遠心浄化によって異なった細胞周期の段階で主に急性リンパ性白血病細胞の調製

サマリー

このプロトコルでは、異なる細胞周期の段階に主な急性リンパ芽球性白血病細胞を分離する遠心浄化の使用について説明します。

要約

セルを同期する機能を細胞周期の規則の私達の理解を進める中心となっています。一般的な技法は、血清遮断;化学物質の細胞を別の細胞周期段階で逮捕または分裂振り払い減少への遵守を悪用するの使用します。しかし、これらすべての欠点を持ちます。たとえば、血清飢餓動作も正常な細胞が、腫瘍細胞が癌遺伝子の活性化や腫瘍サプレッサーの損失のための危険にさらされた細胞周期チェックポイントのあまり。同様に、化学的に扱われる細胞集団は薬害被害を抱くし、ストレス関連の変更を表示できます。これらの問題を回避する手法が対向流遠心浄化 (CCE) つの反対勢力、遠心力と流体の速度、サイズおよび密度に基づいて細胞の分離の結果をセルを受けます。通常サイクルを進める細胞が拡大するので、細胞を別の細胞周期の段階に分割する CCE を使用できます。ここで我々 は急性リンパ性白血病の主にこの手法を適用します。最適な条件下で、優れた収率で、G1 期の細胞の本質的に純粋な人口と G2/M の段階で高濃縮細胞集団が取得できます。これらの細胞は、抗がん剤の作用の勉強の細胞周期依存性のメカニズムおよび他のアプリケーションには最適です。またどのように標準的な手順に変更の最適なパフォーマンスの結果を表示し、技術の制限について説明。紹介する詳細な方法は、アプリケーションや他の種類の細胞に手法の探査を促進するべき。

概要

培養細胞は通常非同期的に成長し、個々 の細胞が細胞周期の異なった段階の存在。いくつかの生物は当然のことながら同期の細胞周期を展示または特定の生理学的な刺激によって同期することができます。たとえば、粘粘菌変形体の巨大なでん内核分割高同期ファッション¹, と指数養魚は光と闇を交互に同期できる緑の藻の細胞期間²。このような生物は、ユニークな実験的属性を提供する間不十分な哺乳類細胞の複雑さをモデルします。人工的に哺乳類セル人口の同期機能細胞周期チェックポイントの分子基盤と細胞周期制御の理解を推進する中心となっています。血清剥奪、化学ブロック、リリース、または物理的特性^3,4を利用する一般的な方法があります。血清の撤退、静穏化を入力するセルが生じる、再血清添加 G1 フェーズ⁵細胞周期再突入に昇格させます。阻害剤には、余分なチミジンやヒドロキシウレア G1/S 境界で細胞をブロック、M フェーズ^3,4のセルを通常逮捕微小管阻害剤などのエージェントが含まれます。分裂振り払い間期細胞⁶より....

プロトコル

注: このプロトコルは、B-すべての主要な細胞の直径は約 8 μ m (G1 期)、13 μ m (G2/M フェーズ) に範囲の最適化されています。したがって、特定の遠心速度とポンプ流量は異なるサイズの範囲のセルには適用できません。それにもかかわらず、沈降速度式を使用して適切な飛び出しパラメーターを推定できます。セル 1-3 10 ⁶ セル/mL の x の最適密度で説明した ¹⁶ として無血清培地で培養されます。部屋の温度と最大 24 までの 20 ° C で設定遠心分離機で行われていますすべてのステップ 4 ° c の氷冷却管を使用して行われる分数のコレクションを除いて ° C

1 飛びだしバッファーの準備と材料

細胞の凝集を低減、ハンクの飛びだしバッファーを準備するために

1. ' s バランス 2% 牛胎児血清 (補足フェノールレッド食塩 (HBSS)。FBS) を使用して、浄化プロセス、および負荷電のセルの外観をレンダリングし、凝集を減らす 2-ナフトール-6, 8-ジスルホン酸二カリウム塩 (NDA)、1.6 g/L の間に機械的ストレスから細胞を保護するためにも。
   1. 50 mL の円錐管に NDA の 1.6 グラムを追加します
   。
   2. 無菌条件下で HBSS の 35 mL を 1 L ボトルから NDA を含む 50....

結果

プライマリのすべてのセル (10 x 3 4⁸) 遠心浄化を受けるし、プロトコルで説明されているように 2 つの洗浄分数と 20 の主な分数に収集されました。対応するローターの速度と同様、各画分のセルの合計数が表示されます代表的なデータを表 1 に示します。全体収率は通常 80% では以上。留分の細胞径の測定は、そのセル径に伴って飛び出し (図 2) を確認しました。これらの結果は、2 つの独立した測定の平均値を表し、データ再現性の高度を反映します。分数は、propidium ヨウ化染色が施された次におよびフローサイトメトリー DNA 量 (図 3) を決定します。初期分数 (F1 - f5 キー) は、G1 期を表す 2N DNA 量とほとんど専ら細胞を含まれています。G1 期と S 期の細胞の混合物は中間留分 (F6 - f9 キー) で観察されたと 4 n の DNA 量と細胞観察 [f10] キーで開始。後の分数は、G2/M.......

ディスカッション

CCE を使用して細胞周期の異なった段階でプライマリを取得するためのメソッドのすべてのセルを説明しました。最適な条件で G1 期の細胞の本質的に純粋な人口と G2/M の段階で細胞の高濃縮人口に容易に得ることができた優れた収率で、必要な場合、S 期で高濃縮のセルを取得することも。ここで示された結果は、独立した文化、すべて 2¹⁵ですべての文化 (具体的には、すべての-5) と本質的に同一の結果が得られている 1 つのプライマリを使用して得られました。さらに、他のすべてのプライマリ日付を調べてすべての文化非同期成長中に同じような密度の範囲があるし、可能性が高い実行同様に CCE を受けるとき。私たちの先行研究も CCE^19,20を使用して異なる細胞周期段階分け他白血病細胞株 HL60 と K562 などを含むことができますを示しました。重要なステップの手順では、実行の開始時、セルの単分散とない周辺固定支持が確実対向速度と回転速度の条件の最適化汚れや破片; がないは、システムの.......

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
ハンクスの平衡塩溶液	ロンザ	10-508Q	1 L ボトル
胎児プラス ウシ血清	アトラス バイオロジカルズ	FP-0500-A	500 mL ボトル
2-ナプトール-6,8-ジスルホン酸 ジカリウム塩	アクロス オーガニックス	212-672-4	100 g 粉末
50 mL コンシェルチューブ	デンビル サイエンティフィック	C1062-P	500/ケース
PES メンブレン 0.22&マイクロ;m フィルターユニット	Millipore	SLGP033RB	250/pack
Avanti J-26S XPI w/ Elut.非IVD - 50/60 Hz、200/208/240V	ベックマン・コールター	B14544	遠心分離機、水簸システム
JE 5.0 水簸装置ローターキット	ベックマン・コールター	356900	ローターキット(ローター、Tハンドル六角レンチ、クイックリリースアセンブリ(水簸チャンバーなし)、アンカーケーブル、ストロボアセンブリを含む
チャンバー、標準、4 mL、「A」	ベックマン・コールター	356943	標準水簸室
Masterflex L/S Easy-Load ポンプヘッド	Cole-Parmer	EW-07518-10
Masterflex L/S 可変速ドライブ	Cole-Parmer	EW-07528-10
Masterflex BioPharm プラチナ硬化シリコーンポンプチューブ、L/S 16	Cole-Parmer	EW-96420-16
25 G x 1.5 Precision Glide Needle	BD	305127	滅菌済み、使い捨てニードル
10 mL Luer-Lokシリンジ	BD	309604	滅菌済み、使い捨てシリンジ
Vi-Cell XR	Beckman Coulter	383556
PI/RNase 染色緩衝液	BD Pharmingen	550825	ヨウ化プロピジウム/RNase 染色緩衝液
cyclin B1 (GNS1) マウスモノクローナルIgG抗体	Santa Cruz Biotechnology	sc-245
cyclin D1 (DCS-6) マウスモノクローナルIgG抗体	SantaCruz Biotechnology	sc-20044
P-Rb (S807/811) (D20B12) XPR ウサギモノクローナル抗体	細胞シグナル伝達技術	8516s
GAPDH (14C10) ウサギモノクローナル抗体	細胞シグナル伝達技術	2118s
ヤギ抗マウス IgG (H+L)-HRP 結合体	BioRad	170-6516
ヤギ抗ウサギ IgG (H+L)-HRP 結合体	BioRad	〒170-6515

に対応 )