方法論記事

体外血液脳関門ブタ脳血管内皮細胞に基づくモデルの確立のための改良法

DOI：

10.3791/56277

⸱

2017年9月24日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Lundbeck Foundation Research Initiative on Brain Barriers and Drug Delivery, Department of Biomedicine, Aarhus University, 2Institute of Pharmaceutical Science, King's College London, 3HICoE Centre for Drug Research, Universiti Sains Malaysia

この記事について

サマリー

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プロトコルの目的は、プライマリ ブタ脳血管内皮細胞 (pBECs) に基づく体外血液脳関門 (BBB) モデルの確立のための最適化手順を提示することです。モデルを示しています高再現性、高気密性、輸送および創薬における細胞内輸送の研究に適しています。

要約

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このプロトコルの目的提示浄化と pBECs のと体外血液脳関門 (BBB) モデル モノカルチャー (MC)、アストロ サイト調整培 (ACM) と MC で pBECs に基づく栽培に最適化されたプロシージャと非接触ブタのアストロ サイトとの共培養 (NCC) またはラットの起源。pBECs は隔離され、国内豚 5-6 ヶ月歳の脳皮質から毛細血管のフラグメントから培養されました。これらのフラグメントは、髄膜、分離および灰白質、ろ過、酵素消化、遠心分離の均質化を慎重に除去して精製しました。汚染細胞をさらになくすためには、キャピラリーの断片がピューロマイシン含有培養した培地。60 ~ 95% 合流 pBECs キャピラリーのフラグメントから成長したに継代し、透過性の膜フィルターが挿入され、モデルに設立されました。次の差別化要因と扱われた細胞バリア堅さと BBB pBECs の特徴的な表現型を増加する: 膜側の透過物 8-CPT-キャンプ (ここで省略のキャンプ)、ヒドロコルチゾン、ホスホジエステラーゼ阻害薬、RO-20-1724(RO)。手順は、9-11 日の期間にわたって実施された、アストロ サイトが 2-8 週間前もってを培養した NCC モデルを確立するとき。プロトコルに記載されている手順の遵守が厳しく制限されている傍細胞透過性の内皮層の確立を許可している、NCC (TEER) 1249 ± 80 Ω cmの平均内皮下電気抵抗を示すモデル2と傍細胞透過性 (Pアプリ) ルシファー 0.90 10-6 ± 0.13 10-6 cm 秒-1の黄色の (± SEM を意味する n = 55)。この pBEC 表現型のさらなる評価のタイトな接合部蛋白質クローディン 5、良い表現を示した ZO 1、オクルディンと単接合蛋白 p120 カテニン。健康および病気の BBB の研究の範囲の提示されたモデルを使用ことができますそして、厳しい傍細胞透過性このモデル輸送と細胞内輸送の研究に適しています。

概要

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血液-脳関門の細胞の構造と機能

循環、中央神経系 (CNS) のインターフェイスで BBB は適切な機能と神経系の保護のために不可欠である中枢神経系微小環境の homoeostatic コントロールのキー規制サイトとして機能します。BBB のサイトは血管内腔内皮細胞です。脳の毛細血管の内皮細胞を形成する複雑な細胞間のタイトな接合と特定の流入と流出のトランスポーターの強く偏光式パターン血液と脳1の間非常に特定の分子輸送の確保します。タイト結合錯体の構造コンポーネント オクルディンとクローディン家族、精巣毛細血管(ZO) 蛋白質、cingulin からの蛋白質を含めるし、接合部接着分子 (ジャム) を関連付けられています。クローディン 5 は傍細胞接合部制限で特に重要です。この特徴的な BBB 内皮細胞表現型の誘導そして維持を一緒に脳血管内皮細胞フォームは基底膜ニューロンとアストロ サイト ペリサイト周囲の細胞とのダイナミックな相互作用を含む、神経血管ユニット (NVU)2,3。これらの相互作用に関与するメカニズムがまだ完全に理解されない、しかし、短期的に BBB 透過性の調節ができ、長期 BBB 機能4を誘導する細胞間化学信号の交換が含まれます。アストロ サイトは特に脳血管内皮細胞の表現型に貢献する知られているし、グリア由来神経栄養因子 (細胞内 cAMP に影響を与える)5、塩基性繊維芽細胞成長因子6、規制などのソースは、ヒドロコルチゾン7、および変換増殖因子 β (TGF-β)8。しかし、TGF-β の効果は議論9をされています。

生体内での in Vitro BBB から

BBB 生物学に関する貴重な情報を提供するin vivo研究継続します。ただし、細胞モデルは追加の洞察力を提供し、健康および病気の BBB の詳細な分子と機能的な側面を理解するための便利なツールを構成できます。BBB の成分と細胞のタイプ間の複雑な相互作用が生体外モデルを完全に達成することは困難、以来があった、脳血管内皮細胞の最初の精製とモノラル文化にこれらのアプリケーション10,11,12、浄化手順と BBB の成長条件の広範な開発培養細胞モデル、体内バリアに大きい類似に 。一般的に使用される生体外でBBB モデルは、齧歯動物、ブタ、ウシ由来の初代培養細胞および不死化細胞株に基づいています。各モデルには、さまざまな長所と欠点があります。比較とモデルの選択、BBB 構造タンパク質受容体、酵素、トランスポーターの発現など検証マーカーが現在確立されたモデル1の概要を作成する使用されます。

プロトコルの目的

BBB の 1 つの重要な特徴は気密バリア性と高い TEER まだ利用可能なモデルの数が多いが反映しても体内のレベルです。いくつかの研究所から開発・最適化への取り組みを取り入れ、このプロトコルの目的は、プライマリ プライマリ pBECs MC ACM の有無、NCC に基づく BBB モデル体外高 TEER を確立する方法を提示するにはラットや豚由来のアストロ サイトは。応用手順およびモデルの確立汚染細胞を排除し、pBECs の BBB の表現型への分化を改善する努力があります。この作品は低傍細胞透過性とタイトな接合部の主要なタンパク質、トランスポーター、および受容体の機能発現を良いと信頼性の高い、高 TEER モデルの確立になりました。ただし、アストロ サイトは脳血管内皮細胞の表現型に貢献の要因、文化の 3 つの異なる条件は脳血管内皮細胞の 3 つの異なった表現型を表します。NCC モデルは創、運輸研究と細胞内輸送に関与する特定の専門にされたメカニズムの研究だけでなく、細胞間相互作用の調査のため特に有益で BBB 機能の最大の表現が、有利であります。

プロトコルの起源と歴史

ここで説明した pBEC モデルは、ルイーズ ・ モーガン博士と同僚は、成功以前ウシ脳血管内皮細胞モデル13に基づく方法でエーザイ研究所 (ロンドン) で開発された豚のモデルに基づいています。セル準備の元のメソッドは、純度を改善するために二次培養の手順に続いて、微小血管をキャッチするメッシュのナイロンを使用して 2 段ろ過が。メソッドの以前の開発、最適な BBB の表現型とバリアの堅さは ACM を含む補足の媒体の成長によって達成されました。メソッドにさらに変更は、マンチェスター英国14,15教授 (名) rothwell さんのラボで r. スキナーによって作られました。メソッドは、アボットの研究室、KCL ロンドン、どこ Patabendige では、大幅に簡単にアストロ サイトまたは ACM の使用の回避によって、ピューロマイシンをペリサイトなど汚染細胞を排除する準備をした。 によって採用されました。初論文 MC モデルに、生体内でBBB、効果的なタイトな接合、膜輸送系受容体を介したトランスサイトーシス16,17などのいくつかの重要な機能が保持されることを確認しました。,18,19,20. S. ユソフ後再び培養アストロ サイトをテストし、これはアボット ラボ21で現在使用されている最寄りのバリアント、TEER、大幅それを発見します。モデルが正常にされている今簡素化灰色を含む問題抽出、1 つだけメッシュろ過ステップ、および単一のフィルター コーティングの手順を使用して、m. ニールセンに転送ラボ オーフス、さらに変更がされているの導入 (そのプロトコルに関して)コラーゲンとフィブロネクチンを組み合わせること。豚アストロ サイト (このプロトコル) の分離の適用手順は、・ トムセンら22で説明したオールボーで t. Moos 研究室で開発したプロトコルに基づいていた。TEER とロンドンとオーフスで生成されたモデルの他のプロパティは、モデル ラボ間で転送が容易に、注意深い観察と方法の手順の合理化によく反応するという考えに信任を貸す、似ています。確かに、s. ユソフはローカル条件およびティッシュ ソースにさらに調整を関与している熱帯の国 (マレーシア)23に、今 MC モデルを確立しています。

別の方法や現在の利点は、モデルを確立

PBECs ウシおよび齧歯動物の起源の脳血管内皮細胞に比べると、次の分離24生体内でBBB の表現の損失の低い率を持っていることの利点を提供します。さらに、pBECs、bEND.5 と bEND.3 (50 Ω cm2) など細胞の単分子膜のよく報告されるレベルと比べて MC (800 Ω cm2)16で育てられたときも比較的タイトな内皮障壁を形成できます。25,26,原発性脳腫瘍と cerebEND (500 Ω cm2)29,31,32cEND (300-800 Ω cm2)28,29,30, 27(100-300 Ω cm2) マウスの血管内皮細胞ss ="xref"> 33,34,35,36とラット (100-300 Ω cm2)37,38。しかし、TEER は浄化と文化のプロシージャの依存関係を示しています。ほとんどの場合、ACM の追加やアストロ サイトとの共培養内皮層1の気密性の内皮細胞で増加差別化効果に示します。それにもかかわらず、培養条件を最適化する努力、牛ベースのモデルのみを示している TEER 値豚ベース モデル (800 Ω cm2 MC、最大 2500 Ω cm2の培養アストロ サイトの平均) に匹敵する13 ,,3940,41,42,43,44,45。ウシ脳に基づくモデルとして内皮細胞は大きな変動、研究所14,45,46,47,48, 内と間を示しています。再現性は問題になる可能性があります。ここで報告 pBEC モデルで貢献の研究所は変動の少ない、両方の研究所の間で非常によく似た TEER と傍細胞透過性の値を達成しています。したがって、それはここで紹介した方法を使用して低い変動と堅牢なモデルを確立する他の研究所の可能なはず。タイトな内皮細胞層を形成するに加え pBECs を持つモデルがタイト結合蛋白質、機能 BBB トランスポーター、受容体、酵素、及び実証適性研究15の範囲の表現によって検証されて以前,16,17,19,20,22,49,50,51,52,53,54,55,56,57,58,59。 さらに、pBECs の共培養に未発表のトランスクリプトーム データは BBB トランスポーターと受容体 (未発表結果、ニールセンら) の予想されるプロファイルを示しています。

豚の病気の進行を反映60、好ましい特徴の他の確立されたモデルよりも高い程度に人間の生物学とゲノム、解剖学、生理学、豚ベースの BBB モデルがそれ以上の利点、製薬業界。ブタ脳肉業界の共通の副産物であると血管内皮細胞、動物実験のために必要な 1 つのブタの脳から高純度精製収率を提供するの数を最小限に抑える脳の簡単にアクセスできるソースそれら構成します。浄化の一次電池の耕作はやや時間がかかるとモデルの設定の標準化のための専門知識が必要ですが、一次電池は最も信頼性の高い BBB モデルを生成します。不死化細胞株はバリアの堅さ、トランスポーター発現プロファイルと微小環境規制が生体内で実験結果61,を反映していないなど重要なプロパティとして、代用をすることはできません。62体外モデルは、生細胞の高解像度のイメージング、目標を使用してサンプリングまたは観察された細胞に近いアプローチを許可することで細胞内のプロセスの可視化を実現の利点を提供。高倍率と優れた光学的品質63。これは生きている動物の 2 光子顕微鏡の使用のためのケースではありません。さらに、体外モデルは、タグ付きタンパク質の可視化や、人身売買の調査を許可するセルを使って能力を提供します。

モデルの応用

BBB の機能は固定されていないと生理学と病理学の両方で動的に変調することができます。神経変性を含む多くの神経学的な病気で炎症・感染症、混乱、BBB の透過性亢進には、64,65,66,67 が観察されます。.減らし、病気の進行や後の損傷を防ぐために、BBB の変調の基礎となる分子メカニズムの同定と解析、主要な重要です。このコンテキストで信頼性の高い体外モデルは、製薬業界での高い需要と、さらに中枢神経系薬の BBB 透過性を予測する上で重要な役割を果たします。透過スクリーンとして任意の生体外モデル制限傍細胞経路、生理学的に現実的な細胞アーキテクチャおよび機能発現トランスポーター メカニズム68が表示されます。以前研究16,17,57, と傍細胞透過性とここで TJ と AJ タンパク質の発現を示した本モデルこれらのすべての条件を満たして、BBB の範囲に適しています両方の通常の生理学と病理学を研究。提示の浄化と栽培方法の強みには、シンプルさの組み合わせ、結果堅牢で信頼性の高い高 TEER体外BBB モデルで再現性とアストロ サイトを含める機能に影響を与えるがあります。この目的は、ブタのアストロ サイトとラットの起源が同様の方法22pBECs の BBB の表現型を拡張するために示されています。

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プロトコル

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ブタ脳がデンマークの食品産業の副産物として得られました。デンマーク食肉処理場が厳しい監督とデンマーク環境省および食品による観測

。

ラット アストロ サイトの分離に使用で飼育されグループはデンマーク語によると獣医の検査の下で 12/12 h ダーク/ライト サイクル、22-23 ° C の周囲温度でローカル動物施設で建物実験動物のための規則。ラットは、彼らが動物 (1986 年 11 月 24 日の欧州社会理事会指令; 86/609/EEC) の倫理的な使用に関する国際ガイドラインおよびデンマークのガイドラインに従って犠牲になった前に安楽死されました。これらの実験で動物やひと由来の材料の 生体内で 実験が使われていません

。

注: 次は pBEC の主なプロトコル (手順 1) 浄化、(ステップ 2) 栽培と TEER (ステップ 3) の測定を記述します。アストロ サイトと NCC のセットアップ、浄化およびラットとブタのアストロ サイトの栽培を説明する代替プロトコル (手順 4) を発表します

。

1 です。 豚脳毛細血管の浄化

  1. 国内豚を (例えば 近くに食肉処理場から) で 5-6 ヶ月齢から 8-10 脳を収集し研究室に氷の上にそれらを輸送。動物の終了の 2-3 時間以内次浄化手順を開始お勧めします
    2. 。
  2. 滅菌の流れベンチで脳を置き氷にビーカーで 1 L の PBS で優しく洗って
  3. は慎重に微細先端の鉗子を使用して、一度に 1 つの脳から髄膜を削除し、氷上に置いた PBS で髄膜無料脳を別の 1 L ビーカーに転送します。撮影時間を延長は除去を複雑にすることができます。それぞれの脳に使用されるおおよその時間は 10-15 分をする必要があります
  4. メスを使用して、一度に 1 つの脳の灰白質をこすり落とすし、シャーレ (8.8 cm 2) 20 mL DMEM 栄養混合物 F-12 (DMEM/F-12) 氷の上に配置を含む分離材料を転送します。白質材料を撤退せずできるだけ多く灰として分離します。初期の断片化、針なし注射器 50 mL を灰白質材料を実行します。すべての脳の継続し、収集した灰白質材料をプールします。撮影時間を延長は除去を複雑にすることができます。それぞれの脳に使用されるおおよその時間は 10-15 分をする必要があります
  5. は、DMEM/F-12 メディアで 50/50 の比率で手持ち組織ホモジナイザーのグラインダー管に灰白質の分離材料を転送します。タイトな杵でストローク上下 8 に続いて、緩やかな杵を上下にストローク 8 することによって材料を均質化します。材料が均質化されてすべての分離まで続く、500 mL ボトルにホモジュネートを転送、DMEM/F-12 容量約 450 mL に希釈します
    6. 。
  6. 磨砕液 500 ml ブルー キャップ フィルター ホルダーと 140 μ m フィルター メッシュを使用してフィルターを適用し、フィルターを通して組織を実行することによって毛細血管を分離します。磨砕液 50 mL 当たり 1 つのフィルターを使うし、その後 DMEM/F-12 各フィルターを洗うです
    7. 。
  7. 毛細血管を含む場所フィルター トリプシン/EDTA (2.5% トリプシン、PBS で 0.1 nM EDTA)、消化溶液でペトリ皿のコラゲナーゼ CLS2 (2,000 U/mL) および DMEM/F - 12 DNase 1 (3,400 U/mL)。3 フィルター メッシュあたり 1 ペトリ皿 (8.8 cm 2、20 mL の溶液) を使用します
    8. 。
  8. は 180 rpm で軌道シェーカーで 1 h の 37 ° C でペトリ皿を置くか、優しく 10 分毎にそれらを攪拌します。1 時間後懸濁液 1 mL ピペットを使用してシャーレから、フィルターから毛細血管を洗い落とす
    9. 。
  9. 2 の 50 mL チューブに 3 つの料理から懸濁液を分割し、各 50 mL チューブに 10 mL DMEM/F-12 を追加することによって、消化を停止します
    10. 。
  10. 250 × g、 4 ° C で 5 分間、細胞懸濁液遠心培養上清を吸引し、再 DMEM/F-12 の 10 mL にペレットを中断します。各チューブに DMEM/f12 キーのさらに 20 mL を追加します。遠心分離機を 2 回繰り返します
    11. 。
  11. チューブ 5 分間氷の上を冷やすと 2 新しい 50 mL チューブにソリューションを転送します
    12. 。
  12. 5 分の 250 x g、 4 ° C で細胞懸濁液を遠心分離機し、FBS で 10 %dmso から成る凍結液の 8-10 mL (約 1 mL/脳を使用) にペレットを再中断します
    13. 。
  13. は、細胞懸濁液をクリオバイアル、クリオバイアルあたり 1 ml に転送します。平均では、1 バイアルあたり平均 12-16 挿入の内皮細胞を提供して使用すると、脳の浄化の結果します。少なくとも 4 まで一晩 h-80 ° C で凍結ボックスにバイアルを配置します。その後、液体窒素で質に、クリオバイアルを格納します
    。 注意: 液体窒素は非常に低温です。ください適切な保護具を着用します
    14. 。

2。主な pBECs (8-10 日) の栽培

  1. 初期文化 (3-5 日)
    日 1
      pBECs の付属品のための条件を最適化するために
    1. は最終的にソリューションを追加することによって T75 フラスコのコーティングを実行コラーゲン IV の濃度 (150 μ g/mL), フィブロネクチン (50 μ g/mL) ddH 2 O をフラスコに加えて、ソリューション全体の表面をカバーするかどうかを確かめます。各 T75 フラスコに 10 mL を使用します。2 のための 37 ° C で
      注: コーティングは使用前に、または 1 週間前に、まで実行して格納できます PBS の 4 ° C でコーティングが、乾燥しなければならないまたはそれがもはや適切な添付ファイルと成長表面を形成します
      2. 。 DMEM/F-12 から成る
    2. pBEC 成長の準備 16 mL 中 10% 血漿由来血清 (PDS)、(100 U/mL) ペニシリン、ストレプトマイシン (100 μ g/mL)、ヘパリン (15 U/mL) と補われます。ピューロマイシン (4 μ g/mL) 内皮細胞に選択する媒体を補足します。ピューロマイシン治療は最大 5 日間のみ使用できますに注意してください
      3. 。
    3. 2 15 mL チューブに 6 mL と 10 mL のボリュームに準備された媒体の約数
      4. 。
    4. は、液体窒素 (ステップ 1.13) から毛細血管にバイアルを持参し、37 ° C の水浴の使用によってまたは 6 mL 因数から準備された媒体の 750 μ L を追加することによって、毛細血管を解凍します。融解培地を追加することにより、ピペット慎重に上下に解凍し、懸濁液を均質化します。解凍、細胞懸濁液 6 mL の培地の分注に転送します
      5. 。
    5. 250 x で g、4 ° C で 7 分間を毛細血管をスピン凍結媒体を削除するには
    6. は慎重に、上清を吸引し、10 mL の約数の 1-2 の mL にペレットを再中断します。ときに 10 mL の培地の分注にソリューションを転送再中断します
      7. 。
    7. は、コート T75 フラスコに毛細血管の懸濁液を転送し、優しく表面上の平等な分配を確保するフラスコを傾けます。37 ° c、5% CO 2 T75 フラスコを配置します
      。 2 日目
    8. 一晩インキュベートした後 1 つの T75 フラスコ ピューロマイシン (4 μ g/mL) 10 mL pBEC 成長培を準備し、中型の変更を実行します。セルに適用されるすべてのメディア ソリューションがあらかじめ使用前に 37 ° C に加温する必要がありますに注意してください
      。 注: また、中型の変更することができます実行 4 〜 6 時間後めっき表面に毛細血管を添付すべき場合。60 ~ 95% の合流点は、融解から通常 3-5 日を達成するまでは、セルを孵化させなさい。同種ではないのかさらに細胞増殖の接触阻害を停止することができますを避けるために 100% の合流点に到達する w セル
      。 4-6 日目
    9. 必要な密度を達成したときの血管内皮細胞透過性の膜挿入 (2.2 節参照) に通路します。4 日目目的密度が得られない場合は、媒体の変更が行われます。6 日の遅くとも透過膜挿入に細胞を継代する必要があります。6 日目で必要な密度が得られない場合セルの実験的使用に適した場合します
      。 注: NCC のアストロ サイトの準備: 共培養モデルの 8 週齢アストロ サイト文化 (セクション 4 を参照) を挿入する血管内皮細胞を通過する前に日に中型の変更を実行することによって準備必要があります 2 - 共培養モデルを設定するとき。各アストロ、アストロ培 1500 μ L を準備のため DMEM から成る低グルコース 10 %fbs、(100 U/mL) ペニシリンとストレプトマイシン (100 μ g/mL) を添加した、中型の変更を実行します
      10. 。
  2. 透過性膜を挿入します (5 日) の pBECs の成長
    4 6 日目
    1. 準備透過膜挿入 (1.12 cm 2 の表面積、0.4 μ m の孔の挿入と 12 ウェル プレート)コラーゲン IV コーティングによる pBEC のシード (500 μ g/mL), フィブロネクチン (100 μ g/mL) ddH 2 O. 使用約 300 μ L ごとの挿入、およびソリューションは、全体の成長の表面をカバーするかどうかを確認します。37 ° C、2 h の最低 5% CO 2 で
    2. 30 ml pBEC 成長媒体の (メディア構成セクション 2.1.2 参照) ピューロマイシンなし
      3. 。
    3. T75 フラスコ pBEC 文化から中・常温 5 mL 滅菌 PBS で 2 回洗って軽く吸引します
      4. 。
    4. 2 mL のトリプシン-EDTA 溶液 (2.5% トリプシン、PBS で 0.1 nM EDTA)、T75 を追加することによって細胞を trypsinize し、37 ° c、5-7 分の 5% CO 2 フラスコ
      5. 脳血管内皮細胞をデタッチする
    5. は優しく T75 フラスコ フラスコの表面に存続しより強力なアタッチ ペリサイトを残して最終的に指先の側面をタップします。顕微鏡下で剥離を視覚的に調査します。80% の剥離が観察される、trypsinization 培地 5 mL を追加することによって停止します
      6. 。
    6. 250 × g、7 分の 4 ° C での遠心分離によって脳血管内皮細胞を 10 mL のピペットとスピンを使用して 15 mL チューブに細胞液を転送します
      7. 。
    7. は慎重に上澄みを除去し、培地 1 mL にペレットを再懸濁します。中断されると、追加のさらに 2 mL を 3 mL 総容積をもたらす媒体の
    8. カウントの商工会議所または計数システム自動セル セルの使用によって手動でセルの数をカウントします。2.2 10 5 セル/挿入 × 1.1 の最終的な播種密度の結果、10 の 5 セル/mL 中 x の携帯ソリューションを準備します
      9. 。
    9. は、コーティング ソリューションを透過性の膜挿入から削除し、細胞懸濁液 500 μ L を各挿入に転送します。挿入のいずれかで、唯一の媒体を追加し、この挿入を使用、' のみをフィルター ' TEER 測定コントロール
      10. 。
    10. 確立内皮細胞 MC、MC と ACM、または NCC にアストロ サイトと次のように:
      1. の MC: pBEC 成長媒体/ACM 透過膜挿入下 12 ウェル プレートのウェルあたりの追加 1500 μ L。37 ° C、5% CO 2 に透過性の膜挿入を置き、2 日間インキュベートします
        2. 。
      2. の NCC: 前日アストロ アストロ培地でリフレッシュと井戸に挿入を転送します。37 ° C、5% CO 2 に透過性の膜挿入を置き、2 日間インキュベートします
        。 注: する 3 つのモデルの下の井戸でさまざまなメディア タイプの使用に注意してください
        。 日 6-8
    11. 2 日目、pBECs と透過性の膜挿入上のメディアを変更します。PBEC 成長媒体の挿入、1 回あたりの 500 μ L を準備し、慎重に細胞層の破壊を最小限に抑える変更を実行します。2 日間のセルを孵化させなさい。挿入のみ、上と下の井戸ではなく、メディアの変更が実行されることに注意してください
      12. 。
  3. 分化因子 (1-2 日) 刺激
    日 8-10
    1. の異なるモデルごとに、刺激メディアが次のように準備されるべき:
      1. の MC: ごと挿入し、まあ、キャンプ (250 μ M)、ヒドロコルチゾンを含んでいる pBEC 成長媒体の 500 μ L を準備 (550 nM) と RO (17.5 μ M) です
        。 MC: 準備キャンプ (250 μ M)、ヒドロコルチゾンを含んでいる pBEC 成長媒体のさらに 1500 μ L (550 nM) と RO (17.5 μ M) です
        。 ACM と MC: ACM の 1500 μ L を解凍し、キャンプ (250 μ M)、ヒドロコルチゾンでそれを補う (550 nM) と RO (17.5 μ M) です
        2. 。
      2. の NCC: 各挿入準備キャンプ (250 μ M)、ヒドロコルチゾンを含んでいる pBEC 成長媒体の 500 μ L (550 nM) と RO (17.5 μ M)。各アストロ サイトよく、準備 DMEM/F-12 (100 U/mL) ペニシリンとストレプトマイシン (100 μ g/mL)、ヘパリン (15 U/mL)、キャンプと補われる (250 μ M)、ヒドロコルチゾンの 1500 μ L (550 nM) と RO (17.5 μ M) です
        3. 。
    2. の異なるモデルごとに、次のようにメディアの交換を実行:
      1. の MC: 慎重に吸引井戸挿入から中、500 μ L を挿入するたびに使用して、両方のコンパートメントに分化培地を追加し、各ウェルの 1500 μ L。挿入のいずれかの側に混乱が影響を与えるでき、細胞層を混乱に注意してください
        2. 。
      2. の NCC: 慎重に井戸から培地を吸引し、ウェルあたり 750 μ L 分化培地を追加。慎重に挿入から培地を吸引し、挿入 1 回あたり 500 μ L 分化培地を追加します。よくそれぞれのアストロ サイトに残り 750 μ L 分化培地を追加します
        3. 。
    3. すべてのモデル: 37 ° C、5% CO 2 にセルを配置し、次の日まで分化培地と孵化します
      。 注: するアストロ サイトと NCC、アストロ サイトがこのポイントから無血清培地で保管に注意してください
      4. 。

3。TEER 測定

  1. TEER 測定チャンバーの洗浄によって刺激的な細胞分化培地準備組織抵抗測定チャンバー システム後当日は、ddH 2 O、1 回 70% で 2 回 5 分エタノール2 回以上 ddH 2 O.
  2. 組織抵抗測定室に DMEM/F-12 の 4 つの mL を追加、システムに接続し、次の設定に従って約 30 分間のキャリブレーション: R = 0、テスト R = 1000、モード = r.
  3. は、注意深く組織抵抗測定室内のインサートを配置し TEER 測定を実行します。各挿入、3 通で測定を実行し、平均 Ω cm 2 を計算します
    。 注: 共培養モデルの TEER 値が到達する予想は > 500 Ω cm 2。TEER の測定の最初の日に適切な TEER レベルに達していない場合は、新しい差別化要因を追加 (キャンプ (250 μ M)、ヒドロコルチゾン (550 nM) と RO (17.5 μ M)) し、次の日にもう一度 TEER を測定します。適切なレベルを達成すると、モデルは計画された実験のため準備ができているはずです。セルが TEER 測定後に回復する実験を実行する前に少なくとも 3 時間休むべきであることに注意します。刺激後 TEER 値一般に許容残る 24-48 h の刺激後
    。 注: また剛体の STX-100 C 電極対を使用して代替と迅速法はこのモデル 81 高 TEER を記録します。柔軟な STX2 electrode のペアは、信頼性の低い測定値を与える
    4. 。

4。非接触培養準備のアストロ サイト: 代替法

  1. アストロ サイト浄化
    1. 各ラットの脳を使用するコート T75 フラスコ 2 のそれぞれに ddH 2 O のポリ-L-リジン (5 μ g/mL) 10 mL を追加することによってT75 フラスコ。37 ° C で 30 分間でフラスコを孵化させなさい
    2. アストロ サイトの分離は次のように実行できます:
      1. ラット アストロ サイト:
        1. 首を切る 2 1 - 承認されたメソッドを使用して 2 日間の古いラット
          2. 。
        2. 矢状切開で骨を切り、鼻に向かって、首から髑髏の皮をカットします
          3. 。
        3. カーブタイプ鉗子で頭蓋骨を開いて脳を取り出す、11 ml の 10 %fbs およびゲンタマイシン硫酸塩 (125 μ G/ml) 添加 DMEM 低血糖の 15 mL 管 (管 1) に配置します
          4. 。
        4. 慎重に微細先端の鉗子を使用して髄膜を削除し、1 mL ピペットを用いた脳材料を中断します
          5. 。
      2. 豚アストロ サイト:
        1. 5-6 ヶ月歳国内豚から取得 1 脳
          2. 。
        2. ファイン ・ チップ ピンセット、手を使用して脳から髄膜を慎重に削除します
          3. 。 灰色の
        3. 収集の 4 g は、脳から問題し、10 %fbs とゲンタマイシン硫酸 (125 μ G/ml) ペトリ皿で補われる 1-2 の mL DMEM 低血糖に作品を置きます。作品が大きい場合はメスや鉗子でミンチします
          4. 。
        4. 10 %fbs とゲンタマイシン硫酸 (125 μ G/ml) 11 mL の合計容積に添加 DMEM 低血糖で 15 mL 管 (管 1) と塗りつぶしに移動 1 mL ピペットを用いた分離材料を中断します
          5. 。
        5. は、10 mL の注射器に付いている長い針と分離材料を均質化を継続し、3 回上下を中断します。大きな作品は、管の底に定住しているまで待機し、管 (管 1) の上部から 7 mL の培地を収集します
          6. 。
        6. 新しい 50 mL 管 (2 管) に 40 μ m ナイロン フィルターを介して 7 mL 細胞懸濁液をフィルタ リングします
          7. 。 脳と 1 をチューブに
        7. 追加 7 mL 中。均質化と手順 4.1.2.2.5-6 からろ過管内 2 フィルター処理された細胞を懸濁液の量は 35 mL 約続行します
          8. 。
    3. コーティング ソリューション T75 フラスコ [ステップ 4.1.1] から削除します。5 ml の PBS ポリ L リジンと孵化を使用して、セル、コーティング液の毒性効果の影響を受けなかったことを確認することができます後クイック洗濯
      4. 。
    4. は分割で T75 フラスコの間で均等に分離アストロ サイト ソリューションをシードします。37 ° C、5% CO 2 3-5 日でフラスコをインキュベートします
      5. 。
  2. 培養アストロ サイトと内皮細胞 (3 週間) で準備する NCC
    1. 初期文化
      1. インキュベーションの 3-5 日後慎重に 10 mL を追加する培地を吸引して中型の変更を行う10 %fbs およびゲンタマイシン硫酸塩 (125 μ G/ml) 添加 DMEM 低血糖の
        。 注: 最初の中型の変更後媒体必要があります変更するごとに 5 日間。最初の 2 週間の間に、フラスコを振るし、徹底的に PBS のセルを洗浄して培地を変更するとき。汚染ミクログリアの除去に役立ちます
        2. 。
      2. 栽培、3 週間後に各 T75 フラスコの底にトリプシン-EDTA 溶液 2 mL を追加することによって細胞を trypsinize、37 ° C、5% CO 2 5-7 分のためにそれらをインキュベート
      3. 培地 5 mL を追加して trypsinization を停止、15 mL チューブに細胞液を転送および遠心分離機の 250 x g、 4 ° C で 7 分間でアストロ サイト
      4. 慎重に上澄みを除去し、再凍結政府短期証券で 10 %dmso から成る溶液中の細胞を中断します
        5. 。
      5. はセルの数をカウントし、4.0 x 10 6 セル/mL の携帯ソリューションを準備します。クリオバイアル バイアルあたり 1 mL の追加のセルをフリーズします
        6. 。
    2. 透水性膜挿入システム下部井戸 (2-12 週) の成長
      1. アストロ サイトの成長のため各ウェルに ddH 2 O のポリ-L-リジン (5 μ g/mL) の 1 mL を追加して 12 ウェルのプレートを準備します。2 のための 37 ° C でプレートを配置
      2. 各 12 ウェル プレートのアストロ培 (DMEM 低グルコース 10 %fbs と (100 U/mL) ペニシリン、ストレプトマイシン (100 μ g/mL) を添加した) 25 mL を準備します
        3. 。
      3. は、液体窒素からアストロ サイトのバイアルを持参し、750 μ l 添加 DMEM 低グルコース培地を追加することによって、細胞を解凍します。慎重にピペットの上下に解凍し、懸濁液を均質化します。解凍、15 mL チューブに細胞懸濁液を転送、7 mL の容量にメディアを追加します
        。 注意: 液体窒素は超低温、ので、手袋など個人用保護具を着用します
        4. 。
      4. 250 x で g、4 ° C で 7 分間を毛細血管をスピン凍結媒体を削除するには
      5. 慎重に上清を吸引し、培地で細胞を再停止します
        6. 。
      6. 12 ウェル プレートの井戸からコーティングを除去し、細胞懸濁液をウェルあたり 1 mL を使用して井戸に転送します。37 ° c、5% CO 2 細胞をインキュベートします
        7. 。
      7. 培地 3 日ごとの更新し、血管内皮細胞との共培養の細胞を使用する前に 2 週間以上の細胞の培養します。細胞培養に最適の年齢は 2-8 週間解凍後 12 週間まで使用できます
        8. 。

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結果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

BBB のIn Vitroモデルの確立

提示された、最適化された方法で pBECs の栽培やアストロ サイト (図 1) と MC 有無 ACM または NCC 透過膜挿入システムの確立実施した 9-11 日間 (図 2)。内皮細胞の選択、精製されたキャピラリー フラグメントの初期の文化は、ピューロマイシン最大 5 日間、ほとんど汚染細胞を排除しからの紡錘状の血管内皮細胞の成長を促進を併用した、キャピラリー フラグメント (図 3 aの C)。4 6 日目で pBECs は、接触抑制、縦一直線に並べられた細胞成長、非重複、60 ~ 95% の confluency に増殖しました。PBECs が IV コラーゲンとフィブロネクチン...

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ディスカッション

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精製と pBEC の増殖

浄化のプロシージャの間には、重要な手順は、髄膜の迅速かつ効果的な除去・分離精製収率、純度およびモデルの適切な設置が重要です白と灰色の物質に含まれます。提示された体外BBB モデルの pBECs を使用して、我々 は改善し、孤立した灰白質、サイズ選択的微小血管、コラゲナーゼで消化の隔離のためのフィルタ リングの機械的均質化に基づく浄化手順を簡単、DNase や微小片の初期の文化で、トリプシン。一般に、精製とプライマリ細胞培養中に主要な挑戦の 1 つは汚染細胞の除去です。原発性脳腫瘍血管内皮細胞の浄化と経験を示しました髄膜と白質の結果の徹底的な除去は血管内皮細胞の増殖と BBB の発現を増加だけでなく純度・収量、毛細血管を改善します。特性。このため、提案するプロトコルの髄膜 (溝の中を含む) の除去された髄膜細胞 (線維芽細胞のような性質のある) だけでなく、動脈と細動脈の平滑筋細胞の除去をように設計されています注意してください成長します。迅速に培養内皮細胞より。同様に、白質材料の最小化と純粋な内皮細胞培養、少なく汚染細胞分離のキャピラリー フラグ...

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開示事項

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

利害の衝突を報告しません。

謝辞

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

著者は、テクニカル サポート、エリザベート ヘレナ ブルーン、サラ クリスティン ・ クリステンセン、ニルス ・ m ・ クリステンセンを認識したいし、ルンドベック財団許可番号 R155 2013 14113。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
フィブロネクチンSigma-AldrichF1141
コラーゲンIVSigma-AldrichC5533
Poly-L-リジンSigma-AldrichP1524
DMEM/F-12ロンザBE12-719F
DMEM/低グルコースSigma-AldrichD6046
ペニシリン/ストレプトマイシンGibco Invitrogen15140
血漿由来血清(PDS)First Link UK Ltd.60-00-89
ウシ胎児血清 (FBS)Gibco Invitrogen10-270-106
Trypsin/EDTAGibco Invitrogen15090-046
ヘパリンSigma-AldrichH3393
ピューロマイシンSigma-AldrichP8833
ヒドロコルチゾンSigma-AldrichH4001
8-CPT-cAMPBiologC010
RO 20-1724Sigma-AldrichB8279
ゲンタマイシン硫酸塩Lonza17-518Z
DMSOSigma-Aldrich34896
PBSSigma-AldrichD8537
EtOHVWR20,824,29696 % EtOH
DNAse 1しますD4513
コラゲナーゼ CLS2Sigma-AldrichC6885
ddH2OElga System
製 T75 フラスコThermo Scientific156499
Costar Transwell インサート (細胞透過性メンブレンインサート)CostarCLS340112 ウェルプレート、直径 12 mm、0.4 μm ポリカーボネートメンブレン
15 ml 遠心チューブCellstar188271
50 ml 遠心チューブCellstar227261
ペトリ皿Thermo Scientific150350
クライオバイアルThermo Scientific377224
500 ml ボトルThermo Scientific159910/159920
メススワンモーテンREF0211タイプ24
組織ホモジナイザーシグマD9188
140 μm フィルターMERCKNY4H04700
40 μmフィルターコーニング431750
EndOhm チャンバーシステムワールド・プレシジョン・インスツルメンツENDOHM-1212mmカルチャーカップ用エンドオームチャンバー
EVOM2 電極システムワールド・プレシジョンズ 300523+STX100C硬質STX-100C電極ペア付きTEER測定システム
ロングニードルシグマシリンジに取り付ける
細い先端の湾曲した鉗子KLSマーティン12-409-12-07
広い先端の鉗子VWR82027-390
フィルターホルダーMERCKミリポアSwinnex-47
50 mlのシリンジブラウン4617509F
10 mlのシリンジテルモSSt20ESI
抗オクルージン抗体アブカムab317211:100
抗p120Catenin antibodyBD Transduction laboratories6101331:200
抗ZO-1抗体Invitrogen61-73001:200
抗クローディン5抗体Sigma-AldrichSAB45029811:100
ロバ抗ウサギIgGとAlexa Flour 568Thermo ScientificA100421:500
ロバ抗マウスIgGとAlexa Flour 488Thermo ScientificA212021:500
糖パーキンエルマーNEC100X250UC0.15µl / ml最終作業コンク
ルシファーイエローシグマL014410 & マイクロ;G/mL 最終作業 Conc
Sigma-Aldrich から 70 % 溶液を混合ショ

参考文献

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