このコンテンツを表示するには、JoVEへの購読が必要です。 または、無料トライアルをお申し込みください。

方法論記事

ローカル制御表面密着性にデンドリマーを用いた不均一な Nanopatterns: 軟骨細胞分化を指示する方法

6.9K 閲覧数

⸱

DOI：

10.3791/56347

⸱

2018年1月20日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Institute for Bioengineering of Catalonia (IBEC), The Barcelona Institute of Science and Technology (BIST), 2Department of Engineering Electronics, University of Barcelona (UB), 3Networking Biomedical Research Center (CIBER), 4Instituto de Investigacin Biomédica de Málaga (IBIMA), Department of Organic Chemistry, Universidad de Málaga (UMA), 5Andalusian Centre for Nanomedicine and Biotechnology-BIONAND, 6Unidad de Bioingeniería Tisular y Terapia Celular (GBTTC-CHUAC), Grupo de Reumatolog ía, Instituto de Investigación Biomèdica de A Coruña (INIBIC), Complexo Hospitalario Universitario de A Coruña (CHUAC), Sergas, Universidade da Coruña (UDC), 7Institució Catalana de Recerca i Estudis Avançats (ICREA), 8Instituto de Investigación Biomédica de Málaga (IBIMA), Department of Cell Biology, Genetics and Physiology, Universidad de Málaga (UMA)

この記事について

サマリー

アルギニン-グリシン-アスパラギン酸 (RGD) 表面の局所密度のナノスケール制御を許可、デンドリマーを用いた不均一な nanopatterns を取得するメソッドの記述方法や細胞接着と軟骨分化の研究に適用されます。

要約

細胞接着・分化は、大きな影響を持つローカルの濃度と細胞外マトリックス (ECM) コンポーネントのナノスケール処分によって調節されます。アルギニン-グリシン-アスパラギン酸 (RGD) の大規模な不均一な nanopatterns を取得する方法の紹介-ローカル RGD のナノスケール制御を許可するデンドリマー表面密度。Nanopatterns、初期濃度の異なる溶液からデンドリマーの表面吸着によって形成される水接触角 (CA)、x 線光電子分光 (XPS)、によって特徴付けられるし、走査プローブ顕微鏡技術など走査型トンネル顕微鏡 (STM)、原子間力顕微鏡 (AFM)。粒子間距離を最小の確率等高線図を用いた原子間力顕微鏡画像を用いた、細胞接着性応答と分化相関、RGD のローカル表面密度を測定します。ここで紹介したナノパターニング方法は大きな表面積を単純な方法でスケール アップすることができます簡単な手順です。それは細胞培養のプロトコルに完全に準拠ではこうして、細胞濃度依存性効果を発揮する他の配位子に適用することができます。

概要

ここで我々 はナノスケールで地元密着の制御を許可する細胞培養表面を取得するシンプルで汎用のデンドリマーを用いたナノパターニング手順をについて説明します。1,2,3と細胞接着のナノパターニング接着4に関連する細胞の要件への深い洞察を提供している ECM 組織のナノスケール詳細が報告されています。 5。ミセル リソグラフィ ベース nanopatterns を用いた実験は約 70 のしきい値を明らかに RGD ペプチド nanospacing、この値6,7,8 上が大幅に遅れている細胞接着の nm、9。これらの研究はまた、細胞接着9,10,11グローバル リガンド密度よりも地元の大きな影響を強調しました。

形態形成、時に、細胞周囲の環境との相互作用は、最初の分化のイベントは、最終的な複雑な組織構造が形成されている続行をトリガーします。この枠組みの中でナノパターン表面は形態形成に関する初期の細胞表面の相互作用の影響に取り組むために使用されています。68 の横方向の間隔とリソグラフィ ベース RGD nanopatterns β 型 Ti 40Nb nm 合金 95 150 nm 間の RGD nanospacings 強化の分化中12非コミット幹細胞の未分化の表現型を維持するためにヘルプ間葉系幹細胞の脂肪細胞/骨13,14,15と軟骨の運命16(MSCs)。また、ナノスケール信号合図17の建築規制を提供することによって細胞の接着および分化を指示する信号コンポーネントで変更された自己組織化高分子を示されています。この点で、外側の球18,19,代20の表面に細胞と相互作用する部分を備えたデンドリマーの沈着は細胞接着21,22, の研究に使用されています形態23,24、および移行イベント25,26。それにもかかわらず、これらの研究における表面キャラクタリゼーションの欠如の場合、デンドリマー表面形状と細胞応答間の相関関係を確立することは困難になります。

デンドリマーは、低イオン強度のソリューションから低料金面に吸着するとき、液体のような順序と定義された間隔デンドリマー nanopatterns を取得できます。27このプロパティに基づいてご紹介ローカル RGD 表面密度のナノスケール制御を許可する低料金の表面上の RGD 修飾デンドリマーの大規模な不均一な nanopatterns を取得するメソッド。水接触角 (CA)、x 線光電子分光法 (XPS) と走査型プローブ顕微鏡 (STM および原子間力顕微鏡 nanopatterns) の技術ショー ソリューションの初期デンドリマー濃度の変更をローカルのリガンド密度を調整できます。ローカル RGD 表面密度は粒子間距離を最小の確率コンター マップによる AFM 像から定量化し、細胞実験との相関します。他のナノパターニング技術4と比べると、デンドリマーを用いたナノパターニングは簡単で、大きな表面積、したがって細胞文化アプリケーションと完全に互換性がするスケール アップ。Nanopatterns は、大人の人間の MSCs の29の軟骨誘導細胞接着28ローカル RGD 表面密度の影響を評価する生理活性基板として使用されます。RGD デンドリマーを用いた nanopatterns が細胞の成長を維持し、高いローカル RGD 表面密度によって細胞の接着を補強するが分かった。分化実験では、基板に細胞の中間の接着性は、MSC 凝縮と初期軟骨分化を支持しました。使いやすさ、デンドリマーと周辺グループを変更できます、ためここで説明した方法は、他の ECM リガンド濃度依存性細胞に効果を発揮できるさらに拡張できます。

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

プロトコル

1. 基板の準備

  1. 1.4 x 1.1 cm au (111) 基板をアニールします。
    1. ガラス-セラミック ホブの au (111) 基板を置き、アルゴン雰囲気下で冷却する基板の 3 分許可ブタン炎でそれをアニールします。各 au (111) 基板には、この手順を繰り返します。
      注: au (111) 基板は、アニール後すぐに使用ください。
  2. ポリ (L-乳酸) の作製 (PLLA)-ガラス基板をコーティングします。
    1. カットし、スライド ガラスを洗います。
      1. ダイヤモンド チップ カッターで 1.25 cm 1.25 cm x の 18 スライドに顕微鏡のスライドをカットします。上部と下部の側面を後で識別できるように、各スライドの下側に小さなくぼみを作る。
      2. スライドを 96% のエタノールに続いて脱イオン水で徹底的に洗います。風乾することできます。
    2. 2% 乳酸溶液を準備します。
      1. 1, 4-ジオキサン圧力管内の 10 mL にポリ乳酸の 200 mg を追加します。攪拌棒を追加し、チューブをしっかりと閉じます。
      2. グリセリン風呂 24 h の穏やかな攪拌下 60 ° C でホット プレート上に圧力管を置き、15 mL のバイアルにソリューションを転送します。
    3. ポリ乳酸の溶液でスライド ガラスをコーティングします。
      1. スライド ガラスとポリ乳酸溶液でバイアル 60 ° C でクリーン ホット プレート上に配置します。上向きスライドを配置することを確認し、必要な温度に達するまでに少なくとも 10 分間維持できるようにします。
      2. スピン コーターを準備し、表 1に指定されたプログラムを設定します。
      3. 真空システムを使用して、スピン コーターに表向きでスライドの 1 つを配置します。パスツール ピペットでポリ乳酸溶液 0.25 mL を表面全体が覆われていることを確かめて、スライドに適用します。コーティング プログラムを実行します。スライドごとにこの手順を繰り返します。

2. デンドリマー ナノパターニング

  1. RGD 修飾デンドリマー (RGD-システイン-D1) 28溶液の調製。
    1. 6.494 mL の脱イオン水にデンドリマーの 5 mg を溶解します。これは、ソリューション a.
      注: は、準備から 6 ヶ月以内デンドリマー原液を使用します。
    2. 10 分の溶液に超音波を照射し、B および C 以下の表 2のソリューションを準備します。
    3. 超音波 10 分解決 C と D、E および F の次の表 2のソリューションを準備します。
    4. 使用するまで 4 ° C で B、C、D、E および F のソリューションを保存します。溶液は、後で使用するための-20 ° C で保存できます。
  2. 基板上に RGD Cys D1 デンドリマーのナノパターニング
    1. ティッシュ文化フードの基板を 13 分間紫外線を照射して滅菌します。
      注: この手順のみ必要ですナノパターン基板が細胞培養基板として使用されることになります。この場合、次の手順のため無菌状態 (ティッシュ文化フード、滅菌材料、ソリューション ・技術) を維持します。
    2. ピンセットで慎重に処理するが、プレートの井戸の中をそれぞれの基板面を配置します。
    3. ソリューション B、C、D、E および F 10 分の超音波照射します。
    4. RGD Cys D1 デンドリマー ソリューションを基板 (2 mL/も) を含む井戸に直接注射器を使用して 0.22 μ m 径のフィルターを通過します。デンドリマー濃度あたりの少なくとも 3 つのレプリカをお勧めします。閉じるし、プレート シール 16 時間 (RT) 室温でそれを残します。
    5. 削除し、ソリューションを破棄します。基板乾燥と滅菌の脱イオン水を洗ってください。4 ° C で基板を格納します。
      注: プロトコルはここで一時停止することができます。

3. コントロール基板の準備

注: 滅菌のティッシュ文化フードと滅菌材料のみのソリューションですべての手順を行ったし、技術が使用されました。少なくとも、6 は使用される (肯定的な制御の 3 つのレプリカ) と負の制御の 3 つのレプリカ基板を制御します。

  1. ティッシュ文化フードの基板を 13 分間紫外線を照射して滅菌します。
  2. 線維芽細胞の付着実験用制御基板。
    1. 負の制御として炎焼鈍 au (111) 基板を使用します。ゴールド28抗細胞接着特性をよく知られている蛋白質変性効果があります。すべてのソリューションを超音波し、基板の孵化前にフィルターします。
    2. 肯定的なコントロールの RGD 修飾 PEG チオール、Ac-Gly-Arg-Gly-Asp-Ser-Asp-NH-ethylene リコール モノラル-11-mercaptoundecanamide (RGD-ペグ-SH)30とトリエチレング リコール溶液で炎焼鈍 au (111) 基板を浸すモノラル-11-mercaptoundecyl エーテル (ペグ-SH) 96% エタノール室温 16 時間で 1: 100 のモル比で
    3. エタノールで基板を徹底的に洗浄し、アルゴンで乾かします。4 ° C で基板を格納します。
  3. 軟骨分化の制御基板です。
    1. 負の制御として原始的なポリ乳酸基板を使用します。任意の表面処理なしポリ乳酸は細胞と貧しい人々 のインタ フェースを示しています。31
    2. ポジティブ コントロール用リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) で 0.1 mg/mL フィブロネクチンの 5 mL を準備し、室温 1 時間フィブロネクチン溶液 1.6 mL 各ポリ乳酸基板を孵化させなさい
    3. 削除しフィブロネクチン液を捨て、PBS で基板を洗浄します。4 ° C で基板を格納します。

4. 表面キャラクタリゼーション

  1. 原子間力顕微鏡イメージング
    1. 粗さ解析のポリ乳酸基板上の AFM イメージングを実行します。デンドリマーは直径 4-5 nm、1 の粗さの値を持っているので 28awd-4 の適切な可視化の nm を取得する必要があります。また、28awd-4 の AFM イメージングを実行します。両方のケースでタッピング空気モード原子間力顕微鏡を実行します。
    2. シリコン片を選択ばね定数 k = 40 N/m および共振周波数 ν = 300 kHz と AFM 装置にマウントします。
    3. 原子間力顕微鏡のステージ上には、サンプルをマウントします。装置のセットアップによってチューニングとイメージングの仕様が異なる場合があります。製造元のハンドブックを参照してください。
    4. 顕微鏡の先端とサンプルの連絡先までアプローチします。
    5. 粗さ解析のためポリ乳酸の画像、3 つの独立した基板から基板ごと 20 x 20 μ m の少なくとも 4 つの代表的なエリアを選択します。画像のデンドリマー nanopatterns、1 つの条件 (初期デンドリマー濃度) 3 つの独立した基板から 5 × 5 μ m の基板あたりの少なくとも 3 つの代表的な画像を選択します。イメージング中にデンドリマー層を損傷しないように、最低限の力を保つためにセット ポイントを調整します。
      注: イメージの領域の選択は、また圧電スキャナーの動作範囲に依存します。この点では、機器のマニュアルを参照してください。
    6. 原子間力顕微鏡高さ画像あてはめによるプロセス各多項式 AFM 装置の製造元の独自のソフトウェアを使用して機能を平準化するラインをスキャンし、表面粗さを計算するポリ乳酸からのそれらを分析します。根意味正方形 (RMS) 解析は、適切なオプションを提供可能性があります。
  2. ローカル RGD 表面密度測定。
    1. 表面にデンドリマーを選択する処理した AFM 高さ画像のイメージのしきい値を取得します。
    2. 画像処理ソフトを使用してパーティクルの位置を決定し、最小の粒子間距離 (d分) を取得するそれらを使用します。
    3. D分確率コンター マップを取得する対応するパーティクルの位置にz d最小値をプロットします。最高のローカル RGD 表面密度 (d分< 70 nm) の領域を視覚化するプロットのカラー スケールを調整します。
    4. 最も高いローカル RGD 表面密度の画像処理ソフトを使用しての地域を定量化します。デンドリマー集計の領域を計算に含めます。
  3. STM イメージング。
    注: STM イメージングは、導電性 au (111) 基板上への nanopatterns に対してのみ実行できます。測定は、空中で行われます。
    1. STM 装置の試料ホルダーにナノパターン基板を配置します。テスター サンプルとホルダー間の電気接続を確認します。
    2. 選択したプローブ材料 (すなわちヒントをエッチングします。Pt 0.8: Ir 0.2) STM 装置の頭の上の適切なフィットを保証する直径を持つ。手動切断または電気化学エッチング、エッチングを実行できます。32
      注: 電気化学的エッチングは対称のヒントを表示します。
    3. STM 装置のヘッドの先端をマウントし、サンプルを接続します。
    4. 「現在の」フィードバック チャネルを設定 (このタイプの測定、現在はフィードバックをチューニングして一定になる)。バイアス電圧と現在のセット ポイントと先端のエンゲージも解決イメージを取得するスキャン サイズを調整します。
      注: イメージの領域の選択は、また圧電スキャナーの動作範囲に依存します。この点では、機器のマニュアルを参照してください。
    5. STM 装置の製造元の独自のソフトウェアを用いた関数の多項式を平準化するには、各スキャン ラインのあてはめによる STM 地形画像処理。
  4. CA の測定。
    1. 1 つの光学系で CA 条件 (初期デンドリマー濃度) 3 つの独立した基板の 3 つの異なる位置に静滴法によるナノパターン基板上メジャー CA。
    2. 脱イオン水で、変らずを入力し、1 μ L の滴を生成する CA ソフトウェアのパラメーターを設定します。
    3. サンプルをステージに配置して、試料の表面には、イメージング用のコンピューターに明確に表示されるようにします。
    4. 表面に近いを取得するまでマニピュレーターに注射器を移動し、表面上にドロップを分配します。液滴の安定化後すぐに画像を記録します。
      注: CA 測定でそれは非常に再現性のある結果を達成するために湿度を制御することが重要です。
    5. CA 装置の製造元の独自のソフトウェアで測定した Ca を分析します。フィッティング法は、ユーザーの要件に調整できます。楕円のフィッティング法は、オプションをすることができます。

5. 細胞培養

注: すべての手順をティッシュ文化フードと滅菌材料のみのソリューションで実行したし、技術が使用されました。

  1. 線維芽細胞の付着実験。
    1. 高グルコース 10% 牛胎児血清 (FBS) を添加した NIH 3T3 マウス胚性線維芽細胞から 37 ° C、4.6% CO2な雰囲気、基礎培地で初期の通路 (< 10) 文化 1 %l-グルタミン、1% 1% とペニシリン-ストレプトマイシン ピルビン酸ナトリウム(成長中)。500,000 細胞成長培地 10 mL のフラスコあたりの総シードに T75 フラスコをお勧めします。
    2. 2 日ごと 10 mL のピペットで古いメディアを削除し、作りたての成長培地 10 mL に置き換えます。
    3. 細胞成長培地までは 80% の合流点、それから媒体の周りに到達し、トリプシン フラスコあたり 5 mL を加えます。確実に、フラスコの底から適切な細胞の剥離を 37 ° C で 5 分間細胞と接触してトリプシン溶液を維持します。
    4. フラスコあたり成長培地 5 mL を追加し、遠心管の細胞を収集します。470 x gで 5 分間削除で細胞培養上清を遠心し、成長培地 10 mL に細胞ペレットを再懸濁します。診断を用いた細胞の濃度を決定します。
    5. よく扱わない組織培養 (非付着性) の板に基板を転送します。
    6. 培地に 4,000 細胞/cm2の密度で基板上に細胞を播くし、37 ° C および 10% の CO2の大気で 4.5 時間それらを孵化させなさい。
  2. MSCs の軟骨誘導。
    1. 初期の通路から人間の MSCs の文化 (< 5) MSC 成長培地で 37 ° C で 4.6% の CO2雰囲気で。500,000 細胞成長培地 10 mL のフラスコあたりの総シードに T75 フラスコをお勧めします。
    2. (前述の 5.1.2) 中 3 日ごとに変更します。
    3. セルを trypsinize 前に 80% の合流点に達すると、遠心分離機し、(前述の 5.1.3) MSC 成長培地でそれらを再懸濁します。診断を用いた細胞の濃度を決定します。
    4. もう一度セルを遠心し、軟骨分化誘導培地 10 mL でそれらを再懸濁します。
    5. 組織培養 (非付着性) のために扱われていない新しいウェル プレートにプレートから基板を転送します。3,000 セル/cm2の密度で基板上に細胞を播きます。
    6. (前述の 5.1.2) 軟骨中 3 日ごとに変更します。

6. 細胞の固定と染色

注: 次の手順は、非滅菌状態で実行できます。

  1. メディアを取り出し、PBS でやさしく洗浄します。室温に 20 分間 10% ホルマリン溶液を追加することによってそれらを修正します。
  2. ホルマリンを削除し、PBS のセルを洗浄します。
  3. PBS で塩化アンモニウム (NH4Cl) の 50 ミリメートルのソリューションを追加することによって無料のアルデヒド グループをブロックします。ルート削除 NH4Cl ソリューションで 20 分のセルを残し、PBS のセルを洗浄します。
    注: プロトコルはここで一時停止することができます。サンプルを PBS で 4 ° C で保存します。
  4. PBS を削除および PBS のセルした洗浄で 10 分ブロッキング液 (PBS で 1% アルブミン) にサポニンの 0.1% 溶液を追加してセルを permeabilize し、サンプルを新しいウェル プレートに転送します。
  5. 室温 1 時間ブロッキング液 (表 3) の一次抗体の溶液で細胞をインキュベートします。一次抗体のソリューションを削除し、PBS のセルを洗浄します。
  6. 室温 1 時間ブロッキング液 (表 3) の二次抗体と細胞をインキュベートします。
    注: は、光を避けるための露出。
  7. 二次抗体溶液を取り外して洗浄セル PBS で乾燥します。
    注: プロトコルはここで一時停止することができます。暗闇の中で 4 ° C で PBS でサンプルを格納します。
  8. 顕微鏡観察のためのサンプル実装: ダイヤモンド チップ カッターを使用して、サンプルに媒体をマウント顕微鏡 1.25 cm x 1.25 cm。 適用 50 μ l に coverslips をカットし、カット coverslips とそれらを優しくカバーします。
  9. サンプルを便利な受信者に転送、観測までアルミ箔と 4 ° C で暗闇の中の店でそれをカバーします。

7. 細胞イメージングとデータ分析

注: 不透明な au (111) および厚い microslide ベース基板、正立型顕微鏡を使用する必要があります。

  1. 線維芽細胞の付着実験。
    1. 落射蛍光顕微鏡の使用は、デジタル カメラと低 (すなわち 10 X) (すなわち 40 倍) の高倍率と目標を装備しました。空気の測定を実行します。
    2. 紫外励起、ヘキスト/DAPI 染色を視覚化する longpass 排出フィルターを使用して対物レンズ 10 倍のステージおよびイメージの細胞核にサンプルを配置します。
    3. イメージ セルの細胞骨格と焦点接着斑 (FAs) 40 × 対物、対応する抗体螢光色素仕様に一致する顕微鏡フィルターを選択します。
    4. FA の定量化、8 ビットのファイルに画像を変換するのに画像処理ソフトを使用します。しきい値を設定することによってバイナリに背景と変換画像を削除します。少なくとも 30 枚サンプルを計算し、計算の 1 μ m2から FAs をご検討ください。
  2. MSCs の軟骨誘導。
    1. デジタル カメラと低い (すなわち10 X) を搭載した垂直落射蛍光顕微鏡と軟骨誘導 (< 5 日) の初期の段階で細胞の凝縮のイメージの倍率の目的。紫外線励起と longpass 排出フィルターを使用して、ヘキスト/DAPI 染色を視覚化します。
    2. 凝縮体の面積を測定するには、画像処理ソフトウェアを使用して、8 ビットのファイルに画像を変換、背景を削除する、集計の輪郭を強調するしきい値を選択します。粒子の面積を計算します。
    3. Fa、細胞骨格アクチン繊維と高倍率 (すなわち 40-60 X) で直立した共焦点顕微鏡を用いた軟骨コラーゲン タイプ II α 1 (COL2A1) の画像 immunostained のサンプル。代表的な間隔 (すなわち0.5-1 μ m) でセクションを収集します。
    4. スタックを処理するには、画像処理ソフトを使用します。8 ビットのファイルに画像を変換、背景を削除、しきい値を設定することによってバイナリようにします。1 つの 3 つの独立したサンプルの条件の 3 つのセル凝縮体の最小値を扱います。
    5. 染色細胞凝縮体の基底部からエリア FA 蛋白質を定量化し、エリアの画像からの細胞核数で割った値の対応するパーセンテージとして表現します。
    6. COL2A1 染色を測定するには、共焦点 z プロジェクションを使用して投影面積 (最大 COL2A1 サンプル面積) の合計を定量化します。対応する凝縮部に対して得られた面積の値を正規化します。

8. 逆写ポリメラーゼ連鎖反応 (qRT PCR) 定量分析

注: RNase の混入を防ぐためには、プラスチックの食器を使い捨て、滅菌を使用し、使い捨て手袋を着用して、試薬と RNA を処理します。常に適切な微生物学的無菌技術を使用して、作業面と遠心分離機やピペットなどの非使い捨てアイテムから RNase の混入を削除する適切な汚染除去ソリューションを使用します。

  1. 総 RNA を隔離し、RNA の撹乱物質でそれを粉砕します。DNase の RNA サンプルを扱うし、cDNA、cDNA 合成キットを使用してに変換します。
  2. QRT PCR を行う転写因子SOX9のプライマーを使用します。Β 2-ミクログロブリン (B2M) とリボソームタンパク質 l 13 a (RPL13a) は、ハウスキーピング遺伝子として使用することができます。
  3. 発現レベルを計算、ネガティブ コントロール (PLLA) に対して正規化します。

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

結果

表面粘着性ナノスケール (図 1) で対処することができるナノパターニング法を提案します。RGD Cys D1 の化学構造を図 1 aに示します。デンドリマー表面高分解能 STM 特性の電気導電性 au (111) 表面に見られます。ソリューション (最大 10-5%w /w) 低デンドリマー濃度は、高濃度 (図 1) で形成された高いパック デンドリマー集計中 (図 1 b) 直径 4-5 nm の孤立したデンドリマーをレンダリングされます。Afm による表面評価 (図 1 D G上段) では、ソリューションの初期デンドリマー濃度の関数として RGD Cys D1 デンドリマーの表面分布を調整できることを明らかにしました。D分

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

ディスカッション

記述されていたプロトコルの開発、中にいくつかの重要な手順を検討してください。最初は、走査プローブ顕微鏡技術によるナノパターン特性を指します。28awd-4 を視覚化するパターンが生成される表面は、周辺にあるデンドリマーの直径以下の粗さの値を持つ必要があります 4-5 nm STM (図 1 b) によって測定されます。また、それは高分解能 STM イメージングの導電性基板、この場合は au (111) に制限されたアカウントに取られるべきです。スピン コーティング後、スライドのコーナーから高分子の解除は、生体適合性の接着剤を使用すれば修正できます。

デンドリマー ナノパターニングです達成するために使用するプロセス制御ナノスケールでローカル細胞接着。に基づいて、自己吸着による表面デンドリマー、このテクニックを必要としない任意の複雑なナノパターニング装置、リソグラフィ手法36,37,このように以前と対照的な説明

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

開示事項

著者が明らかに何もありません。

謝辞

著者は、 d分定量化にオリオール フォント-バッハ、アルバート G. Castaño を認めます。彼らはまた生物医学著者が社内で映像を記録させる (IRB バルセロナ) で研究所の高度なデジタル顕微鏡ユニットを認めます。この作業によって、ネットワーク医学研究センター CIBER ()、スペインに対応しました。CIBER はイニシアチブによって資金を供給 VI 国家 R & D & 私プラン 2008年-2011 Iniciativa Ingenio 2010 Consolider プログラム、CIBER アクション、セルバンテス ・ デ ・ サラッド カルロス III、欧州地域開発基金の支援です。この仕事は、大学や研究部門の革新、大学、ジャナラリター ・ デ ・ カタルーニャの企業のための委員会によってサポートされている (2014 SGR 1442)。それはまたプロジェクト OLIGOCODES (号によって資金を供給されました。MAT2012-38573-C02) と CTQ2013-41339-P、INTERREG V-A スペイン ポルトガル 2014 年 2020 年 POCTEP (0245_IBEROS_1_E) にスペイン経済省、競争力、さらに授与します。C.R.P. は、スペイン経済省と競争力のグラント号からの財政支援を認めています。IFI15/00151)。

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
金 (111) on mica. 1.4x1.1 cm Spi Supplies466PS-AB
ガラスマイクロスライド、プレーンコーニング2947-75x25
脱イオン水ミリポア18MΩ cm
エタノール 96%PanReac131085.1212
L-ラクチド/DL-ラクチド共重合体コルビオン95/05 モル比
1,4 - ジオキサンシグマ-アルドリッチ296309-1L
シリコーンオイル、高温アクロスオーガニックス 174665000
スピナーローレルWS-650MZ-23NPP/Lite
組織培養層流フードTelstarBio II AdvanceClass II 生物学的安全キャビネット
フィルターユニットMillex-GPSLGP033RB0.22 & マイクロ;m
シリンジ 10 mL廃棄309110
原子間力顕微鏡Veeco InstrumentsDimension 3000 AFM 機器
シリコン AFM プローブバジェット センサーTap300AI-G共振周波数 300 kHz、k = 40 N/m
走査型トンネル顕微鏡分子イメージングPicoSPM 顕微鏡
Pt0.8:Ir0.2 ワイヤーAdventPT671012直径0.25mm
WSxM 4.0ソフトウェアNanotec electronica
光接触角(CA)システムDataphysics
SCA20ソフトウェアDataphysics
X線光電子分光器フィジカルエレクトロニクスPerkin-Elmer PHI 5500 Multitechniqueシステム
ウシ血漿からのフィブロネクチンSigma-AldrichF1141-1MG1.0 mL 溶液
ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水 (DPBS)Gibco21600-10粉末
マウス胚線維芽細胞ATCCATCC CRL-1658NIH/3T3
ダルベッコ修正イーグル培地 (DMEM) 液体高グルコースGibco11960044液体高グルコース、グルタミンなし、500 mL
ウシ胎児血清 (FBS)Gibco16000044500 mL
L-GlutamineInvitrogen25030200 mM (100X)
ペニシリン-ストレプトマイシンInvitrogen15140
ピルビン酸ナトリウムInvitrogen11360039100 mL
T75 培養フラスコNunclon156499
Trypsin LifeTechnologies252000720.25% EDTA
遠心分離機Hermle LabortechnikZ 206 非
組織培養処理プレート、12ウェルファルコン351143非接着性
脂肪由来hMSCATCCATCC PCS-500-011セルバイアル 1mL
MSC基礎培地ATCCATCC PCS-500-030
MSC成長キットATCCATCC PCS-500-040低血清
軟骨細胞分化ツールATCCATCC PCS-500-051
マリン溶液Sigma-AldrichHT5011-15ML中性緩衝、10%
塩化アンモニウムSigma-AldrichA9434-500G分子生物学用、細胞培養に適しています≥99.5%
サポニンSigma-Aldrich47036-50G-F分子生物学用、非イオン性界面活性剤として使用、アジュバント
ウシ血清アルブミン (BSA)Sigma-AldrichA3059-50G
ウサギモノクローナル [Y113] 抗パキシリン抗体Abcamab32084希釈 1:200
マウスモノクローナル [1F5] 抗コラーゲンα-1 XX鎖 Acris 抗体AM00212PU-N希釈: 1:400
Alexa Fluor 488-conjugated goat anti-mouse IgG (H+L) secondary antibodyInvitrogenA106672 mg/mL.希釈した 1:1000
Alexa Fluor 568-conjugated goat anti-rabbit IgG (H+L) secondary antibodyInvitrogenA110362 mg/mL。希釈 1:1000
Hoechst 33342Thermo FisherH3570 10ML10 mg/mL。希釈 1:1000
カバーガラス 24x24 mmDeltalabD102424
フルオロマウントSigma-AldrichF4680-25ML
落射蛍光顕微鏡NikonEclipse E1000 CCDカメラ付き
共焦点顕微鏡ライカマイクロシステムズライカ SPE 正立共焦点顕微鏡
ImageJ 1.50g フリーウェア
MATLABソフトウェアThe MATHWORKS, Inc.
OriginPro 8.5ソフトウェア OriginLab株式会社
ホル正立顕微鏡http://imgej.nih.gov/ij

参考文献

  1. Jiang, F., Hörber, H., Howard, J., Müller, D. J. Assembly of collagen into microribbons: Effects of pH and electrolytes. J. Struct. Biol. 148 (3), 268-278 (2004).
  2. Smith, M. L., et al. Force-induced unfolding of fibronectin in the extracellular matrix of living cells. PLoS Biol. 5 (10), 2243-2254 (2007).
  3. Little, W. C., Smith, M. L., Ebneter, U., Vogel, V. Assay to mechanically tune and optically probe fibrillar fibronectin conformations from fully relaxed to breakage. Matrix Biol. 27 (5), 451-461 (2008).
  4. Christman, K. L., Enriquez-Rios, V. D., Maynard, H. D. Nanopatterning proteins and peptides. Soft Matter. 2, 928-939 (2006).
  5. Falconnet, D., Csucs, G., Grandin, H. M., Textor, M. Surface engineering approaches to micropattern surfaces for cell-based assays. Biomaterials. 27 (16), 3044-3063 (2006).
  6. Arnold, M., et al. Activation of integrin function by nanopatterned adhesive interfaces. ChemPhysChem. 5 (3), 383-388 (2004).
  7. Cavalcanti-Adam, E. A., et al. Lateral spacing of integrin ligands influences cell spreading and focal adhesion assembly. Eur. J. Cell. Biol. 85 (3-4), 219-224 (2006).
  8. Cavalcanti-Adam, E. A., et al. Cell spreading and focal adhesion dynamics are regulated by spacing of integrin ligands. Biophys. J. 92 (8), 2964-2974 (2007).
  9. Arnold, M., et al. Cell interactions with hierarchically structured nano-patterned adhesive surfaces. Soft Matter. 5 (1), 72-77 (2009).
  10. Malmström, J., et al. Large area protein patterning reveals nanoscale control of focal adhesion development. Nano Lett. 10 (2), 686-694 (2010).
  11. Deeg, J. A., et al. Impact of local versus global ligand density on cellular adhesion. Nano Lett. 11 (4), 1469-1476 (2011).
  12. Medda, R., et al. Investigation of early cell–surface interactions of human mesenchymal stem cells on nanopatterned β-type titanium-niobium alloy surfaces. Interface Focus. 4, 20130046(2014).
  13. Wang, X., et al. Effect of RGD nanospacing on differentiation of stem cells. Biomaterials. 34 (12), 2865-2874 (2013).
  14. Wang, X., Ye, K., Li, Z. H., Yan, C., Ding, J. D. Adhesion, proliferation, and differentiation of mesenchymal stem cells on RGD nanopatterns of varied nanospacings. Organogenesis. 9 (4), 280-286 (2013).
  15. Wang, X., Li, S. Y., Yan, C., Liu, P., Ding, J. D. Fabrication of RGD micro/nanopattern and corresponding study of stem cell differentiation. Nano Lett. 15 (3), 1457-1467 (2015).
  16. Li, Z. H., et al. Effects of RGD nanospacing on chondrogenic differentiation of mesenchymal stem cells. J. Mater. Chem. B. 3 (12), 5197-5209 (2015).
  17. Stephanopoulos, N., et al. Bioactive DNA-peptide nanotubes enhance the differentiation of neural stem cells into neurons. Nano Lett. 15 (1), 603-609 (2015).
  18. Rolland, O., Turrin, C. O., Caminade, A. M., Majoral, J. P. Dendrimers and nanomedicine: Multivalency in action. New J. Chem. 33, 1809-1824 (2009).
  19. Saovapakhiran, A., D’Emanuele, A., Attwood, D., Penny, J. Surface modification of PAMAM dendrimers modulates the mechanism of cellular internalization. Bioconjug. Chem. 20 (4), 693-701 (2009).
  20. Albertazzi, L., Fernandez-Villamarin, M., Riguera, R., Fernandez-Megia, E. Peripheral functionalization of dendrimers regulates internalization and intracellular trafficking in living cells. Bioconjug. Chem. 23 (5), 1059-1068 (2012).
  21. Mikhail, A. S., Jones, K. S., Sheardown, H. Dendrimer grafted cell adhesion peptide-modified PDMS. Biotechnol. Prog. 24 (4), 938-944 (2008).
  22. Kino-oka, M., Kim, J., Kurisaka, K., Kim, M. H. Preferential growth of skeletal myoblasts and fibroblasts in co-culture on a dendrimer-immobilized surface. J. Biosci. Bioeng. 115 (1), 96(2013).
  23. Kim, M. H., et al. Morphological regulation and aggregate formation of rabbit chondrocytes on dendrimer immobilized surfaces with D-glucose display. J. Biosci. Bioeng. 107 (2), 196-205 (2009).
  24. Lomba, M., et al. Cell adhesion on surface patterns generated by the photocrosslinking of hyperbranched polyesters with a trisdiazonium salt. React. Funct. Polym. 73 (3), 499-507 (2013).
  25. Maheshwari, G., Brown, G., Lauffenburger, D. A., Wells, A., Griffith, L. G. Cell adhesion and motility depend on nanoscale RGD clustering. J. Cell Sci. 113 (Pt 10), 1677-1686 (2000).
  26. Kim, M. H., Kino-oka, M., Kawase, M., Yagi, K., Taya, M. Synergistic effect of D-glucose and epidermal growth factor display on dynamic behaviors of human epithelial cells. J. Biosci. Bioeng. 104 (5), 428-431 (2007).
  27. Pericet-Camara, R., Cahill, B. P., Papastavrou, G., Borkovec, M. Nano-patterning of solid substrates by adsorbed dendrimers. Chem. Commun. 3, 266-268 (2007).
  28. Lagunas, A., et al. Large-scale dendrimer-based uneven nanopatterns for the study of local arginine–glycine–aspartic acid (RGD) density effects on cell adhesion. Nano Res. 7 (3), 399-409 (2014).
  29. Lagunas, A., et al. Tailoring RGD local surface density at the nanoscale toward adult stem cell chondrogenic commitment. Nano Res. , (2017).
  30. Prats-Alfonso, E., et al. Effective and Versatile Strategy for the Total Solid-Phase Synthesis of Alkanethiols for Biological Applications. Eur. J. Org. Chem. 2013 (7), 1233-1239 (2013).
  31. Zhu, Y. B., Gao, C. Y., Liu, X. Y., He, T., Shen, J. C. Immobilization of biomacromolecules onto aminolyzed poly(L-lactic acid) toward acceleration of endothelium regeneration. Tissue Eng. 10 (1-2), 53-61 (2004).
  32. Güell, A., Díez-Pérez, I., Gorostiza, P., Sanz, F. Preparation of reliable probes for electrochemical tunneling spectroscopy. Anal. Chem. 76 (17), 5218-5222 (2004).
  33. Bobick, B. E., Chen, F. H., Le, A. M., Tuan, R. S. Regulation of the chondrogenic phenotype in culture. Birth Defects Res. C Embryo Today. 87 (4), 351-371 (2009).
  34. De Lise, A. M., Fisher, L., Tuan, R. S. Cellular interactions and signaling in cartilage development. Osteoarthritis Cartilage. 8 (5), 309-334 (2000).
  35. Kosher, R. A., Kulyk, W. M., Gay, S. W. Collagen gene expression during limb cartilage differentiation. J. Cell Biol. 102 (4), 1151-1156 (1986).
  36. Biebricher, A., Paul, A., Tinnefeld, P., Golzhauser, A., Sauer, M. Controlled three-dimensional immobilization of biomolecules on chemically patterned surfaces. J. Biotechnol. 112 (1-2), 97-107 (2004).
  37. Tinazli, A., Piehler, J., Beuttler, M., Guckenberger, R., Tampé, R. Native protein nanolithography that can write, read and erase. Nat. Nanotechnol. 2, 220-225 (2007).
  38. Oberhansl, S., et al. Facile Modification of Silica Substrates Provides a Platform for Direct-Writing Surface Click Chemistry. Small. 8 (4), 541-545 (2012).

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

再版と許可

タグ

RGD X II 1
ローカル制御表面密着性にデンドリマーを用いた不均一な Nanopatterns: 軟骨細胞分化を指示する方法
お問い合わせ
図書館への推薦

プライバシー

利用規約

ポリシー

著作権 © 2026 MyJoVE Corporation. 無断転載を禁じます。