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方法論記事

マウス コリン欠乏エチオニン (CDE) ダイエット慢性肝障害モデル

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DOI:

10.3791/56138

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2017年10月21日

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1School of Biomedical Sciences & Curtin Health Innovation Research Institute, Curtin University, 2School of Public Health & Curtin Health Innovation Research Institute, Curtin University, 3Institute of Biochemistry, Christian-Albrechts-University, 4School of Veterinary and Life Sciences, Murdoch University, 5Centenary Institute of Cancer Medicine and Cell Biology, The University of Sydney, 6Royal Prince Alfred Hospital, 7A.W. Morrow Gastroenterology and Liver Centre, 8QIMR Berghofer Medical Research Institute, 9Faculty of Medicine and Biomedical Sciences, The University of Queensland, 10Fiona Stanley and Fremantle Hospitals, 11School of Medical and Health Sciences, Edith Cowan University, 12School of Medicine and Pharmacology, University of Western Australia

この記事について

サマリー

ここで我々 はコリン欠乏とエチオニン (CDE) の食事療法の供給によって慢性肝障害モデルマウスを誘導する一般的な方法をについて説明します。正常性の監視、肝灌流、分離、および保存を示します。6 週間の経過は肝障害、pathohistology、炎症、線維化、肝前駆細胞の応答について知らせることができます。

要約

ウイルス性肝炎、アルコール性肝疾患、非アルコール性脂肪性肝疾患などの慢性肝疾患は肝実質, 肝前駆細胞の再生、進歩的な破壊継続的な炎症によって特徴付けられる増殖、および線維化。あらゆる慢性肝疾患の末期、肝硬変、肝細胞癌の開発のための主要な危険因子です。病気の発生・進行を調節するプロセスを研究所でいくつかの動物モデルを使用します。ここでコリン欠乏/エチオニン (CDE) マウス モデルのコリン欠乏チョウと 0.15 %dl エチオニン飲む水で 6 週間の古い男性 c57bl/6 j マウスを餌を含む 6 週間経過について述べる。動物の健康と体の典型的な重量損失曲線の監視、説明します。プロトコルは、その後血清分析用心臓穿刺によって CDE 治療肝臓と血液コレクションの総検査を示します。次に、肝灌流法と標準的な評価のための異なる肝葉のコレクション、ヘマトキシリンとエオシンまたはシリウス赤染色、肝細胞の蛍光検出による表示などの肝組織評価トランスクリプトームの肝の微小環境のプロファイル。このモデルマウスは、炎症性を勉強して、線維形成性、および肝前駆細胞ダイナミクスにより誘起された慢性肝疾患とこれらのプロセスを調節することができる潜在的な治療上のエージェントをテストするために適しています。

概要

肝臓は体の最大の腺代謝器官で、多くの複雑な機能。肝臓の重要な役割は、消化、代謝、解毒、ストレージ必須栄養素の血血しょう蛋白質成分とクッパー細胞やマクロファージを介した免疫の生産に含まれます。肝臓はその総質量の 70-90% までが失われた場合でもを再生する偉大な能力。急性の肝障害が発生した場合切除またはアセトアミノフェン中毒、次見られるような残りの健康な肝細胞は非常に調整されたプロセス1の損傷を修復する増殖します。しかし、肝細胞が慢性的な長期的なウイルス感染、アルコールや非アルコール性脂肪肝疾患、負傷炎症性微小環境トリガー線維症運転肝星細胞の活性化と、胆管や肝細胞2,3,4,5に分化する可能性を秘めた肝前駆細胞 (Lpc) の増殖。正確な起源 Lpc、肝再生と肝発癌への貢献の分化運命は激しい議論のトピックをされているし、ほとんど損傷重症度およびコンテキスト2によって異なります。早期再生関連のイベントの順序はまた論争的に論議、肝星細胞の活性化と行列を改造が LPC を好むニッチ6、他の世代のために不可欠であるといういくつかの捜査でレポートは、LPC 拡張といわゆる管状反応がトリガー維7に必要。病気の進行を調節するすべての根本的な要因を理解し、最終的に患者の8のための新しい処置の作戦を開発する試みの傷害と再生の特定の側面を研究する多くの動物モデルがあります。

コリン欠乏とエチオニン (CDE) の食事モデルはもともとラットで使用するため開発され、慢性肝障害マウス9,10誘導後に変更されました。コリンの栄養欠乏は、障害者のアセンブリと非常に低密度リポタンパク質の分泌の結果します。Hepatocarcinogen DL-エチオニンを組み合わせると、この療法はロードすると、継続的な炎症、線維症 periportal、LPC 応答過度の肝脂肪につながるし、長期にわたって肝細胞癌開発11,12.しかし、重要なは、異なるマウス系統展示、炎症性の線維と LPC の独特パターン応答ダイナミクス13。このプロトコルでは、慢性肝障害誘導で最もよく使用される c57bl/6 j マウス近交系マウスの緊張について説明します。

慢性の肝臓病の研究で典型的な分析を含めるヘマトキシリンとエオシンとシリウス赤染色コラーゲン沈着、免疫組織化学的、または肝細胞の蛍光検出による組織学的評価複雑な成長因子とサイトカイン ネットワーク14,15,16,17を介して誘導される携帯電話の変更を調整する肝の微小環境のトランスクリプトーム解析,18。

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プロトコル

1 です動物実験

カーティン大学動物倫理委員会で承認されたこの調査に記載されているすべての動物実験 (承認番号: AEC_2014_28) の開始前に、。実験し、ケアとの動物の使用のためのオーストラリアのコードに従って実行されます

。
  1. 動物
    1. 実験のための 6 週間の古い男性 c57bl/6 j マウスを使用します
      2. 。
  2. 実験デザイン
    1. 次の動物施設に到着後、実験の開始前に 4 日間を慣らすためにネズミを許可します
      2. 。 ソフトコーテッドもみ殻寝具、目に見える粒と茎の枯渇されているありで 12 時間昼/夜サイクルにマウスを個別に維持に
    2. 家のマウスは、ケージを通気します。3 つと、7 日に寝具の変更、毎週その後
      3. 。
    3. コリン欠乏への 自由 アクセスを提供するマウス ダイエットと DL-エチオニンの 0.15% を添加した水を飲む。4 ° C で水を DL エチオニン添加を維持し、新鮮さを保障し、飲酒を奨励する飲料水 1 日おきを交換します。コリン欠乏食事週に 1 回の食事の完全な変化を 1 日おきにトップアップ
      4. 。
    4. 観察マウス安静時および処理中に。全体的な外観、姿勢、社会的相互作用、グルーミング、動物の健康のモニター規格記号状態をコートし、本体重量します
      5. 。 20% 以上を展示、動物体の減量を確保するための実験の最初の 2 週間の間に毎日
    5. 重さマウスは不必要な苦しみを制限する安楽死させた。これは通常動物の 5% 未満の場合です。2 週間後、計量の周波数を 3 倍に減らすことが (例えば 月曜日、水曜日、金曜日) の毎週
      6. 。
  3. 肝灌流および分離
    1. 腹腔内投与によるケタミン (100 mg/kg) とキシラジン (10 mg/kg) (CDE の食事療法 1、2、および 6 週間における) 示された時点でマウスを麻酔します。適切な麻酔を確保するためペダルの逃避反射をテストします
      2. 。
    2. は 70% のエタノールで毛皮をウェットし、マヨはさみを使って横隔膜まで腹部壁の垂直正中切開を行います。胸郭は、中心部に簡単にアクセスを削除できます
      3. 。 25 x 1/2 を使用して遅い心臓穿刺によって
    3. 収集血 " 心の崩壊を避けるために規則的な壁針。血液遠心チューブ 10 分 2,000 × g で遠心分離後、血清サンプルを取得するために室温で凝固を許可します。その後、標準的な手順 12 でアラニン トランスアミナーゼ血清を測定します
      4. 。
    4. は、胃と小腸を側に移動し、門脈を公開します。許可を終了し滅菌リン酸緩衝と肝臓を灌流液を生理食塩水にマヨはさみを使用して心臓をカット (pH 7.4 を =) 27 x 1/2 を使用して門脈を cannulating によって " 規則的な壁針。均等に湯通し肝臓はすべて肝葉の正常な血流を示します
      5. 。
    5. は慎重に肝を外し、鉗子とマヨのはさみを使用してシャーレに配置。過剰、肝臓以外の組織と胆嚢を削除します
      6. 。
  4. 肝臓保全
    1. 総肝重量が記録されている、いくつかの平方ミリメートルのいくつかの小さな断片に 1 つの小葉をカットした後の生殖不能の管にそれらを転送とスナップ-凍結液体窒素後 rna標準プロトコルに従っての蛋白質の抽出。組織の劣化を防ぐため、オルガン コレクション後できるだけ早くこれらの組織の部分に凍結します
      2. 。
    2. 標準のプロトコルに従って後の処理、パラフィン包埋、10% 中性緩衝ホルマリンで 1 つの葉を収集します
      3. 。
    3. 最適切削温度 cryomatrix 樹脂を埋め込むことでいっぱいとスナップ-凍結液体窒素で金型内に 1 つの葉を配置します
      4. 。

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結果

CDE 誘発慢性肝障害の 6 週間の時間にわたって、日 7 (誘導段階)、14 と 21 (確立フェーズ)、42 (メインテナンス) パラメーターを評価しました。コントロール マウスと比較して、CDE 投与マウスは初期適応段階で初期体重の 20% までを失い、設置と保守のフェーズ(図 1)で体重を取り戻すために傾向があります。体重だったに反比例するアラニン トランスアミナーゼ血清肝障害(図 2)のインジケーター。4 マイクロ メートル薄い、ホルマリン固定、パラフィン包埋の肝組織切片ヘマトキシリンとエオシン肝のアーキテクチャを評価するために染色された.健康な肝臓には、肝実質を形成、中心静脈から放射される肝細胞の整然としたコードで通常のアーキテクチャが表示されます。対照的に、CDE 治療肝臓は誘導と確立段階とメインテナンス(図 3

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ディスカッション

慢性肝疾患は多くの場合ほとんどの患者は無症候性であるが、サイレント病と罹患率と死亡率の世界的な主要な貢献の 1 つです。慢性アルコール依存症、C 型肝炎ウイルス感染の主要な原因。慢性肝障害は肝の炎症によって特徴付けられる線維症と重症肝硬変・癌・最終的に肝不全。利用可能な現在いる治療法はないと主要な進歩は肝疾患のメカニズムを理解するためになされた、新しい治療の道がまだ緊急必要。

CDE 国会は誘導と脂肪や脂肪肝、炎症、線維化、LPC 増殖させ、長期的な実験は、肝細胞癌6 の開発研究のための時間効果的なシンプルな簡単に管理できるモデル ,11,12,13,16,17。ラット

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開示事項

何も作者によって開示することがありません。

謝辞

この作品は、国立保健医療研究評議会 (NHMRC) のオーストラリア (APP1042370、APP1061332、APP1087125) からの助成金によって支えられました。著者は、テクニカル サポートにカーティン健康イノベーション研究所スタッフに感謝したいと思います。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
生後6週齢の雄C57BL/6Jマウス 西オーストラリア州動物資源センター、ワシントン州マードック、 オーストラリアN/A
10 Kg スチームカット ホイーテン チャフ スペシャルティフィード、グレンフォレスト、ワシントン州、オーストラリア N/A
灌漑用水 1000mlボトル(バクスター) サージカルハウス、パース、ワシントン州、オーストラリア 
コリン-欠乏食、改良型(ペレット) MP Biomedicals Australasia Pty Limited, WA, Australia 02960210
DL-エチオニン シグマ・アルドリッチ、キャッスルヒル、ニューサウスウェールズ州、 オーストラリア E5139-25G
ケタミル注射 Troy Laboratories Pty Limited, Glendenning, NSW, Australia N / AIlum
ラジル-20注射 Troy Laboratories Pty Limited, Glendenning, NSW, Australia N / A
27G x 1/2 "、レギュラーウォールニードル Terumo Australia Pty Limited, NSW, Australia NN-2713R
テルモ 1ml・10mlシリンジ Terumo Australia Pty Limited, Macquarie Park, NSW, Australia 1018242、1018037
Tissue-Tek OCTコンパウンド VWR International Pty Limited, Tingalpa, QLD, Australia 25608-930
中性緩衝ホルマリン Amber Scientific、ミッドヴェール、ワシントン州、オーストラリア NBF-2.5L
エタノール絶対 anaLaR normalpur VWR International Pty Limited, Tingalpa, QLD, Australia 20821.33
Superfrost Plus スライド Grale Scientific Pty Limited, Ringwood, VIC, Australia 
Dako Protein Block, 無血清 Dako Australia Pty Limited, North Sydney, NSW, Australia  X090930-2
Dako 抗体希釈剤 Dako Australia Pty Limited, North Sydney, NSW, Australia  s0809
ラット抗CD45 eBioscience、サンディエゴ、カリフォルニア州、米国 m0701 1/200希釈
ウサギの抗パンCK Dako Australia Pty Limited, North Sydney, NSW, Australia  Z06221/300希釈ヤ
ギ抗ウサギ(Alexa Fluor 488)Life Technologies Australia Pty Limited, Mulgrave, VIC, AustraliaA-110081/500希釈ヤ
ギ抗ラットIgG(Alexa Fluor 594) Life Technologies Australia Pty Limited, Mulgrave, VIC, Australia A-110071/500
ProLong Gold退色防止剤(DAPI付き) Life Technologies Australia Pty Limited, Mulgrave, VIC, Australia P36935  
Picrosirius Red Stain KitPolysciences Inc., Warrington, PA, USA ab150681 
AHF7114AキシSF41296SP希釈

参考文献

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