ゼブラフィッシュ幼虫の改良実験操作のための長期のライブ イメージング デバイス

Summary

本稿では、zWEDGI を説明します (ゼブラフィッシュ成長とイメージングのためのわなに掛ける事のデバイスと傷害)、オリエント、ゼブラフィッシュ幼虫を抑制するように設計の区画化装置であります。デザインは、離断尾と創傷治癒と再生の高解像度蛍光顕微鏡画像の長期的なコレクションを許可します。

Abstract

ゼブラフィッシュの幼虫は、発生生物学と創傷治癒過程の両方の重要なモデル生物です。さらに、ゼブラフィッシュの幼虫は細胞の分解能で時間と空間の動的な生命現象のライブ高解像度顕微鏡イメージングの貴重なシステムです。しかし、幼虫の発育と組織再生、ライブ イメージングの agarose のカプセル化の伝統的な方法が低下します。したがって、本稿では、zWEDGI を説明します (ゼブラフィッシュ成長とイメージングのためのわなに掛ける事のデバイスと傷害) を設計・製作を確保しながら高分解能顕微鏡の幼虫を方向づけるための機能的区画化装置としてデバイスとその後の気ままな尾開発と再成長内尾鰭断裂。このデバイスは、負傷と生存率を維持しながら長期的なイメージングできます。ZWEDGI 型は、3 D プリントは、そのジオメトリのカスタマイズ性は多様なゼブラフィッシュ イメージング アプリケーションを簡単に変更、です。さらに、zWEDGI は、負傷や試薬の応用実験中に幼虫へのアクセスなど、数多くの利点は並列合理化されたイメージングのための複数の幼虫の方向とデバイスの再利用性を提供しています。

Introduction

ゼブラフィッシュ仔動脈分布の再生能力ように理想的なモデル有機体傷害応答として、癒しと再生^1,2,3、4を調べること。アクセス トランスジェニックゼブラフィッシュ ラインおよびゼブラフィッシュの解剖学的なさらなる透明性の配列には、傷応答イベントとして長期的な再生プロセス⁴の研究生体内でそのユーティリティを強化します。したがって高画質タイムラプス蛍光顕微鏡を使用してこれらの生物学的過程の研究は、生存率を維持しながら高い安定性とゼブラフィッシュ幼虫の最小限の動きは、ライブ イメージング ゼブラフィッシュ デバイスを要求します。それはキー デバイスにより、ヒーリングしながら効果的な負傷のため、再生発生装置によって影響を受けないです。

Agarose のライブ イメージング中に幼虫を埋め込みの標準的なライブ画像安定化方法の成長を制限する傷の再生⁵と幼虫が 4 の後心臓ストレスと組織壊死の徴候を示し始めるので、死亡率を高める可能性があります。時間⁴。したがって、関心領域から agarose の除去は正常な開発を許可する必要があります、再生⁶、agarose として潜在的な損傷に幼虫を公開を切り取る。さらに、技術を埋め込みアガロースとユーザーを方向づけなければならない短い時間で幼虫 agarose^5,6,7を固化する前に。急速に幼虫を操作するだけでなくユーザーのスキルが必要です、それはまた幼虫への損傷のリスクします。シリコン真空使用グリース、塩ビ配管その他イメージング室を作成する畝寒天井戸³または divets⁸など、これらの欠点を回避するためにライブ イメージングのための幼虫を安定させるための方法が記載されているが材料⁶と回転チューブ⁹、これらのメソッドの多くの集中的な厄介な多くの場合非再利用可能、労働環境操作を許可しない (薬物治療、負傷など。) 魚がマウントされた後。

したがって、zWEDGI デバイス (図 1) は、寒天試料の操作中ゼブラフィッシュ幼虫の長期のライブ イメージングを使用する実装の欠点のいくつかを克服するために設計されました。ZWEDGI は、荷重、拘束、負傷、2 〜 4 日後受精ゼブラフィッシュ幼虫のイメージングの 3 セミオープン区分室を許可する (図 1 a) で構成されます。デバイスはポリジメチルシロキサン (PDMS) からを作製し、60 mm ガラス下部イメージング皿のカバー スリップの上に配置されます。モジュラー デザインと標準的な製造技術の使用変更に対応しやすく、プロシージャの特に実験プロシージャの様々 な zWEDGI デザインただしここで示した設計は創傷治癒研究、意図されていたこと実験操作と長期的なイメージングの最小限の拘束が必要です。

Protocol

注: ゼブラフィッシュ幼虫 2 〜 4 日後受精 (dpf)、ウィスコンシン大学マディソン校の研究動物リソース センターのガイドラインに従ってください用基本 zWEDGI デザインに処方されました

。

1 です。 設計と金型の 3 d 印刷

目的形状と 3 d モデリング ソフトウェア ⁵ で属性を持つデバイスの

1. モデル、PDMS コンポーネント。空白の金型と PDMS 部分のアセンブリを作成し、PDSM 部品に対応する金型のキャビティを作成することによって PDMS 一部の否定的な型を生成します。金型を 3 D プリント ( 図 2 は、手順 1.1) の .stl ファイルとして保存します
   。 注: ここで示した金型設計 ( 図 1) の光造形 (.stl) 形式ファイル https://morgridge.org/designs/ でダウンロード可能です
。 感光性樹脂 3 D プリンター ( 図 2、ステップ 1.2) を使用して
2. 印刷金型。複数の金型を作る単一の印刷で可能であれば、ので複数デバイス成形できる PDMS の単一のバッチで
   。 注: の例は、0.075 mm ビーム直径と 0.05 mm 層の厚さと、感光性樹脂樹脂 ⁵ を使用して高解像度モードでプリントしました。
   1. 優しくスクラブ、未硬化の樹脂を除去するため細かいブラシ、変性アルコール スプレー ボトルで圧縮空気を使用して金型クリーン。マイクロ地域から任意の材料を削除します
   。
   2. 後未硬化の辞任はゼブラフィッシュ幼虫 ¹⁰ に有毒であると 60 分それぞれの側に UV ポスト治療装置にはカビを治すです
   。
3. 砂の平らな面に 200 の屑の紙やすりと金型のキャビティ側まですべてのシール面はサンドペーパー (チャネル形状、金型周囲の読み込み) と接触しています。軽く砂 400 と 600 粒の砂紙で徐々 に、すべてのジオメトリ フェーシング ( 図 2、手順 1.3) でフラッシュの滑らかな表面を生成します。ダイヤル ゲージ設計深度に近いことを確認するとサンディングの後、キャビティの深さを測定します。
   1. 型をきれいにし、超音波クリーナー 30 分のための水でいっぱいに配置することによって流水の下でフラッシュ ディスク (1 3/4 インチの直径 1/4 インチ厚いホウケイ酸ガラスまたはアクリル ×; 金型ごとカバー 1 つのガラス) をカバーします
   。
   2. 爆破する圧縮空気で乾燥と清潔両方金型をイソプロピル アルコールとフィルター選択された圧縮空気をカバーします。浮遊残骸からの汚染を最小限に抑えるためにデバイスを作製するのに場所としてクリーン ベンチを使用します。洗浄金型とガラスをクリーン ベンチまたは必要になるまで覆われてペトリ皿でカバーを残す
   。

2。ZWEDGI デバイスの PDMS 作製

1. 注ぐ 184 による確認、PDMS シリコーン エラストマー ポリジメチルシロキサン (PDMS) で、ベースの比率 5:1 (活性化する) プラスチックのカップに。木製クラフト棒で、パンを混練のような自体にゲルをかき混ぜながら 2 分のためによく混ぜます。5 金型を使用するには、ベースと活性剤 2 g 10 g を使用します。
   1. 解消ガス真空デシケータ 25 時間 45 分のための混合物すべての泡がなくなるまでです
   。
   2. 約 0.75 ml の 10 mL の注射器を使用して金型はわずか半月板 ( 図 2、ステップ 2.1) あふれるまで PDMS の各 3 D 印刷金型の空洞を入力します
   。
   3. 解消ガス充填充填時を形成している可能性があります追加の泡を削除する 45 分用金
   。
2. ( 図 2、手順 2.2) をトラップから泡を防ぐために斜めにディスクを押し、PDMS 充填型の上にガラスのカバー ディスクを適用します。ガラス ディスク カバーが適用される追放される余分な PDMS を許可します
。 金型のカバー ディスクをしっかりとホールドする
3. 使用小型ラチェット クランプします
   。 注: これは、平らな面を作成します、PDMS、硬化させるし、3 D プリント ジオメトリのガラス製カバー スリップと同じ高さに穴を生成します。また、一度に治すことができるデバイスの数を増やす、構築マルチ クランプ デバイス (例えば。 図 2、ステップ 2.3).
4. は、90 分 ( 図 2、ステップ 2.4) 100 ^o C のオーブンで固定された金型の PDMS 装置を治します。オーブンから金型を除去、簡単に処理できるまでを冷却すること。クランプ装置が金属の場合は金属が残留熱による PDMS を治すため継続するを防ぐためにクランプからカビやカバー ディスク アセンブリを削除します
   。 注: デバイスがまだ少し暖かい完全治癒ではないが、金型から削除する最も簡単です。ただし、一度オーブンから、金型を削除カバー ディスクが削除されると、デバイスは離型に進む前に日のカップルのため座ることができます。場合はデバイスは、硬化オーブンから削除した後まもなく demolded は、完全に治すためにそれを可能にしながら汚染物質を最小限に抑えるため覆われてペトリ皿に置きます
。

3。ガラスの皿にプラズマ接合 zWEDGI

1. クランプ ベンチ逆に PDMS デバイスを含む金型、金型 ' s 形状、平行で作業駅のベンチに直面して。
   1. スタート PDMS プル タブをフラット先端ピンセットを使用して、金型から解放することによって PDMS デバイスを削除します。(( 図 2 は、ステップ 3.1) の鍋からケーキを除去する) のようにピンセットで金型の周囲に作業
   。
   2. 使用は、圧縮空気と優しくプル タブにデバイスの下の空気を吹きを金型からデバイスをプルするピンセットにフィルター処理されます。別金型から PDMS を助けるために空気を許可、薄いトンネル セクション周辺特別な注意をピンセットの先端を取ってゆっくり仕事します
   。
2. トンネル拘束ウェッジ プラスチック ( 図 2 は、ステップ 3.2) に触れているので、ガラス底皿のカバーの内側に逆さま PDMS デバイスを配置します
。
3. に逆さまに zWEDGI と対応するガラス底皿皿カバー プラズマ クリーナー ガラス内側上向き ( 図 2、ステップ 3.3)。
   1. プラズマ圧力に達する 500 mTorr まで清掃を避難
   。
   2. セット無線周波数 (RF) 電源高。デバイスを公開し、RF 周波数約 2 分のために料理ゆっくりと逆加圧チャンバー、クリーン ルーム フード デバイスと皿を返します
   。
4. PDMS デバイス皿カバーから取り外します。
   1. ガラス底皿 ( 図 2、ステップ 3.4) の中央に慎重にピンセットのバックエンドを使用してそれを配置することでガラスを正しい向きに PDMS zWEDGI を裏返して、軽く押し下げて、PDMS空気の泡が下に挟まれていないことを確認するデバイスです。マイクロ チャンネルの分のジオメトリの周囲の圧力を適用し、( 図 5) のエッジを滑らかに、PDMS
      。 メモ: PDMS とガラスとの完全な接触はプラズマ接合からのよりよい付着を確認します。ZWEDGI デバイスは、プラズマ グラスボート 6 ウェル plat など、他の形式の底のガラス皿に結合をすることができます。e ( 図 2).
   2. はクリーン ルーム フードから取り外す前にデバイスの料理をカバーを配置します
      。 注: デバイスがガラスに固定されている一度プロトコルを一時停止できる使用の準備ができているまで
   。

4。チャネルの準備と読み込み幼虫

注: 一般的なゼブラフィッシュ飼育、ゼブラフィッシュ本、利用可能なあたりオンライン http://zfin.org/zf_info/zfbook/zfbk.html で実施されました。アダルト ゼブラフィッシュと胚は、 ¹ を前述のように維持されました。AB 型野生菌株を使用しました。機関に従う ’ 生きている幼虫をイメージングの要件について具体的に s 動物ケア プロトコル

。

1. リンス チャンネル、マイクロ ピペットを使用して処分をリンスするあたり 70% のエタノールを 100 μ L の最小限に抑えてチャンネル トンネルします。エタノールと 2 または 3 回二重蒸留水ですすぎを削除します。乾いた空気で乾燥させて
。
2. は、幼虫の皿のガラス基板への付着を最小限に抑えるために室温で 10 分間 (1% の水で希釈濃度) でスキムミルクでチャンネルを入力します。その後、優しく数回洗浄する二重蒸留水中のデバイスが水没します。乾いた空気乾燥させて逆さま
   。 注: プロトコルはここで一時停止することができます。ZWEDGI デバイスのこの準備には、使用する日前にいくつかを行うことができます。室温で覆われる保存します
。
3. 100 μ L 2% 溶けて LMP アガロースを 100 μ L 2 と組み合わせることで (LMP) agarose E3 バッファー ¹¹ x Tricaine (0.4 mg/mL Tricaine - 3-アミノ安息香酸エチル) で加温 38 ^o c. 準備 1% 低溶解点が 1% を維持します。38 ^o C ゲル化を防ぐためにホット ブロック内でアガロース/tricaine ソリューションです
   。 注: 多光子顕微鏡 ¹¹、(キャスパー ¹²) などのいずれかの非色素ゼブラフィッシュ バリアントを使用または 0.2 mM 色素形成を防ぐために N フェニールチオウレアを含む E3 で幼虫を維持 ¹¹ 色素による近赤外域波長の吸収を最小限に抑えることです
   。 注意: N フェニールチオウレアは有毒です。機関に従う ' 処分規則
。 E3
4. 麻酔幼虫を含む 0.2 mg/mL tricaine (Tricaine/E3) ^{11 を} バッファーします。幼虫が動かずとタッチの刺激に応答するまで待機します
。
5. には、Tricaine/E3 の数マイクロリットルとチャンネル事前濡れています。
   1. ピック ワイド オリフィスのピペット チップを使用して単一の幼虫を。( 図 3 a) チャンネルの読み込み中に幼虫を入金します。背側の面は、チャンバーと差し止めトンネル ( 図 3 b) に向かって尾面の直線エッジがよう、チャンバーの幼虫に回転ピペット チップまたは同様のツールを使用します
   。
   2. は、慎重に差し止めトンネル ( 図 3) に流入する幼虫をできるように、負傷商工会議所から羊水を抜き取る。幼虫 ( 図 3 D) の周りの水分を維持しながら、液体のほとんどを削除します。このプロセスは、負傷の商工会議所の方にわずかに皿を傾けることによって支援することができます
   。
6. Tricaine/E3 で 1 %lmp アガロースを配置 (38 ~ ^o C) 幼虫に ' s ヘッド、チャンバー ( 図 3E) を充填します。適切な位置で幼虫を固めるための agarose を許可します。水和を維持するために必要に応じて負傷の商工会議所に Tricaine/E3 を追加します。残りの 2 チャネルのプロセスを読み込み、これを繰り返します
。
7. 負傷の商工会議所 ( 図 3 f) に差し止めのトンネルを通って浸透する agarose を丁寧に注射針を使用しています。追加 tricaine/E3 (負傷、短期的イメージング、または傷治療の分離) のための agarose だけでいずれかを追加したり、培養皿 (長期用) を記入します。蒸発を防ぐために培養皿のふたを交換します。幼虫をこの時点で (無傷) イメージまたは負傷できます
。

5。負傷とイメージングの幼虫

1. 脊索 ¹¹ 人が負傷した商工会議所 ( 図 3 G, H) の後方の垂直尾翼をトランセクト滅菌メス刃を使用しています。必要な場合追加 tricaine/E3 を追加し、培養皿のふたを置き換えます
   。 注: また、関心の発達期間によって、幼虫負傷、E3 で回復を許可して保守できるインキュベーター (28.5 ^o C) で彼らとしてチャンネルに読み込まれるその時点で目的のイメージングの時間まで上記で説明した
。
2. は、60 mm ガラスの下皿を収容する舞台挿入で倒立顕微鏡上に麻酔の幼虫と zWEDGI デバイスをインストールします。目的の位置にしっぽを取得する必要に応じて料理を回転最上位チャネルで幼虫の尾を探します。特定の実験に必要なイメージします
   。 注: zWEDGI 高解像度光学顕微鏡検査、蛍光広視野レーザ顕微鏡など広く適用されます。ゼブラフィッシュ幼虫を撮像パラメーターに関する考慮事項の数がありますが、特定パラメーターをイメージングは、楽器、サンプルおよび実験依存。ここでは、幼生の尾を次のパラメーターを利用したカスタム ビルド多光子顕微鏡 ^{5 , 11} にイメージしました: 長い作業距離水浸対物レンズ、890 nm レーザー励起 X 40445/20 nm 発光フィルターと 512 x 512 解像度
。

6。実験の終わり

1. 削除顕微鏡から zWEDGI 料理。氷水浴または 4 ^o C、少なくとも 20 分のために、zWEDGI を配置することによって幼虫を安楽死させるし、ハートビートや循環の有無を評価します
   。 注: 幼虫が別々 のコンパートメントに保管されるため、幼虫個別に回復できます鉗子やピペットで寒天を注意深く引いて。寒天は、頭部領域と幼虫用抗体の汚損のための固定など、その他の手順または RNA または蛋白質の抽出のための処理から削除できます
。
2. 幼虫と寒天培地を除去した後エタノール zWEDGI と蒸留水、手順 4.1 で説明した清潔で乾燥空気を逆さまにセットします。ストアは、涼しい、乾燥した場所で説明します。スキムミルク (ステップ 4.2) 次の使用前に必要に応じて再コートします
   。 注: zWEDGIs 再利用できる複数回、PDMS がガラスから来るだすまで
。

Results

ZWEDGI PDMS マイクロ流体デバイス癒しとゼブラフィッシュ幼生の再生が負傷した尾鰭のライブ イメージングに関連付けられている (下記参照) 4 つの主要な機能に対応するために設計された機能的区分装置です。PDMS は、それだけ容易に利用可能ではないため、生体適合性、しかしまた金型でうまく動作するための業界標準 zWEDGI 作製に選ばれました。また、PDMS なりますデバイス再利用可能なとハード鋭利な先端のボイド デバイスが形成されます。ZWEDGI は、特にイメージング、3) 尾鰭と 4) 顕微鏡イメージングの負傷の適切な向きで 1) デバイスに幼虫、2) 拘束の読み込みを許可、以下で詳しく説明します。

読み込み

ZWEDGI デザインは、3 つのチャネルで構成されています、それぞれ 1 匹の幼虫 (

Discussion

ZWEDGI デバイスの目的は、安定化と高分解能対物レンズの小さな作業距離内にある魚の定位によるイメージング 3 D タイムラプスをキャプチャすることです。これらの仕様を満たしながらそれはまた、以上改善ライブ イメージングのための伝統的な寒天製剤です。正しく行われていない場合によって、欠陥のあるデバイスを zWEDGI の作製 (下記参照) の 3 つの重要な手順があります。

PDMS 準備 (図 5 a)

気泡を防ぐためには、金型をドガ PDMS が追加された後。すべての泡が脱ガス後解消されているし、ガラス ディスクのアプリケーションに注意を払うことを確認してください。ガラス ディスクは、斜め下と、PDMS 内に空気がトラップされていないことを確保するために適用する必要があります。ほこりは、プロセスの手順のほとんどの間に問題をすることができます。ほこりを防ぐためには、徹底的に各クリーニングの手順を完了し、ステップ間のクリーン フード パーツを格納します。UV 硬化前...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fabricate molds
Solidworks Professional Accedemic Research 3Dモデリングソフトウェア	Dassault Systemes	SPX0117-01	Fisher Unitech
Viper Si2 SLA 3Dプリンタ	3D Systems Inc.	23200-902	3Dシステム株式会社
Accura 60 フォトポリマー樹脂	3D Systems Inc.	24075-902	株式会社3Dシステムズ
変性アルコール	サニーサイド	5613735	Menards
UV後硬化装置	3D Systems Inc.	23363-101-00	3Dシステム株式会社
TouchNTuff ニトリル手袋	Ansell	92-600	McMaster Carr
220B, 400B, 600 grit T414 blue-bak サンドペーパー	ノートン	66261139359、54、52	MSC
ホウケイ酸ガラスディスク、直径2インチ	McMaster-Carr	MIL-G-47033	McMaster-Carr
超音波洗浄剤	ブランソン	1510R-MTH
イソプロピル消毒アルコール70%	ヒドロックス	54845T43	McMaster-Carr
10オンス透明プラスチックカップ	WNAマスターピース	557405	Amazon
6 "クラフトスティック	パーフェクトスティックス	クラフトWTD-500
名前	会社	カタログ番号	コメント
zWEDGI PDMSデバイス
Sylgard 184シリコンエラストマーキット	ダウ・コーニング	4019862	エルワース・接着剤
10mLシリンジ	ベクトン・ディキンソン	305219	Vitality Medical Inc
デシケーター	Bel-Art Scienceware	F42027-0000	Amazon
4 ラチェットバークランプ	ピッツバーグ	68974	ハーバーフレイト
ラボオーブン	クインシーラボインク	20GC	グローバル産業用
ピンセット	Aven	549825	McMaster-Carr
圧縮空気フィルターノズル	Innotech	TA-N2-2000FT	クリーンルーム供給
真空ベンチ万力	ウィルトンツールグループ	63500	MSC工業用
55mmガラス底皿; 30mmマイクロウェル#1.5カバーガラス	Cellvis	D60-30-1.5-N	Cellvis
プラズマクリーナー	Harrick Plasma	PDC-001	Harrick Plasma
Name	Company	カタログ番号	Comments
Loading Larvae
Pipetteman, P200	Gilson	F123601
100% エタノール (使用前に水で 70% に希釈)	Pharmco-aaper	111000200
トランスファー ピペット	フィッシャーブランド	13-711-5A	フィッシャー サイエンティフィ
ック 粉末スキムミルク		2902887	MP バイオメディカルズ
二重蒸留水
N-フェニルチオル尿素	シグマ-アルドリッチ	P7629	シグマ-アルドリッチ
トリカイン(エチル3-アミノ安息香酸)		C-FINQ-UE	Western Chemical
低融点アガロース	Sigma-Aldrich	A0701	Sigma-Aldrich
ヒートブロック(ドライバスインキュベーター)	Fisher Scientific	11-718-2	Fisher Scientific
E3バッファー
大型オリフィスピペットチップ、200 uL	フィッシャーブランド	02-707-134	フィッシャーサイエンティフィック
汎用ピペットチップ、200 uL	フィッシャーブランド	21-197-8E	フィッシャーサイエンティフィ
#15メスブレード	フェ	ザー2976	アマゾン
25Gシリンジ針	BD	BD305122	フィッシャーサイエンティフィック
名前	会社	カタログ番号	コメント
Imaging
inverted microscope
Imarisイメージングソフトウェア	Bitplane