破骨細胞形成乳房癌細胞と共培養末梢血単球からの人間の前臨床モデルの開発

サマリー

このプロトコルでは、生体外で人間前臨床モデルの末梢血単球培養がん細胞破骨細胞の相互作用を模倣する乳房癌細胞から破骨細胞形成の開発について説明します。モデルは、骨転移形成の理解を深めると治療オプションの改善される可能性があります。

要約

腫瘍細胞と骨の微小環境における骨細胞間クロストークは骨転移形成のメカニズムを理解することが重要です。体外完全ひと臨床のモデル乳癌細胞と破骨細胞への分化を受けている単球の培養を行った。私たちは健康なドナーから末梢血液のサンプルから破骨細胞形成のモデルを最適化されています。末梢血単核球 (PBMCs) が最初に密度勾配遠心法で区切られ、高密度で播種、2 つの成長因子 (GFs) を追加することによって区別するために誘導: 核因子 κ B ligand (RANKL) とマクロファージの受容体活性化コロニー刺激因子(MCSF)。セルが 14 日間文化のまま固定し、下流の分析を行った。骨骨転移における骨にがん細胞の到着の効果の 1 つは破骨細胞形成の誘導です。我々 はこのように私たち GFs に対するがん細胞の分化のパワーを研究する乳癌細胞の共培養モデルを挑戦しました。がん細胞破骨細胞の相互作用を学ぶ簡単な方法は、乳房癌細胞培養から収集し、新鮮な媒体と混合馴化培地の使用に基づく間接共培養を行うことです。この混合物は、破骨細胞分化を誘導するために使用されます。我々 はまた直接培養がん細胞と単球の分化を受けて媒体を共有し、分泌された要因を交換する方法を最適化されています。これは、大幅に改善オリジナル間接共培養法で研究者は 2 つの細胞のタイプの相互作用を観察でき、がん細胞と破骨細胞の両方に対する下流を分析します。この方法により、骨転移微小環境と乳がん由来以外の種細胞への薬の効果を研究します。モデルは、骨粗しょう症や他の骨の条件など他の病気を研究するも使用できます。

概要

骨は、病^1,2,3の過程で骨転移を来した症例の 20-25% に前立腺、肺、乳癌などの癌の種類によって転移の一般的なサイトです。特に、乳がん患者の 70% は死⁴で骨転移の証拠を運ぶ。腫瘍と間質細胞癌の二次病変の相互作用は癌の進行に不可欠な。骨の微小乳がんから骨骨転移は、がん細胞、骨細胞、骨微小環境と発生病理学的悪循環の確立によって異なります。癌細胞は骨吸収^5,6、7の増加、骨のバランスを混乱させます。

新しいマトリックスを入金で、骨芽細胞が新しい骨形成⁸担当に対し、正常および病的条件では、破骨細胞、骨吸収を担当のセルです。破骨細胞融合、成熟破骨細胞への分化に必要なプロセスを誘導するランク破骨細胞表面の受容体に結合する RANKL の発現を介して骨芽細胞による破骨細胞の活動が規制されています。破骨細胞形成の誘導には、骨吸収が増加します。多数の生体内で調査は大きく骨転移形成^9,10,11の私達の理解を改善しています。乳癌細胞腫瘍と骨の微小環境では、破骨細胞形成を促進する破骨細胞機能を混乱させるし、骨吸収⁸。このシナリオではすべて分子間の相互作用が発生する癌細胞と破骨細胞が極めて重要です。すでに述べたように、骨転移のメカニズムは、 vivoマウス モデルに解明されてきた。ただし、すべて生体内で倫理委員会の動物実験の承認のための必要性に加えて、高いコストと時間のかかる方法を含む生体内で実験を実行するその他のいくつかの欠点があります。何人かの著者は、RAW246.7^9,10,11と呼ばれる前破骨細胞をマウスの線を使用して破骨細胞形成の生体内および生体外での前臨床モデルを組み合わせています。このモデルの欠点はセル前破骨細胞になることにコミットしているすでに、人間の起源ではないという事実に起因します。これらの理由から、トランスレーショナルリサーチ大幅体外骨癌細胞の相互作用を研究する完全ひと臨床モデルの可用性から寄与できます。

破骨細胞形成の in vitroひと末梢血サンプル^12,13から始まってのメソッドを最適化されています。破骨細胞は単球は、末梢血サンプルの小さい程度に存在、してから派生します。単核球、最初で仕切られて赤血球と顆粒球全血中に存在 Ficoll 密度勾配;リンパ球とは異なり、プラスチック基板に付着する彼らの能力のおかげで彼らが選択されます。播種後 14 日間の細胞を培養しています。MCSF と RANKL は、GFs の単球がマクロファージと破骨細胞^14,15に最初に区別するために必要です。RANKL は破骨細胞形成の後期段階の分化過程を誘導するために使用されるに対し、アッセイの全体の持続期間のため MCSF が必要です。分化の初期の段階で MCSF 単球増殖し、^14,15を生き残ることができます。破骨細胞形成の 2 番目の部分の中に細胞が融合して破骨細胞、リングで F アクチンの分布特性を示し、酒石酸耐性酸フォスファターゼ (TRAP) やカルシトニン受容体などの特定のマーカーの表現として成熟(CTR)^14,15. 本論文では 7 に 14 日から実験と MCSF と RANKL の組み合わせの最初の 7 日間の単球文化に MCSF を追加します。実験の終わりには、破骨細胞形成は下記のとおり、分化した細胞をカウントすることによって分析されます。

Gfs の区別するために誘発 monocyte 文化は、私たちの前臨床モデルの基礎を形成します。私たちは乳癌細胞の osteoclastogenic の力を理解する GFs なし共培養システムを最適化されています。メディアを追加することによって間接共培養モデルを開発した (80% α-最小必須培地 (α-MEM) エアコン 20% 中小収集乳癌細胞の文化から、セルを約 90% 合流分化^{12 を受けていた}.馴化培地 (血清欠乏条件下では収集されません) は 24 時間後に収集され、新鮮な培地で 1:4 の割合で混合します。馴化培地には、負の制御に関して重要な破骨細胞の分化が誘導されます。しかし、な間接共培養を使用する場合、がん細胞と骨細胞間相互作用の情報が失われない、直接共培養を行うことで我々 のシステムを改善しました。0.4 μ M を挿入し、単核球がメッキされた井戸に配置しての癌細胞の種をまいた。このメソッドを使用すると、セルは同じ媒体を共有しから分泌されるタンパク質を交換します。こうしてがん細胞¹³による破骨細胞形成の完全に人間の臨床モデルを作りました。

このシステムは非常に汎用性と異なる研究目的、例えば、骨転移の薬の役割を調査し、薬理学的研究でに使用できます。私たちのモデルでは、有効性と骨標的療法および/またはがん細胞¹³の存在下で骨の微小環境における抗腫瘍薬の作用のメカニズムを研究することが可能になります。正しいコントロールを持つ実験の設計、すなわち、癌細胞と破骨細胞培養、個別にやすく薬剤活性の共培養の影響を理解します。この方法は、研究されている薬剤ターゲット癌細胞及び破骨細胞、例えば、エベロリムス両¹⁶時さらに興味深いものになります。このモデルは、がん細胞と骨細胞間の相互作用の新しい経路を識別するためにも使用できます。

プロトコル

ヒト破骨細胞は、研究に参加する書面による同意を得た健康なドナーの PBMCs から区別されました。1964 のヘルシンキ宣言に敷設された倫理基準に従ってローカル倫理委員会で承認された研究プロトコル

。

1。 破骨細胞分化

注: EDTA で健康的な人間のドナーから末梢血やバフィー コートを収集します。末梢血 20 mL 未満の場合は使用しないでください。彼らは豊富な単核細胞を持っているので、バフィー コートが適しています。滅菌のティッシュ文化フードのすべての次の手順を実行します

。

1. 希釈 EDTA 血中リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) × 1 と 1:1。よく再中断します
。 リンパ球分離メディア
2. 層 (PBS の血: リンパ球分離メディア、2:1) 50 mL チューブに。
   1. 50 mL のチューブに PBS で希釈した血液の 30 mL のピペットします
   。
   2. 50 mL チューブの底に 15 mL のリンパ球分離培地を優しくアンダーレイします
   。
3. 757 × g で室温 (ブレーキなし) で 10 分間遠心します
。
4. 単核細胞を収集:
   1. 攪拌なし 5 mL ピペット末梢単核球の白い層を収集し、新しい 50 mL のチューブに配置します
   。
   2. 希釈 20 mL の PBS で収集した PBMCs
   。
5. 、PBMCs の洗浄:
   1. 225 x g で室温で 5 分間遠心します
   。
   2. は、チューブを反転して上澄みを廃棄します。もう一度繰り返します
   。
6. 赤血球溶解:
   注: 細胞ペレットが赤の場合は赤血球溶解緩衝液で細胞を治療 (材料の表 を参照してください)。
   1. 氷の 50 mL のチューブを入れて
   2. 5 mL の赤血球細胞溶解バッファーを追加します
   。
   3. は、赤血球溶解を完了する 3-5 分を待ちます。時間は赤血球汚染の程度に応じて異なります
   。
   4. 20 mL の PBS の追加によって反作用を停止します
   。 室温で 5 分間 225 x
   5. 遠心 g。チューブを反転して上清を破棄します
      。 注: オプション: RBC 換散を実行する場合洗浄、PBMCs とおり
   。
7. 洗浄 PBMCs:
   1. 部屋の温度で 5 分間 225 x g で 20 mL の PBS の遠心分離機を追加します
   。
   2. チューブを反転して上清を破棄します
   。
8. 完全な α MEM (1% グルタミン (初期濃度 100 X) と 10% 牛胎児血清を添加した) 内のセルを再停止します
。
9. は、ノイバウアー室を持つセルをカウントします。
   1. 氷酢酸でサンプル 1: 100 希釈し、希釈の 10 μ L を使用してセルをカウントする
   。
   2. の少なくとも 2 倍にカウントし、セルの合計の平均数を収集取得する複製の平均を計算します
   。
10. 細胞をプレート:
    1. cm ² あたり 750,000 PBMCs の濃度で細胞をプレートします
    。
    2. は 37 ° c 5% CO ₂ の大気中でインキュベーターでめっきされたセルを格納します
       。 注: デザイン MCSF または RANKL GFs。 覚えている少なくとも 3 技術でそれぞれの条件を実行することがなく通常の完全な α-MEM で扱われている細胞である否定的なコントロールを含むように実験をレプリケートします。少なくとも 3 生物の複製を実行します
    。
11. GFs を添加した培地を変更:
    1. 細胞播種後約 3 時間を待ってから、破片、未接続の細胞および赤血球を破棄するピペット (200-1,000 μ L) でメディアを削除します
       。 注: する細胞の剥離を避けるために媒体を変更するときは注意してください
    。
    2. 新しいの完全な α の MEM が 20 ng/ml の MCSF の補足を追加 (500 μ L/ウェル).
       注: ときに癌細胞と共培養、種子がん細胞 PBMC 播種後日
    。
12. メディアの変更をすべての 2-3 日 (α-MEM 20 ng/ml の MCSF の補足):
    1. 200-1,000 μ L ピペットで培地を除去
    。
    2. 200-1,000 μ L ピペットで追加新しい培
    。
13. セルは, 播種後 6-7 日追加 20 ng/mL の RANKL の完全な α-MCSF + MEM
。
14. 媒体を変更 (完全な α-MEM + MCSF + RANKL) ごとに 2-3 日間:
    1. 200-1,000 μ L ピペットで培地を除去
    。
    2. は、200-1,000 μ L ピペットで新しい媒体を追加します。分化誘導細胞播種後 14 日間を停止します
    。
    3. 破棄中、PBS で 2 回洗浄します
    。
15. パラホルムアルデヒドとセルを修正:
    1. 乾燥するセルのままにします
    。
    2. 4% パラホルムアルデヒドを追加 (材料の表 を参照してください).
    3. 室温で 20 分間加温します
    。
16. パラホルムアルデヒドを破棄し、500 μ L の PBS で 2 回洗って
    。 注意: パラホルムアルデヒドは有毒である;手袋、マスク、メガネを着用してください
。
17. 乾燥するセルを許可します
。
18. トラップの実行染色メーカーによると ' の指示 (材料の表 を参照してください).
19. カウント倍率 10 X で顕微鏡の下で手動で破骨細胞様細胞NA 0.30
    。 注: 破骨細胞様細胞は少なくとも 4 核トラップ + polycarion 細胞として定義されます
。

2。がん細胞培養

注: SCP2 ¹⁷、トリプル ネガティブ人間由来 osteotropic 細胞株など乳房腺癌細胞株の種類で実験することができます乳房癌細胞株 (MDA MB 231) とホルモン受容体陽性細胞ライン MCF7

。

1. 75 cm ² フラスコで単分子膜として、細胞の培養します。
   1. 75 cm ² フラスコでシード 1,000,000 がん細胞
   。
   2. 1% グルタミンと 10% 牛胎児血清 5% CO ₂ の大気中の完全な α-MEM 培の 37 ° C でセルを格納します
   。
2. 約 90% の confluency にセルをデタッチ:
   1. 培地を除去、PBS で洗浄、PBS でトリプシン 1 X 2-3 mL を追加します
   。
   2. 細胞 37 で 3-5 分の間孵化させなさい ° C
   3. 酵素反応を停止する完全な媒体の 8 mL を追加する 10 mL のピペットで 75 cm ² フラスコから戸建細胞を収集します
   。
   4. 225 x g で 5 分間遠心分離
3. 癌細胞を洗う:
   1. 10 mL の PBS を追加します
   。
   2. 600 x g で 5 分間遠心分離
4. · ノイバウアー室を持つがん細胞を数えます。
   1. 癌細胞を少なくとも 2 回カウントし、セルの合計の平均数を収集取得する複製の平均を計算します
   。

3。直接癌細胞の共培養破骨細胞への単球を受けて分化 nd

1. 挿入 (孔径 0.4 μ m) の癌細胞を播く:
   1. cm ² あたり 4,000 細胞の濃度でがん細胞を播く
   。
   2. 37 ° C、5% CO ₂ インキュベートします
      。 メモ: シードがん細胞 0.4 μ m 挿入で共培養実験の PBMC 播種後日
   。
2. セルが従うように 24 h 待つ
。
3. 場所シード培養 (プロトコルのセクション 1.10 参照) を開始する単核の文化に文化を挿入します
。
4. は、完全な α-MEM と 2-3 日毎、メディアを変更します。
   1. 200-1,000 μ L ピペットで培地を除去
   。
   2. 新鮮な追加 500 μ L 中です
      。 注: 共培養の第一の目的は、癌細胞の osteoclastogenic の力を理解するは、したがって、GFs に追加されません α MEM。共培養の実験、ne を含める(プロトコルの手順 1.10 でメモ参照) 通りのコントロールと破骨細胞の RANKL と MCSF (癌細胞なし) で区別されるの肯定的なコントロール。がん細胞の単核の細胞の上に配置しない挿入でシード、共培養のネガティブ コントロールとして使用されます
   。
5. 共培養を停止し、がん細胞を使用して、ダウン ストリーム分析:
   1. 13 日 PBMC 播種後し, 癌細胞播種後 12 日は新しいプレートに挿入を配置します
   。
   2. 下流解析が (議論 を参照) 実行される根拠に癌細胞培養を停止します
   。
6. 14 日破骨細胞分化を停止し、手順 1.15 で報告されたセルを修正します
。
7. トラップの実行染色直後または 14-30 日.
   メモ: オプションの染色: クリック率、破骨細胞特異的マーカーを検出する追加染色トラップ + polycarion 細胞が破骨細胞であることを確認、する研究者を実行します。F-アクチン リングの検出は別破骨細胞特定染色試金 ^{12 , 13 , 14}
。

結果

メソッドは、ひと末梢血単球から破骨細胞を簡単に区別するために最適化されました。単球培養は培養がん細胞、がん細胞が骨転移における破骨細胞形成を維持できる (前述の文献¹⁸) を確認します。がん細胞から分化した破骨細胞と、GFs は、図 1に示します。破骨細胞様細胞は 4 つ以上の核を持つ細胞をトラップ (紫セル) を汚すために肯定的です。破を定義するために使用する核の数の承認済みのカットオフは 3¹⁸, しかし、我々 は 4 を使用して、誤検知のリスクを最小限に抑えることを決めた。

モデルは、がん細胞によって誘導される井戸の破骨細胞数は肯定的な制御 (図 2) で得られたようなので、その乳がん癌細胞持続的な破骨細胞形成を示しています。

ディスカッション

前臨床の in vitroモデルがん細胞と骨細胞間クロストーク機構の研究は、骨転移治療の新しい戦略を作成するためのメカニズムを識別するために必要です。ひと末梢血 (図 3) から破骨細胞形成の完全な人間の in vitroモデルを開発しました。方法論の最適化中に重要なポイントの数が特定し、解決されました。最初は、種子に単核細胞の量を懸念しています。顕微鏡の数によって得られる細胞の数は大まかな数量だけリンパ球と単球、後者が破骨細胞形成実験のための種子に標的細胞を区別することは困難です。リンパ球は、プラスチック基板に準拠していないためにこうして大半は媒体の最初の変更で除去された単球を識別することができました。細胞は、細胞分化、特に前破骨細胞が融合し、なるために接近する必要があります破骨細胞形成の第 2 フェーズの相互に対話できるようにするために不可欠である高密度で播種しました。成熟破骨細胞。これらは細胞の数が多いと大量の血を必要とするため、複数の実験条件がある場合、さらなる困難が発生します。PBMCsなどの高濃度を持っているバフ...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
&アルファ;MEM	ユーロクロン	BE12-169F
グルタミン	ライフテクノロジー	ECB3000D
ウシ胎児血清	ライフテクノロジー	ECS0180DPR
hMCSF	Peprotech	300-25	ストレージの適応症を尊重しなければならない
hRANKL	Peprotech	310-01	ストレージの適応症を尊重しなければならない
酸性ホスファターゼ、白血球(TRAP)キット	Sigma Aldrich	387 A
リンパ球分離培地	Biowest	L0560-100
赤血球溶解バッファー	SIgma	11814389001 ROCHE
Trypsin	EuroClone	COD. ECB3052D
パラホルムアルデヒド 4%水溶液、EMグレード	電子顕微鏡 科学	157-4-100
MDA-MB-231 細胞株	ATCC	CRM-HTB-267
MCF7	ATCC	HTB-22
トランズウェル	コーニング	3470-クリア	これらのインサートは24ウェルプレート用です。 6.5 mm、0.4 μM; 孔径