Method Article

サンプル抽出、ドキソルビシン、マイトマイシン C 以下の組み合わせへのドラッグデリバリー ナノ粒子の担癌マウスの同時のガスクロマトグラフィーによる定量

DOI:

10.3791/56159

⸱

October 5th, 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Pharmaceutical Sciences, University of Toronto, 2Departments of Medical Biophysics and Radiation Oncology, University of Toronto, Ontario Cancer Institute, University Health Network

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

このプロトコルは、サンプル抽出の効率的かつ便利な分析プロセスと心肺毒性 DOX 代謝物、生物学的に doxorubicinol (DOXol)、マイトマイシン C (MMC)、ドキソルビシン (DOX) 複数の薬の同時定量法について説明します。相乗効果薬の組み合わせのナノ粒子製剤の前臨床乳房腫瘍モデルからサンプルが扱われます。

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

併用化学療法クリニックでのがん治療に多用します。ただし、正常組織に関連付けられている副作用は、その治療の恩恵を制限があります。ナノ粒子ベースの薬の組み合わせは、遊離型薬物併用療法で発生する問題を軽減するために示されています。私たちの以前の研究が 2 つ、抗がん剤ドキソルビシン (DOX) とマイトマイシン C (MMC) の組み合わせを示す、両方のマウスに対する相乗効果を生産、ひと乳癌細胞の in vitro。DOX と MMC の共同読み込まれたポリマー脂質ハイブリッド ナノ粒子 (DMPLN) には、多剤耐性と乳房腫瘍モデルで実証された効果を与える各種の排出トランスポーター ポンプがバイパスされます。従来のソリューションのフォームと比較して、DMPLN のような優れた効果は、DOX と MMC により、ナノキャリア pln へ腫瘍細胞内で増加した細胞内薬物バイオアベイラビリティの同期の薬物動態に起因しました。

薬物動態と生物の分布を評価するには、共同投与 DOX と MMC 無料のソリューションでナノ粒子の形態、逆相分配高速液体クロマトグラフィー (HPLC) を使用してシンプルで効率的な多剤の分析法開発しました。プラズマで DOX または MMC を個別に分析メソッドは以前に報告したと対照をなしてこの新しい HPLC メソッドは DOX、MMC および主要な心臓毒性 DOX 代謝物、様々 な生物学的マトリックス (の doxorubicinol (DOXol)、同時に量的に表わすことができます。例えば、全血、乳房の腫瘍と心)。デュアル蛍光灯や紫外線吸収プローブ 4-メチルウンベリフェロン (4 MU) は、異なる検出波長の複数の薬品分析学ワンステップ検出用内部標準 (インフォメーションシス テムズ) として使用されました。このメソッドが正常に終了すると、DOX と全血でのナノ粒子とソリューションの両方のアプローチと同所性乳房腫瘍マウスモデルのさまざまな組織によって提供される MMC の濃度を決定するためにしました。分析手法は、薬剤の組合せのナノ粒子ベースの配信の前臨床試験の解析のための便利なツールです。

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

まだそれは重大な副作用と薬剤耐性のため限られた有効性と他の要因1,2,3に関連付けられて多くの場合、化学療法は多くのがんの主な治療法です。化学療法の結果を改善するために薬レジメンは非重複毒性、薬物作用、および非クロス薬剤抵抗4,5のさまざまなメカニズムなどの考慮事項に基づいて診療所に適用されています。,6。 臨床試験で、より良い奏効率がしばしば観察された連続的な薬物配信7,8のレジメンと比較して薬剤の併用投与を同時に使用します。ただし、無料薬剤のサブ最適な生物分布、複数の薬の同時投与は治療効果9,10,11を上回る著名な正常組織毒性を引き起こすことができます。ナノキャリアを用いたドラッグデリバリー システムは、薬物動態およびカプセル化された薬剤、腫瘍ターゲット蓄....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

すべての動物実験は動物ケア委員会の大学健康ネットワークによってオンタリオ癌研究所で承認されカナダ評議会動物ケアのガイドラインに従って実施します

。

1 生物試料

  1. 全血、の主要な臓器を収集し、含んでいる薬の静脈投与後の所定の時点で胸の腫瘍製剤 (は 例えば、。DMPLN、リポソーム DOX)
    1. 準備薬を含む製剤で乳房担癌マウス静注を挿入します
      2. 。
    2. 密閉室に吸入 2% イソフルランを与えることによって指定された時間ポイント (例えば、15 分) でマウスを麻酔します
      3. 。
    3. 背中に麻酔下のマウスを置くし、鼻を通す 2% イソフルランを常に供給するノーズピース
      。 注: マウスは、深い麻酔を受けるためには、そっとでピンチ マウスとけいれん動きを見ての前部肢
      4. 。
    4. 70% エタノールを用いた胸部と腹部領域を徹底的に掃除し、ヘパリン 1 mL シリンジと 23 G 針を使用して深い麻酔下マウスの心臓穿刺のターミナルの手順を実行します
      5. 。
    5. 収集全血にラベル付けされたナトリウム ヘパリンはプラスチック製のチューブを噴霧し、優しく収集した全血が管の壁のコーティングのヘパリンと接触するようにチューブを旋回します。50 μ L の全血の最小値を収集します。氷のサンプルを常に保つ
    6. は、セ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

2 つの抗がん剤、DOX MMC と DOX 代謝物、DOXol、同時に蛍光と UV 検出器の両方に、インフォメーションシス テムズとして 4 MU を使用同じ適用勾配高速液体クロマトグラフィー条件下で生物学的干渉されることがなく検出されました。DOX、MMC、DOXol、4 MU DOX (図 2) 11.1 分 4 MU 10.9 分、DOXol 10.4 分 MMC の 5.7 分の保持時間をお互いから十分に分離されました。それぞれの薬の血中および種々 の臓器相関係数 (R2) (図 3および表 1) 1.00 0.98 に至る濃度直線性を示した。DOX、DOXol、MMC の定量 (LLOQ) の下限値それぞれ 10 ng/mL, 10 ng/mL と全血と 25 ng/mL、25 ng/mL と様々 な組織で 200 ng/mL で 100 ng/mL であった .......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

一度に単一の薬剤の検出を有効にする他のクロマトグラフィー法と比較して、現在の高速液体クロマトグラフィーのプロトコルが同時に変更することがなく同じ生物学的マトリックスの 3 つの薬剤化合物 (DOXol、MMC、DOX) 量的に表わすことができます。移動相。この準備と分析メソッドを正常に薬物動態と生物分布 2 ナノ粒子を用いたドラッグデリバリー システムの決定に適用されている (すなわち、リポソームの DOX と DMPLN)22。ペグ化ナノ粒子高血中薬物濃度の時間の長い期間にわたって結果読み込まれた薬物の全身循環を長引かせるので (> 24 h)、記述されているガスクロマト グラフ法は大規模なサンプル分析のためコスト効果の高いナノ粒子は、前臨床試験22薬剤の組合せを共同読み込まれます。DOX の無料のソリューションと図 4に示すようにリポソーム DOX の薬物動態、齧歯動物

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

著者競合する金銭的な利益と利益相反があります。

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

著者に感謝健康研究 (機構) とカナダ乳がん癌研究 (CBCR) のカナダの研究所から営業許可高速液体クロマトグラフィーの自然科学・ エンジニア リング研究 (レベル) カナダ評議会から機器の助成金X.Y. 呉に同盟と高橋チャンと t. 張さんにトロントの大学奨学金。

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
ドキソルビシン Polymed Theraeutics111023抗がん剤
Mitomycin CPolymed Theraeutics060814抗がん剤
ドキソルビシノール (DOXol)Toronto Research ChemicalsD558020DOX
4-メチルウンベリフェロンナトリウム塩の代謝物 Sigma-AldrichM1508内部標準
ミリスチン酸Sigma-Aldrich544-63-8  ポリリピッドハイブリッドナノ粒子用材料
ポリオキシエチレン (100) ステアリン酸スペクトラムM1402ポリ脂質ハイブリッドナノ粒子用材料
ポリオキシエチレン (40) ステアリン酸Sigma-AldrichP3440ポリ脂質ハイブリッドナノ粒子用材料
プルロニックF68 (PF68)BASF Corp.9003-11-6ポリ脂質ハイブリッドナノ粒子の材料
処理(UP100H)ヒールシャー、超音波技術NAナノ粒子調製
ウォーターバス(ISOTEMP 3016HS)フィッシャーサイエンティフィックNAナノ粒子調製
リポソームドキソルビシン (カエリックス)ヤンセンプリンセス・マーガレット病院の薬局から購入臨床的に承認されたナノ粒子製剤 
HPLC等級メタノールCaledon Chemicals6701-7-40HPLC移動相組成
HPLC等級H2OCaledon Chemicals8801-7-40HPLC移動相組成
HPLC等級アセトニトリル Caledon Chemicals1401-7-40HPLC 移動相組成
トリフルオロ酢酸Sigma-Aldrich302031HPLC 移動相組成
0.45 μm ナイロン膜フィルターペーパーWhatmanWHA7404004HPLC 移動相調製
1cc プラスチックシリンジベクトン、ディキンソン アンド カンパニー2606-309659治療注射
5cc プラスチック シリンジベクトン、ディキンソン アンド カンパニー2608-309646ティッシュ コレクション
30G 1/2 ニードルベクトン、ディキンソン アンド カンパニー305106 治療注射
25G 5/8針クトン、ディキンソンアンドカンパニー305122ティッシュコレクション
滅菌0.9%生理食塩水トロント大学ハウスブランド1011組織灌流
13ミリリットル丸底円錐管 SARSTEDT62.515.006プロリプロレン、組織均質化
Alpha Minimum Essential Medium (MEM) Gibco12571063Cell medium
1 x Phosphate Buffer 生理食塩水Gibco10010023組織の均質化
Triton X-100Sigma-AldrichX100-100 ML組織の均質化
ギ酸Caledon Chemicals1/5/3840抽出溶媒のpHを調整する
ヘパリンナトリウム噴霧プラスチックチューブBecton, Dickinson and Company367878採血
分析用計量天秤 ザルトリウス CPA225DNA
pHメーター フィッシャーサイエンティフィック13-637-671アキュメット BASIC
ボルテックス ミクスターフィッシャーサイエンティフィック02-215-365目的の速度でサンプルをボルテックス
1.5 ml マイクロ遠心分離機チューブフィッシャーブランド2043-05408129プロリプロレン
モデル1000ホモジナイザーフィッシャーサイエンティフィック08-451-672組織均質化
遠心分離機 5702Rエッペンドルフ5702R抽出準備
加熱蒸発器システムグラスコールNAサンプル再構成
HPLC スクリュースレッドバイアルDIKMA5320HPLCサンプル注入
PTFEホワイトシリコンセプタム付きHPLCスクリューキャップDIKMA5325HPLCサンプル注入
HPLCポリプロピレンインサート  Agilent Technologies5182-0549最大容量 250 μl, HPLCサンプル注入
Xbridge C18 ColumnWaters Corporation186003117Drug analysis
Gradient pump ウォーターズ・コーポレーションW600薬物分析
オートサンプラーウォーターズ・コーポレーションW2707薬物分析
用フォトダイオードアレイ検出器 ウォーターズコーポレーションW2998Drug analysis
Multi & lambda; fluoresence detector ウォーターズコーポレーションW2475薬物分析
EMPOWER 2ウォーターズコーポレーションNAデータ解析ソフトウェア
ScientistMicromathNA薬物動態解析
メス Balb/c マウスジャクソン研究所001026In vivo
EMT6/WT 乳がん細胞イアン・タノック博士提供;オンタリオがん研究所NAIn vivo
超音波ベ

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Holohan, C., Van Schaeybroeck, S., Longley, D. B., Johnston, P. G. Cancer Drug Resistance: An Evolving Paradigm. Nat. Rev. Cancer. 13 (10), 714-726 (2013).
  2. Szakacs, G., Paterson, J. K., Ludwig, J. A., Booth-Genthe, C., Gottesman, M. M. Targeting Multidrug Resistance in Cancer. Nat Rev Drug Discov. ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Doxorubicin Mitomycin CHPLC QuantitationDrug Combination AnalysisNanoparticle Drug DeliveryReverse Phase HPLCBiological Matrix ExtractionInternal Standard MethodSimultaneous Drug DetectionPharmacokinetics StudyTumor Tissue Analysis

Related Articles