方法論記事

関連付けられているウイルスおよび細胞タンパク質の同定のウイルス DNA の精製

13.2K 閲覧数

⸱

DOI：

10.3791/56374

⸱

2017年8月31日

 , 
1Department of Microbiology and Molecular Genetics, University of Pittsburgh School of Medicine

この記事について

サマリー

このプロトコルの目標は、具体的にはタグし、関連付けられているウイルスのゲノムのタンパク質のキャラクタリゼーションのため感染細胞からウイルス DNA を選択的に分離することです。

要約

このプロトコルの目標は感染した細胞の同定 (HSV-1) DNA 関連ウイルス単純ヘルペス ウイルス 1 型を分離する、細胞タンパク質質量分析法。ウイルスのゲノムと相互作用するタンパク質を担う感染症の結果を決定する上で主要な役割が、関連付けられているウイルスのゲノムのタンパク質の網羅的解析は以前は不可能だった。ここで我々 は、感染細胞からの HSV-1 ゲノムの直接浄化を可能にするメソッドを示します。ウイルス DNA を複製する選択的にアルキン官能を含む修正されたヌクレオチドにラベル付けされています。標識 DNA、特に不可逆的なタグ、ビオチン アジ化銅 (I) 経由での共有添付ファイルを介して-アジ化物アルキンの環化付加反応やクリックの反応を触媒。ストレプトアビジン コーティング ビーズにビオチン標識 DNA が浄化され、関連付けられているタンパク質の溶出し質量分析によって識別されます。このメソッドには、選択的ターゲティングと HSV 1 複製フォークまたは複雑な生物的環境から全体のゲノムの分離ができます。さらに、このアプローチの適応は他の DNA ウイルスのゲノムの検査と同様に、ウイルス感染症の様々 な側面の調査のためになります。

概要

ウイルスは、重要な機能を遂行し、したがって感染症ウイルス遺伝子発現、レプリケーション、修理、再結合、輸送などの重要な側面を促進する宿主因子に依存する限られた能力を持っています。これらの宿主因子の活動がエンコードされたウイルス蛋白質によって補強されること。さらに、ウイルスはウイルス感染に対する細胞応答の検出と干渉を避ける必要があります。したがって、ウイルス ホスト相互作用は、感染症の結果を左右します。最も重要のウイルスがウイルスのプロセスを容易にする細胞の機械に合わせて携帯電話の環境を変更する方法を理解されています。特別な関心の感染サイクルを通してウイルスのゲノムに関する法律のどの要因とプロセスで識別します。

単純ヘルペス ウイルス タイプ 1 (HSV-1) は、二本鎖 DNA ウイルスは人間の人口のかなりの割合が感染します。感染の最初の 1 時間内でウイルスのゲノムはウイルスの遺伝子発現の順序付けされたカスケードがウイルス DNA (vDNA) レプリケーション1との連携ですさまじい核を入力します。核のゲノムはエピジェネティック制御は予告、修復と組換えを受けるし、6 時間未満内最初の子孫ウイルス粒子を生産するように、カプシドに包まれます。感染症のコース全体を通じて関連付けられているウイルスのゲノム蛋白質の包括的な評価、ウイルス ゲノムに関する法律、どのウイルスおよび細胞の要因を理解するためのプロセスの分子の詳細を調べるに土台を築く感染症のさまざまな段階に関与しています。

ウイルス感染に関与する宿主因子の調査のための以前の方法は、関連する細胞蛋白質2,3,4、5の分析のためのウイルス蛋白質の親和性の浄化,6,7,8,9. これらの試金は抗ウイルスのホストの応答としてウイルス性クロマチンの修飾、遺伝子発現に関与する細胞因子の同定のため尽力されているし、DNA 修復します。ただし、vDNA との関連付けに依存する相互作用プロテオミクスのみ特定ウイルス因子の関数として発生する相互作用への洞察力を提供するかどうかを確認することは困難です。クロマチン免疫沈降 (チップ) は、特定のウイルスおよび細胞の蛋白質がウイルスのゲノム10、11,12,13,14にバインドを識別するために使用されています,15と蛍光そのままの交配 (魚) 併用免疫細胞化学は vDNA16,17,18,と colocalize の細胞の要因の可視化が有効になっています。19,20します。 これらの試時空間解析を可能にします。ただし、制限は、特異性の高い抗体、限られた感度とウイルスの宿主に以前の洞察力のための必要性の必要性を含めます。そこで iPOND (初期の DNA に蛋白質の分離)21に基づく方法と感染ウイルスのゲノムの公平な識別のため細胞の選択的にラベルを付けから vDNA を浄化する aniPOND (加速ネイティブ iPOND)22質量分析法によるタンパク質関連。iPOND は、細胞複製フォーク力学の調査のために尽力されています。

感染細胞からのウイルスのゲノムの選択的浄化、5-エチニル-2´-デオキシウリジン (EdU) または 5-エチニル-2´-デオキシシチジン (EdC) (図 1)、共有結合に続いて変更エチニル ヌクレオシドとラベルは vDNA を複製します。経由でビオチン アジ化する共役は、ウイルス ゲノムおよびストレプトアビジン コーティング ビーズ (図 2 b) に関連付けられているタンパク質の 1 つのステップ精製を容易にするために化学をクリックします。重要なは、感染症は、vDNA の特殊にラベリングを有効にする細胞の DNA 複製に従事しない定置型電池で実行されます。さらに、HSV-1 感染により、細胞周期の停止と細胞の DNA 複製23,24を抑制します。ウイルスを受信ウイルス ゲノム (図 1 a) に関連付けられている蛋白質の分析のための感染前に prelabeled または新たに合成された vDNA (図 1 b) に関連付けられている蛋白質の分析のための DNA 複製時にラベルすることができます。25します。 さらに、パルス チェイス分析はウイルス複製フォーク (図 1)26に関連付けられているタンパク質の性質を調査する使用できます。また、エチニル変更 vDNA は、空間におけるタンパク質ダイナミクス (図 2 aおよび図 3) の蛍光体にした共役系します。イメージングは、vDNA の直接可視化は、vDNA 蛋白質の相互作用を検証するための無料のアプローチで、感染でウイルスのゲノムをトラックに適応することができます。ヤマメ感染、遅延、再活性化などのあらゆる側面を研究し、他の DNA ウイルスを研究、これらのアプローチがさらに変更することができると期待しています。また、5 エチニル ウリジンとラベリング (EU) により、RNA のウイルスのゲノムの分析のため。

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

プロトコル

1。 細胞培養、ウイルス感染および EdC ラベリング ( 図 1)

次のプロトコル ウイルスの作業が含まれます。あなたの機関を参照してください ' ウイルスやその他の生物学的製剤の安全な取り扱いに関する s バイオ安全プロトコル。このプロトコルは、ピッツバーグ大学の制度上の審査委員会によって承認されました

。
  1. Trypsinize MRC 5 セルの合流 150 cm 2 培養フラスコ、100 mL DMEM プラス 10% を含む 600 cm 2 組織培養プレートにセルを転送 FBS。合流と静止した段階に到達する 3-4 日間 5% CO 2 の存在下で 37 ° C で孵化させなさい。合流 600 cm 2 皿には、7 ~ 10 の 7 セル x が含まれています。条件ごとに 1 プレートと各対応する否定的な制御のための 1 のプレートを準備します
    。 注: 電池がその唯一の vDNA ラベル付けされて後続のステップで精製できるように細胞の DNA 複製を阻害する静止した段階に達する必要があります
    。 注: 各サンプルが必要です無料同じ感染条件と EdC 添加せず時間ポイントを使用したネガティブ コントロールをラベルします
    。 注: スケール ダウン バージョンのこの実験は行われるべきに匹敵する増殖、感染症の分類の条件、EdC を用いたイメージングによる細胞 DNA の分類のためのテスト時間ポイント (手順 2 を参照).
  2. 希釈 7 × 10 8 7 mL PFU HSV 1 冷 Tris-Buffered 生理食塩水 (TBS)。成長培地を取り除き、37 ° C で保存感染 MRC 5 セルに 7 mL 希釈ウイルスを追加し、室温で 1 時間ロックします。吸着、次接種を取り外し、50 mL 室温 TBS、すすぎおよび元の成長培地を交換します。5% CO 2 の存在下で 37 ° C で孵化させなさい。この手順を各実験条件と負のコントロールの実施必要があります
    。 注: 増加 EdC のラベリングを実現できますウイルス dUTPase (UL50 遺伝子) および/またはウラシル グリコシラーゼ (UL2 遺伝子) 発現の HSV-1 欠損変異株を用いたします。HSV-1 dUTPase、低い基質特異性がありいくつかヌクレオシド類似体 25 , 27 の活性化を減らすことができます
    3. 。 EdC と
  3. ラベルのウイルスのゲノム。着信ゲノム (1.3.1) ゲノム (1.3.2)、またはウイルスの複製フォーク (1.3.3) 複製のラベルに指示に従ってください
    。 注: 唯一のステップ 1.3.1、1.3.2、または 1.3.3 実施されなければならない受信ゲノム、レプリケートされたゲノムまたは複製フォークがそれぞれ以降の手順で分析するかどうかに応じてします
    。 注: エドゥや f ara エドゥは、EdC の代わりできます。ヌクレオシド類縁体の毒性を監視され、最小化する必要があります。
    1. 使用 prelabeled ステップ 1.2 で感染を行い、ステップ 2 に進んでくださいする株式または 4 h 以内 3 投稿レプリケートされていない vDNA ( 図 1 a) を調査する感染 (hpi).
      注: は、prelabeled ウイルス 25 上記プロトコルを使用して株式を準備します。ウイルス株は、任意の残留 EdC を削除する G-25 列を介して渡す必要があります
      2. 。
    2. ラベル 5 〜 25 μ M を追加しての複製 vDNA 2 4 時間 ( 図 1 b) 感染細胞の細胞培養液に EdC。追加すると、前に成長培地 1 mL で EdC を希薄化します
      3. 。 VDNA レプリケーションの発症後ウイルスの複製フォークのラベルに
    3. (≥ 4 hpi)、パルス ラベル 5-25 μ m vDNA を複製する EdC 5 ~ 20 分。追いかける、追いかける培 25 100 μ M 2´deoxycytidine で 3 x をすすいでください (deoxyC)、さらに 20-40 分 ( 図 1) チェイス媒体の存在下でインキュベーションしてと。
      。 注: パルスとチェイスの媒体は使用前に CO 2 を 37 ° C、5% に平衡する必要があります
      。 注: パルス追跡する実験、それはセルを入力し、彼らは複製 DNA に組み込まれることができる前にリン酸化されるヌクレオシドにかかる時間の量を考慮することが重要。これは経験的に定められる必要があります
      。 注: パルス追跡する実験の解像度を調べるには、使用される実験条件下でウイルスの複製率を計算します。これは一歩成長時間コース 26 中にウイルスのゲノムの量的な PCR によって決定できる
      。 注: ウイルスのゲノムのイメージングのためステップ 2 に進み、ウイルス ゲノムの浄化のためには、ステップ 3 に進みます
      4. 。

2。EdC のイメージング標識 DNA ( 図 2 a)

注: 細胞 DNA が実験でラベルはありませんを確認するウイルスのゲノムの精製法とタンデムでイメージングを実行すると便利です。画像は、ラベル付き vDNA の性質を視覚化し、プロテオミクス データを検証にも使えます。細胞やウイルスの DNA が染色パターンの例として、 図 3 に示す.

  1. 感染を行い成長培地 1 mL を含む 12 ウェル培養皿に coverslips に条件 EdC ラベル以外を使用して手順 1 で示されているように縮小します
    2. 。 室温 15 分 1 × PBS の
  2. 修正セル 1 mL 3.7% パラホルムアルデヒド固定後、リンス細胞 2 倍の PBS で 1 mL 3 %bsa で
    。 注意: パラホルムアルデヒドは深刻なまたは永続的な損傷を引き起こすことができます。安全上の注意に従ってください
    。 注: プロトコルをここで一時停止できるし、coverslips 第 2 洗浄の 4 ° C で保存できる 3 日間
    3. 。
  3. 1 mL 透過バッファーとセルを permeabilize [材料表 を見る] ロッキングしながら室温で 20 分間です
    4. 。
  4. 揺動中 3 %bsa をし、室温で 30 分間 PBS で 1 mL 3 %bsa を用いたブロック 1 mL でリンスします
    5. 。
  5. クリック反応カクテルの 1 つの mL を追加 [材料表 を見る] 共有 Alexa Fluor 488 を共役に coverslips に edc のアジ化が分類される DNA。揺動中 30 分間室温でインキュベートします。吸引、1 mL の PBS で 2 回すすいでください
    6. 。
  6. 1 ml の揺動中室温で 30 分間 PBS のヘキストの 1:2,000 の希釈の細胞 DNA を染色します。吸引、1 mL の PBS で 2 回すすいでください
    7. 。
  7. 染色標準に従って第一次および二次抗体と間接蛍光抗体法 25 のプロトコルします
    。 注: ラベル付き vDNA colocalizes ICP8、ICP4、または UL42 と細胞標識 DNA colocalizes ヘキスト染色
    8. 。
  8. スライド coverslips をマウントし、イメージの蛍光顕微鏡を用いた細胞
    。 注: スライド格納できる 4 ° C で数週間
    9. 。

3。VDNA と関連タンパク質の精製

注: このプロトコルのいくつかの側面は、レオン ら から適応されています。 22
注: すべてのバッファーおよび試薬を使用する前に氷の上冷蔵する必要があり、すべてのステップべきである氷の上特に明記しない限り

。
  1. 核を収穫します
    。 注: 前の核の隔離、に、ホルムアルデヒドは DNA に架橋蛋白質に使用できます。厳しい洗浄条件は、ストレプトアビジンをコートしたビーズで DNA 精製時に使用できます。Crosslinking、洗浄条件を参照してください Sirbu et al. 21.
    1. 20 ml の核抽出バッファー (NEB) 成長培地を交換し、時折ロッキング 4 ° C で 20 分間インキュベートします。核が顕微鏡で見えるようになります
      2. 。
    2. 細胞スクレーパーを使用してプレートから核をこすりし、50 mL の円錐管に転送します。核をペレット、上澄みを廃棄に 4 ° C で 2,500 x g で 10 分間遠心します
      。 注: トリパン ブルー染色は細胞から核の分離を確認する使用できます
      3. 。
    3. そっと 10 mL の PBS、15 mL の円錐管に転送に核ペレットを取り除くし、4 ° c. 完全に削除 PBS で 2,500 x g で 10 分間遠心分離によってペレットします
      。 注: 核を凍結することができます、プロトコルをこの時点で一時停止することができます。これを行うには、穏やかで再懸濁します核ペレット 500 μ L 凍結バッファーし、エタノール/ドライ氷浴でチューブを孵化させなさい。-80 ° C で凍結核を格納します。使用前に室温で核を解凍、氷、10 mL の PBS、ミックス、4 ° C で 2,500 x g で 10 分間の遠心分離でペレットに優しくロックを追加にすばやく転送、PBS を完全に削除します。低収量があります核凍結します
      4. 。
  2. EdC に共役したビオチン アジ ラベル vDNA。
    1. 10 mL クリック反応における核ペレット ミックス [材料表 を見る] 上下に軽くピペッティングして 5 回 10 mL のピペットを使い、再懸濁します
      。 注: クリック反応混合物に含まれる試薬が指定された順序で追加されていることが重要です
      2. 。 4 ° C で 1 時間の
    2. を回転させる回転しながら準備し、バッファーの B1、B2、および B3 [材料表 を見る] を寒さ
      3. 。
    3. ペレット 4 ° c. 完全に削除で 2,500 x g で 10 分間遠心分離核反作用の組合せをクリックし、優しく 4 で 2,500 x g で 10 分間遠心分離 10 mL の PBS に再してペレットを洗浄 ° C
    4. には、1 mL の PBS に核ペレットと大口径のピペット チップを使用して 1.5 mL および microfuge の管への転送軽く再懸濁します。2,500 x 4 ° c. 完全に削除 PBS で g と液体窒素で凍結で 10 分間遠心分離によって核をペレットします
      。 注:、プロトコルがこの時点で一時停止にできる、核は、同じ日にステップ 3.3 に赴く際にも冷凍フラッシュする勧めしますので、後続の換散を-80 ° C 凍結融解で凍結核を格納できます
      5. 。
  3. 核を溶解し、DNA のフラグメントします。
    1. は、氷の上の核を解凍し、500 μ L ではバッファー B1 上下ピペッティングによって再懸濁します。45 分の氷の上を孵化
    2. Sonicate サンプル 6 回の 30 s 各 3 mm マイクロ探針プローブを用いた 40% 振幅で。30 の氷のサンプルを場所パルス間 s。明確な曇りない超音波処理、サンプルが表示されます
      。 注: 超音波照射条件は、個々 の sonicators を最適化する必要があります。超音波照射条件を最適化する方法の詳細についてレオン ら を参照してください。 22.
    3. 4 ° C で 10 分間 14,000 × g で遠心分離によって細胞の残骸をペレットペレットのサイズが大幅に減少します。100 μ M の細胞のストレーナーで上清をフィルターし、流れを保持します
      4. 。
    4. 追加 500 μ L 3.4.2 の手順でこのサンプルのフィルター処理された上澄み 900 μ l にバッファー B2 を使用されます。
      5. 。
    5. DNA の隔離 (50 μ L または 1/20 ボリューム) の各条件の因数を取るし、x SDS 重曹液 50 μ l 添加 2 [材料の表 を参照してください]。DNA の隔離のプロトコル (手順 3.6) に進みます
      6. 。
    6. 入力蛋白質 (50 μ L または 1/20 ボリューム) の各条件の因数を取ると 50 μ L 2 x 塩化物イオン サンプルバッファーを追加、液体窒素で凍結、-80 デパート ° C. 3.5.6 の手順で使用します
      7. 。
  4. バインド ビオチン化 DNA にストレプトアビジン コーティング ビーズ。
    1. ビーズ スラリーの 300 μ L を 1.5 mL および microfuge の管に転送することによって磁気ビーズをストレプトアビジン T1 の準備します。サンプルあたりのビーズの 1 つの管を準備します。洗うビーズ 1 ml バッファー B2 に再懸濁しますボルテックス、ビーズを分離する磁石を適用し、吸引洗浄バッファーで 3 x.
      注: は、最大収量と最小限の背景結合条件結果のバインドを最適化されています。ストレプトアビジン T1 磁気ビーズが大きく結合能と他のストレプトアビジン ビーズと同様、アガロース ビーズより背景結合ストレプトアビジン C1 ビーズよりも小さいであることが決定された実験的 ( 図 4 a).
    2. ステップ 3.3.4 からサンプルの追加 900 μ L. ビーズを洗浄し、回転の 4 泊 ° C
      注: それらに追加するサンプルにない渦ビーズをしないでください
      。 注: 大量の DNA やタンパク質を分離するラベルのない否定的な制御で、このステップ減らすことができます一晩から背景の結合を減らすために 4 h にします
      3. 。
  5. ビーズを洗浄し、vDNA と関連するタンパク質を溶出します
    。 注: 残りの手順にフィルターのヒントを使用することをお勧めします。
    1. 磁気および microfuge の管ラック、削除上清に場所サンプルは優しく 1 mL バッファー B2、4 ° C で回転 5 分で再懸濁します
    2. 手順を繰り返します 3.5.1 3 回
      3. 。
    3. 磁気および microfuge の管ラックにサンプルを置き、上清を除去、優しく 1 mL バッファー B3 で再懸濁します、4 ° C、5 分で回転
    4. 転送 100 μ L ビーズ混合 (1/10 th 容積) バインドされた DNA の隔離のための新しい管へ。マグネットにこのチューブを適用、上清を除去、100 μ L 1 x SDS 重曹液でビーズを再懸濁します、DNA の隔離のプロトコル (手順 3.6) に進みます
      5. 。
    5. ステップ 3.5.3 から残り 900 μ L ビーズの混合物を含んでいる管を適用、磁石に培養上清を削除し、50 μ l 2 x 蛋白質および DNA 蛋白質の複合体を溶出する塩化物イオン サンプル バッファーでビーズを再懸濁します。
      6. 。
    6. 15 95 ° C で沸騰サンプル分、渦、すぐに、および microfuge のスピンし、磁石を適用します。溶出液を新しいチューブ、フラッシュ凍結し-80 で店に転送 ° C
      注意: 沸騰中オープンされているチューブがポップしないように使用キャップ ロックします
      。 注: プロトコルをこの時点で一時停止できるし、サンプルは数週間-80 ° C で保存できます
      7. 。
    7. ブルー染色、西部のしみが付くこと、または標準的な手順 25 質量分析による蛋白質のサンプルを分析します。代表的な結果を 図 4 および 図 5 に示します
      。 注意: 蛋白質収量が質量分析法のために十分であるかどうか、各サンプルの 7.5 μ L が使用する分析用ブルー染色および代表的なウイルスのゲノムのウェスタンブロッティング用 7.5 μ L 関連蛋白質 (ICP4、ICP8、または UL42)。3.3.6 のステップからの lysates の同じボリューム。入力蛋白質のレベルのコントロールと一緒にを実行されます。質量 (35 μ L) の残りのサンプルが分析され、 25 を前述のように分析します
      8. 。
  6. DNA の隔離
    1. 3.3.5 の手順からサンプルをインキュベートしますと 3.5.4。 必要に応じて磁気ビーズからサンプル 4-16 h. 削除 65 ° C で。
      2. 。
    2. 150 μ L フェノール: クロロホルム: イソアミル アルコール (PCI) のサンプルを抽出し、新しい管に水相を転送します
      3. 。
    3. 100 μ L で残りの PCI を抽出トリス EDTA (TE) し、新しい管に水相を追加
      4. 。
    4. 200 μ L クロロホルム: イソアミル アルコール (24:1) とサンプルを抽出します
      5. 。
    5. 浄化水性相は、メーカーによると PCR 精製キットを使用して ' s プロトコル
      。 注: バッファー PB で pH 指示薬はサンプルに追加されたときに紫色になります。10 ・ # を追加します。181;L 3 M NaOAc pH 5.0 のサンプルの pH が低下する
      6. 。
    6. を決定する DNA 濃度を蛍光光度計を使用しています
      。 注: このプロトコルは通常、100-400 ng ビード区切 DNA を生みます。手順 1.3 EdC の追加がされませんでしたネガティブ コントロールの溶出 DNA は検出されませんする必要があります
      7. 。
    7. 低 DNA 結合に DNA を格納できる 4 または - 20 ° C のチューブし、リアルタイム PCR または高スループット シーケンス解析に使用できます
      8. 。

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

結果

クリックケミストリーのセルからの DNA の精製用は iPOND 法21によって初めて達成されました。IPOND の目的は、関連付けられているタンパク質の同定のため細胞複製フォークを浄化することです。我々 は、特に感染時 vDNA 蛋白質の相互作用の研究にこの手法を適応しています。選択分離そして vDNA の個別集団の調査のため同期感染症と組み合わせる EdC (図 1) とウイルスのゲノムのラベルへのアプローチの操作ができました。HSV 1 DNA にはイメージング用蛍光やビオチン (図 2) の浄化のために共有添付ファイルを容易にする EdC (図 1) が付いています。ウイルスを受信ゲノム (図 1 a) に関連付けられている蛋白質の分析のための感染症の前に prelabeled ま...

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

ディスカッション

このプロトコルには、慎重に、従わない場合に大幅に削減蛋白質収量または細胞の DNA の混入を引き起こすことがある複数の手順が含まれています。定置型電池を使用すべての実験細胞の DNA はないラベル、精製したことを確認することが重要です。これは、HSV-1 はゲノム合成細胞の DNA ポリメラーゼを利用しないので蛋白質のサンプルの細胞の DNA ポリメラーゼの不在によって確認できます。EdC のラベリングと核収穫の手順は、サンプルを交互それぞれが均等に処理されるようにします。精製工程中に核をあまりピペッティング操作に注意をすべき。これはピペット先端の両側に付着のためのサンプルの損失と同様、核の早期溶解する可能性があります。さらに、超音波処理の手順は、個々 の sonicators の最適化必要があり、ストレプトアビジン コートしたビーズとビオチン バインディングに使用量は、最適な蛋白質収量の滴定する必要があります。

いくつかの変更はこのプロトコルにして異なるウイルスや細胞の種類の使用や DNA に架橋タンパク質へのステップの追加と。プロテオーム研究に使用するセルの種類を選択すると、そ...

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

開示事項

著者が明らかに何もありません。

謝辞

我々 は、この原稿の準備で助けをハンナ フォックスを認めます。この作品は、NIH によって支えられた R01AI030612 を付与します。

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
MRC-5 細胞ATCCCCL-171
ウシ胎児血清 (FBS)Gibco26140-179
ダルベッコ改変イーグル培地 (DMEM)Gibco12800-08210% FBS, 2 mM L-グルタミン, 12 mM (フラスコでの増殖用)または30 mM(ディッシュでの増殖用) 重カルビン酸ナトリウム
600 cm2 組織培養ディッシュサーモフィッシャーサイエンティフィック166508
トリス緩衝生理食塩水 (TBS)、pH 7.4137 mM NaCl、5 mM KCl、491 mM MgCl、680 mM CaCl、25.1 mM トリシン
HSV-1 ストック力価が 1x109 PFU/mL を超えるストックが最適です
セファデックス G-25 カラム (PD-10 脱塩カラム)GE Healthcare17085101
ジメチルスルホキシド (DMSO)Fisher ScientificD128-1
5´-Ethynyl-2´-deoxycytidine (EdC)Sigma-AldrichT511307DMSO に溶解して 40 mM ストックを調製し、分注し、-20 °C で保存します。C 
2´-デオキシシチジン(deoxyC)Sigma-AldrichD3897水に溶かして40 mMストックを調製し、アリコートし、-20°Cで保存します。C 
核抽出バッファー(NEB)新鮮な(20 mM Hepes pH 7.2、50 mM NaCl、3 mM MgCl2、300 mMショ糖、0.5%イゲパル)
セルスクレーパーBellcoガラス7731-22000オートクレーブ使用前に
トリパンブルー溶液Sigma-AldrichT8154
PBS、pH 7.2(10x)1.37 M NaCl、27 mM KCl、100 mM Na2HPO4、18 mM KH2PO4 (使用前に滅菌水で1倍に希釈)
銅 (II) 硫酸五水和物 (CuSO4-5H2O)フィッシャーサイエンティフィックC489100 mM ストックを準備し、4 °C;C 最長1ヶ月間
(+) L-アスコルビン酸ナトリウムSigma-AldrichA4034新たに調製した100 mMストックを調製し、使用するまで氷上に保存する
ビオチンアジドInvitrogenB1018410 mMストックをDMSOに調製し、分注し、-20°Cで保存します。C:最長1年間 
「リアクションミックス」をクリック(10 mL:8.8 mL 1x PBS、200 mL 100 mM CuSO4、25 mL 10 mM ビオチンアジド、1 mL 100 mM アスコルビン酸ナトリウム)  
完全なプロテアーゼ阻害剤カクテルロシュ116974980011mLの水に溶解して50倍のストックを調製し、4°Cで保存できます。Cを最大1週間、または1錠を50mLバッファーに直接加えます
凍結バッファー新鮮な(7 mL 100%グリセロール、3 mL NEB、200 μL 50xプロテアーゼ阻害剤)
バッファーB1新鮮に調製(25 mM NaCl、2 mM EDTA、50 mM Tris-HCl pH 8、1%イゲパル、1xプロテアーゼ阻害剤)
バッファーB2新たに調製(150 mM NaCl、2 mM EDTA、50 mM Tris-HCl pH 8、0.5%イゲパル、1xプロテアーゼ阻害剤)
バッファーB3新たに調製(150 mM NaCl、2 mM EDTA、50 mM Tris-HCl pH 8、 1x プロテアーゼ阻害剤)
3 mm マイクロチッププローブを搭載した Vibra Cell Ultra Sonic ProcesserSonicsVCX 130
Cell strainerFalcon352360
Dynabeads MyOne Streptavidin T1Life Technologies65601
DynaMag-2 MagnetLife Technologies12321D
Mini-Tube RotatorFisher Scientific260750F
2x Laemmli サンプルバッファー400 mg の SDS、2 mL の 100% グリセロール、1.25 mL の 1 M トリス (pH 6.8)、10 mg のブロモフェノールブルーを 8 mL の水に混ぜます。4 °Cは最長6ヶ月間。使用前に、最終濃度200 mMに1 M DTTを加えてください。
1.5 mLチューブ用キャップロックFisher ScientificNC9679153
Standard Western blotting reagents
NOVEX Colloidal Blue Staining KitInvitrogenLC6025
12ウェル組織培養皿Corning3513
カバースリップFisher Scientific12-545-100使用
前のオートクレーブ顕微鏡スライドフィッシャーサイエンティフィック12-552-5
16% パラホルムアルデヒド電子顕微鏡科学15710使用前に 1x PBS で 3.7% に希釈
ウシ血清アルブミン (BSA)フィッシャーサイエンティフィBP16051x PBS
透過化バッファー (0.5% Triton-X 100)
クリック反応カクテル - Click-iT EdU Alexa Fluor 488 イメージングキット分子プローブC10337製造業者のプロトコルに従って調製
Hoechst 33342Life TechnologiesH139910 mg/mL を水で調製し、4 °Cで保存可能。C 最長 1 年間
マウス抗 ICP8 一次抗体Abcamab201941:200 希釈液を使用
Abcamab19311で 1:200 希釈
1xPBS
Immu-mountThermo Fisher Scientific9990402
2x SDS-重炭酸塩溶液2% SDS、200 mM NaHCO3
フェノール:クロロホルム:イソアミルアルコールミックス 25:24:1 使用の少なくとも 1 日前に、4 °C で保存してください。暗所の
Cクロロホルム:イソアミルアルコール使用の少なくとも1日前に24:1を混合し、暗所で室温で保存してください
10x Tris EDTA (TE)、pH 8.0100 mM Tris、10 mM EDTA (使用前に1倍に希釈してください)
Qiaquick PCR 精製キットQiagen28104
3 M 酢酸ナトリウム pH 5.2
Qubit 2.0 FluorometerInvitrogenQ32866
Qubit dsDNA HS Assay KitInvitrogenQ32851
Qubit assay tubesInvitrogenQ32856
イメージングソフトウェア
1.5 mL チューブ
15 mL および 50 mL チューブ
セル培養インキュベーター
Biosafety cabinet
Heat blocks65 °C と 95 °ハ
指示された順序で試薬を添加し、使用直前に調製しますをををック で 3% を調製 1x PBS で Sigma-Aldrich T8787 0.5% Triton-X 100 を調製 1x PBS マウス抗 UL42 一次抗体 (2H4) で 1x PBS ヤギ抗マウス 594-標識二次抗体液 搭載蛍光顕微鏡用マイクロ遠心分離機用卓上遠心分離機

参考文献

  1. Knipe, D. M., Howley, P. M. Fields virology. , 6th, Wolters Kluwer/Lippincott Williams & Wilkins Health. (2013).
  2. Engel, E. A., Song, R., Koyuncu, O. O., Enquist, L. W. Investigating the biology of alpha herpesviruses with MS-based proteomics. Proteomics. 15, 1943-1956 (2015).
  3. Wagner, L. M., DeLuca, N. A. Temporal association of herpes simplex virus ICP4 with cellular complexes functioning at multiple steps in PolII transcription. PloS One. 8, e78242(2013).
  4. Taylor, T. J., Knipe, D. M. Proteomics of herpes simplex virus replication compartments: association of cellular DNA replication, repair, recombination, and chromatin remodeling proteins with ICP8. J Virol. 78, 5856-5866 (2004).
  5. Fontaine-Rodriguez, E. C., Taylor, T. J., Olesky, M., Knipe, D. M. Proteomics of herpes simplex virus infected cell protein 27: association with translation initiation factors. Virology. 330, 487-492 (2004).
  6. Greco, T. M., Diner, B. A., Cristea, I. M. The Impact of Mass Spectrometry-Based Proteomics on Fundamental Discoveries in Virology. Annu Rev Virol. 1, 581-604 (2014).
  7. Conwell, S. E., White, A. E., Harper, J. W., Knipe, D. M. Identification of TRIM27 as a novel degradation target of herpes simplex virus 1 ICP0. J Virol. 89, 220-229 (2015).
  8. Suk, H., Knipe, D. M. Proteomic analysis of the herpes simplex virus 1 virion protein 16 transactivator protein in infected cells. Proteomics. 15, 1957-1967 (2015).
  9. Balasubramanian, N., Bai, P., Buchek, G., Korza, G., Weller, S. K. Physical interaction between the herpes simplex virus type 1 exonuclease, UL12, and the DNA double-strand break-sensing MRN complex. J Virol. 84, 12504-12514 (2010).
  10. Sampath, P., Deluca, N. A. Binding of ICP4, TATA-binding protein, and RNA polymerase II to herpes simplex virus type 1 immediate-early, early, and late promoters in virus-infected cells. J Virol. 82, 2339-2349 (2008).
  11. Amelio, A. L., McAnany, P. K., Bloom, D. C. A chromatin insulator-like element in the herpes simplex virus type 1 latency-associated transcript region binds CCCTC-binding factor and displays enhancer-blocking and silencing activities. J Virol. 80, 2358-2368 (2006).
  12. Cliffe, A. R., Knipe, D. M. Herpes simplex virus ICP0 promotes both histone removal and acetylation on viral DNA during lytic infection. J Virol. 82, 12030-12038 (2008).
  13. Herrera, F. J., Triezenberg, S. J. VP16-dependent association of chromatin-modifying coactivators and underrepresentation of histones at immediate-early gene promoters during herpes simplex virus infection. J Virol. 78, 9689-9696 (2004).
  14. Kent, J. R., et al. During lytic infection herpes simplex virus type 1 is associated with histones bearing modifications that correlate with active transcription. J Virol. 78, 10178-10186 (2004).
  15. Oh, J., Fraser, N. W. Temporal association of the herpes simplex virus genome with histone proteins during a lytic infection. J Virol. 82, 3530-3537 (2008).
  16. Catez, F., et al. HSV-1 genome subnuclear positioning and associations with host-cell PML-NBs and centromeres regulate LAT locus transcription during latency in neurons. PLoS Pathog. 8, e1002852(2012).
  17. Everett, R. D., Murray, J., Orr, A., Preston, C. M. Herpes simplex virus type 1 genomes are associated with ND10 nuclear substructures in quiescently infected human fibroblasts. J Virol. 81, 10991-11004 (2007).
  18. Tang, Q., et al. Determination of minimum herpes simplex virus type 1 components necessary to localize transcriptionally active DNA to ND10. J Virol. 77, 5821-5828 (2003).
  19. Ishov, A. M., Maul, G. G. The periphery of nuclear domain 10 (ND10) as site of DNA virus deposition. J Cell Biol. 134, 815-826 (1996).
  20. Maroui, M. A., et al. Latency Entry of Herpes Simplex Virus 1 Is Determined by the Interaction of Its Genome with the Nuclear Environment. PLoS Pathog. 12, e1005834(2016).
  21. Sirbu, B. M., Couch, F. B., Cortez, D. Monitoring the spatiotemporal dynamics of proteins at replication forks and in assembled chromatin using isolation of proteins on nascent DNA. Nat Protoc. 7, 594-605 (2012).
  22. Leung, K. H., Abou El Hassan, M., Bremner, R. A rapid and efficient method to purify proteins at replication forks under native conditions. BioTechniques. 55, 204-206 (2013).
  23. Hobbs, W. E. 2nd, DeLuca, N. A. Perturbation of cell cycle progression and cellular gene expression as a function of herpes simplex virus ICP0. J Virol. 73, 8245-8255 (1999).
  24. Lomonte, P., Everett, R. D. Herpes simplex virus type 1 immediate-early protein Vmw110 inhibits progression of cells through mitosis and from G(1) into S phase of the cell cycle. J Virol. 73, 9456-9467 (1999).
  25. Dembowski, J. A., DeLuca, N. A. Selective recruitment of nuclear factors to productively replicating herpes simplex virus genomes. PLoS Pathog. 11, e1004939(2015).
  26. Dembowski, J. A., Dremel, S. E., DeLuca, N. A. Replication-Coupled Recruitment of Viral and Cellular Factors to Herpes Simplex Virus Type 1 Replication Forks for the Maintenance and Expression of Viral Genomes. PLoS Pathog. 13, e1006166(2017).
  27. Bjornberg, O., Nyman, P. O. The dUTPases from herpes simplex virus type 1 and mouse mammary tumour virus are less specific than the Escherichia coli enzyme. J Gen Virol. 77 (Pt 12), 3107-3111 (1996).
  28. Chiou, S. H. DNA- and protein-scission activities of ascorbate in the presence of copper ion and a copper-peptide complex. J Biochem. 94, 1259-1267 (1983).
  29. Kennedy, D. C., et al. Cellular consequences of copper complexes used to catalyze bioorthogonal click reactions. J Am Chem Soc. 133, 17993-18001 (2011).
  30. Snel, B., Lehmann, G., Bork, P., Huynen, M. A. STRING: a web-server to retrieve and display the repeatedly occurring neighbourhood of a gene. Nucleic Acids Res. 28, 3442-3444 (2000).

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

再版と許可

このJoVE記事のテキストまたは図の再利用許可をリクエスト

許可をリクエスト

タグ

DNADNADNA

関連記事