸の 1 本鎖 |
| Dumont #5 Forceps-Inox | ファイン サイエンス ツール | 11254-20 | |
| Vannas はさみ | ファイン サイエンス ツール | 15003-08 | |
| プロタンディム | プロタンディム | NRF2 インデューサー: ジョー・マッコード博士 (JOE.MCCORD@UCDENVER.EDU) | |
| 塩化ナトリウム | フィッシャー バイオ試薬 | BP358-212 | |
| 重炭酸ナトリウム | ッシャーケミカル | S233-3 | |
| キストロース(d-グルコース)無水フィ | ッシャーケミカル | D16-500 | |
| マグネシウム(MgSO4-7H2O) | シグマアルドリッチ | M1880-500G | |
| 塩化カルシウム(CaCl2-2 H2O) | シグマ | C5080-500G | |
| リン酸ナトリウム-一塩基性(NaH2PO4) | シグマ | S0751-500G | |
| 塩化カリウム(KCl) | フィッシャーケミカル | P217-500G | |
| エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム塩二水和物(EDTA) | シグマ | ED255-500G |
参考文献
- Furchgott, R. F., Zawadzki, J. V. The obligatory role of endothelial cells in the relaxation of arterial smooth muscle by acetylcholine. Nature. 288, 373-376 (1980).
- Bevan, J. A., Osher, J. V. A direct method for recording tension ....
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再版と許可
