遠心浄化によって異なった細胞周期の段階で主に急性リンパ性白血病細胞の調製

サマリー

このプロトコルでは、異なる細胞周期の段階に主な急性リンパ芽球性白血病細胞を分離する遠心浄化の使用について説明します。

要約

セルを同期する機能を細胞周期の規則の私達の理解を進める中心となっています。一般的な技法は、血清遮断;化学物質の細胞を別の細胞周期段階で逮捕または分裂振り払い減少への遵守を悪用するの使用します。しかし、これらすべての欠点を持ちます。たとえば、血清飢餓動作も正常な細胞が、腫瘍細胞が癌遺伝子の活性化や腫瘍サプレッサーの損失のための危険にさらされた細胞周期チェックポイントのあまり。同様に、化学的に扱われる細胞集団は薬害被害を抱くし、ストレス関連の変更を表示できます。これらの問題を回避する手法が対向流遠心浄化 (CCE) つの反対勢力、遠心力と流体の速度、サイズおよび密度に基づいて細胞の分離の結果をセルを受けます。通常サイクルを進める細胞が拡大するので、細胞を別の細胞周期の段階に分割する CCE を使用できます。ここで我々 は急性リンパ性白血病の主にこの手法を適用します。最適な条件下で、優れた収率で、G1 期の細胞の本質的に純粋な人口と G2/M の段階で高濃縮細胞集団が取得できます。これらの細胞は、抗がん剤の作用の勉強の細胞周期依存性のメカニズムおよび他のアプリケーションには最適です。またどのように標準的な手順に変更の最適なパフォーマンスの結果を表示し、技術の制限について説明。紹介する詳細な方法は、アプリケーションや他の種類の細胞に手法の探査を促進するべき。

概要

培養細胞は通常非同期的に成長し、個々 の細胞が細胞周期の異なった段階の存在。いくつかの生物は当然のことながら同期の細胞周期を展示または特定の生理学的な刺激によって同期することができます。たとえば、粘粘菌変形体の巨大なでん内核分割高同期ファッション¹, と指数養魚は光と闇を交互に同期できる緑の藻の細胞期間²。このような生物は、ユニークな実験的属性を提供する間不十分な哺乳類細胞の複雑さをモデルします。人工的に哺乳類セル人口の同期機能細胞周期チェックポイントの分子基盤と細胞周期制御の理解を推進する中心となっています。血清剥奪、化学ブロック、リリース、または物理的特性^3,4を利用する一般的な方法があります。血清の撤退、静穏化を入力するセルが生じる、再血清添加 G1 フェーズ⁵細胞周期再突入に昇格させます。阻害剤には、余分なチミジンやヒドロキシウレア G1/S 境界で細胞をブロック、M フェーズ^3,4のセルを通常逮捕微小管阻害剤などのエージェントが含まれます。分裂振り払い間期細胞⁶より少ない付着しているので、分裂期細胞の豊かにするために使用できる物理特性を悪用する手法が含まれます。ただし、すべてのこれらの技術の潜在的な欠点があります。たとえば、すべてのセル型は分裂振り払いは有糸分裂阻害薬の事前同期せず限られた後血清や化学剤の存在の有無と細胞の収量で生存率を維持します。

初期胚細胞周期、場所細胞は分類⁷サイズが徐々 に減少を除いてほとんどの細胞周期を進める成長段階を経るし、サイズが大きくなります。このプロパティは、対向流遠心浄化 (CCE)、サイズの異なる細胞を分離する使用ことができますし、それゆえ細胞周期段階^8,9の手法で利用されます。CCE、中に細胞が 2 つの反対勢力の影響の下で: 回転の軸から細胞を運転する遠心力と流体の速度 (対向)、回転 (図 1) の軸に向かってセルを駆動します。これらの力が等しい平衡位置を飛びだしチャンバーで細胞に到達します。平衡位置を指示、重要な要因は細胞径および密度です。緩衝液の率の増加の流れとして、対向ドラッグ力が遠心力を上回る新しい均衡を確立すると、商工会議所の内部のセルの位置が変更されています。すべてのセルが対向流率はその出口を促進するために十分に増加するまで商工会議所内より大きい細胞にとどまるに対し小さいものは最初、商工会議所のままで、その結果、チャンバー出口に向かってシフトされます。特定分数で対向速度の連続増加と飛びだし室をエスケープ細胞を集めることができるし、各分画に順番にサイズの増加のセルが含まれています。対向流率の増加と飛び出しを行う必要がなく遠心分離速度を減少させることによって遠心力の連続の減少は、同じ結果を達成するでしょう。浄化のプロセスには、セル型、採用、飛びだしバッファーおよび使用される特定の装置によって最適化が必要です。これらの条件下で細胞の堆積速度はストークスの法則によって最もよく述べ: SV = [d²(ρ_p- ρ_m)/18η] .ω²r、SV = 沈降速度;d = 粒子の直径Ρ_p = 粒子の密度Ρ_m = バッファーの密度Η = バッファーの粘度Ω =; ローターの角速度r = 粒子の半径方向の位置。したがって、SV は細胞径および密度に比例して、細胞周期を通って一般に定数である密度より大きく寄与直径が 2 番目の電源に発生するので。

CCE の重要な利点は、細胞が化学治療や栄養欠乏の過酷な条件にさらされないと本質的に動じない優れた収率で回収することができます。要件は、細胞周期にトラバース、問題の細胞が直径の少なくとも 30% の大幅な増加を受けることです。主な欠点は、特殊な遠心分離機、ローター、アクセサリーのコストです。それにもかかわらず、CCE によって豊かに細胞周期の特定の段階で細胞を準備する機能は、酵母から哺乳類セル^9,10の生物で細胞周期研究を促進しています。また、最近の進歩で、細胞の分離の使用を拡大して癌組織、異なる種類の細胞、異種混合物でし免疫療法⁹の特定の細胞型の生産分離対健康からいます。

我々 の主要な関心のビンカ アルカロイドやタキサン系薬剤などのエージェント (Mta) 微小管作用のメカニズムを理解されています。これらの薬は、有糸分裂、スピンドル微小管機能^11,12のブロックにのみ行動すると考えられていたが、最近の証拠は、彼らが間期の微小管^13,14の対象にも示唆しています。我々 は最近、プライマリ急性リンパ芽球性白血病 (ALL) セル G1 期のいずれかの死を受けるまたは M 相ビンクリスチンと細胞周期依存的¹⁵の他の Mta で処理することを報告しました。CCE によって異なった細胞周期の段階にすべてのセルを分ける機能はこの結論に達するに尽力しました。この記事では、技術的な詳細を説明して、異なった細胞周期の段階ですべてのセルの CCE のプライマリの調製への応用のための実用的なヒントを提供します。

プロトコル

注: このプロトコルは、B-すべての主要な細胞の直径は約 8 μ m (G1 期)、13 μ m (G2/M フェーズ) に範囲の最適化されています。したがって、特定の遠心速度とポンプ流量は異なるサイズの範囲のセルには適用できません。それにもかかわらず、沈降速度式を使用して適切な飛び出しパラメーターを推定できます。セル 1-3 10 ⁶ セル/mL の x の最適密度で説明した ¹⁶ として無血清培地で培養されます。部屋の温度と最大 24 までの 20 ° C で設定遠心分離機で行われていますすべてのステップ 4 ° c の氷冷却管を使用して行われる分数のコレクションを除いて ° C

1 飛びだしバッファーの準備と材料

細胞の凝集を低減、ハンクの飛びだしバッファーを準備するために

1. ' s バランス 2% 牛胎児血清 (補足フェノールレッド食塩 (HBSS)。FBS) を使用して、浄化プロセス、および負荷電のセルの外観をレンダリングし、凝集を減らす 2-ナフトール-6, 8-ジスルホン酸二カリウム塩 (NDA)、1.6 g/L の間に機械的ストレスから細胞を保護するためにも。
   1. 50 mL の円錐管に NDA の 1.6 グラムを追加します
   。
   2. 無菌条件下で HBSS の 35 mL を 1 L ボトルから NDA を含む 50 mL の円錐管に追加。NDA が溶けるまでチューブを旋回します
   。
   3. 新しい滅菌 50 mL のコニカル チューブに溶存 NDA 0.2 μ m フィルターを使用して転送します。HBSS の残り 1 L に NDA を追加します
   。
   4. では、最後に、21 mL FBS を最終濃度 2% (v/v) を取得する HBSS に追加します
      。 注: 飛びだしバッファーを作成し、HBSS またはインジケーター染料の黄変によって示されるように pH に大きな変化があるまで有効期限まで 4 ° C で保存します
   。
2. ラベル 50 mL を分画のコレクションのための円錐管でチューブ ラベル 1、2 (W1 と W2) 分数 1-20 (F1 - F20) を洗浄し、停止があります。
   1. 中古分数を収集する前に氷の上にこれらの管を寒さ
   。

2。浄化システムのアセンブリ

左側のポートを通ってチャンバから電源を供給できるように、
1. まず、遠心分離機にストロボ アセンブリをインストールします。ストロボ フラッシュ ランプは商工会議所の前面は遠心分離機が閉じられたときそれが表示ウィンドウで整列されるのでを確認します。
   1. で各ブラケットの下部に蝶ネジを締めて、最初各ブラケットの上部に 2 つの穴に 2 つのプラス頭ネジを締めによって場所にアセンブリをセキュリティで保護します
   。
   2. 遠心分離機の背面にあるストロボの電源ポートに電源コードを差し込みます
   。
2. 次に、遠心分離機ドライブハブにまっすぐにローターをセットし、T ハンドル六角レンチで固定します
   。 注: 場合非飛び出し用遠心分離機が必要でないストロボ アセンブリとローターに保存できます実行の間遠心分離機で
。
3. ローターを固定すると、一度は、ロータにシールの組立・取付板を回転飛び出し室、カウンター バランスを含むクイック リリース アセンブリを配置します。
   1. を均等に押す片手で飛びだし室とカウンター バランスの一方のローター ボルト取付板の穴にカチッとはまるまで
   。
   2. 最後に、回転シール アセンブリの穴にケーブルの 1 つの側面のピンを配置すると左側に o のブラケット (2.1.1 に記載) + ネジの 1 つとケーブルの反対側アイホール固定アンカー ケーブルを添付します。f 商工会議所します
   。
4. 次に、変数の速度のポンプを使用してフロー システムを構築して、商工会議所飛びだしにチューブ ポンプ バッファーへと飛び出し室から移動するときに、バッファーを収集します。
   1. サイズ 16 入力管上部のポートを介して変速ポンプから来るまま遠心室内の商工会議所に入るので、挿入
   。
   2. 入力管の自由端に継ぎ手を接続し、回転シール アセンブリ横の穴に入力に継手を挿入します
   。
   3. インサート サイズ 16 出力ポートを介してチューブ、回転の上部に転送管に取り付けますシールアセンブリします
      。 メモ: フロー システムの飛びだし実行の間組み立てられたままもできます
   。
5. 最後に、遠心分離機をオンにして、実験に必要な仕様を設定。
   1. ローターの ID の変更
   2. 水簸分級実行を完了するよりも十分です 2 時間の遠心分離機は、時間の入力を必要とする場合を設定します
   。
   3. 24 の最大温度 20 ° C に温度を設定 ° C
   4. 最大の加速と減速のために遅く設定します
   。
   5. 最後に、867 x g に速度を設定

3。浄化システムのプライミング

殺菌浄化システム、5% の漂白剤を含む 500 mL ペットボトルに貯留管を置き、空 1 L の廃プラスチック ボトルに出力管を配置するために最初の

1. 。
   1. それ廃液ボトルに出力管からポンプでくまれるまで飛び出しシステムをフローする 5% の漂白剤のポンプをオンにして速度を 25 mL/min に設定でき
   。
   2. 遠心分離機をオンにして、泡と背圧を解放するために (867 x g) の速度を指定された最大値を出すことができます
   。
   3. は、遠心分離機を停止します。ローターの回転が停止すると、一度蓋を開き、室内楽、任意の漏れを検査します
   。
   4. リークがない場合させて漂白剤溶液で少なくとも 5 分間システムのフロー
2. 次に、漂白剤は、細胞に害をもたらすだけでなく、細胞の凝集につながる可能性があります飛びだしバッファーから析出物の形成につながる可能性としてオートクレーブ水システムをフラッシュします。
   1. 場所オートクレーブの 1 L ボトルに貯留管水し、少なくとも 10 分をフラッシュするそれを許可
3. 水でフラッシュした後、システムに飛びだしバッファーを紹介します。飛びだしバッファーおよび細胞のための貯蔵を作成するオートクレーブ養生されている 150 mL 瓶を使用します。
   1. ボトルに 100 mL の水簸分級バッファーを追加し、チューブが一番下にくるように、貯水池のチューブ ガラスのボトルに移動します
   。
   2. 遠心分離機を開始でき、流れる水を洗い流すシステムにバッファーします
   。
   3. リザーバー ボトルはほとんど空と水は完全にシステムから消去、移動、出力管廃液ボトルから貯蔵所に、バッファーがシステムでリサイクルされている
   。
4. 飛び出し商工会議所は、現在の速度で見ることができるので、さらに、表示ウィンドウを調整します。
   1. プレス、ストロボ ランプ電源ランプが点灯するので、遠心分離機の外側のボタンであります。飛び出し k を有効に左端に遠心分離機の外側にもノブ
   。 飛びだし室表示とストロボの光に来るまで右にノブは、ローターの回転と時間表示窓からゆっくりと探している間
   2. ターン
      。 注: 水簸分級システムことができます状態のままにこのセルを準備するまで.

4。細胞試料調製

1. カウント細胞といくつかの 50 mL の円錐管に分注 300 に 4 億で培。1210 x g で 3 分間で細胞をスピン
2. 25 mL の上下に軽くピペッティングによる飛び出しバッファーで成長のメディアと再懸濁します細胞を吸引します
。
3. を減らすために細胞を凝集、パス細胞 2 回、25 ゲージの針。
   1. 10 mL の注射器を使用してセルを描く 25 ゲージの針を添付し、内側にからのセルを渡す滅菌 50 mL の円錐管の壁。この手順を繰り返してすべての 25 mL は、針を通過している
   。
   2. 新しい針と注射器を入手し、一度上記の手順を繰り返します
      。 注意: 注射針はディスポに配置する必要があります
      。 注: セルを針を介してプッシュ水簸分級システムにそれらを導入する前にすぐを細胞凝集を最小限の維持が重要です
   。

5。導入細胞サンプルの水簸分級システムと分数コレクション

1. を通じてリサイクル飛びだしバッファーの残りのあるリザーバ タンクにセルのサンプルを注ぐことによって浄化システムにセルのサンプルをご紹介.
   1. システムに入力し、飛び出しチャンバ内で平衡に達する細胞ができます
      。 注: このプロセスは約 5 分かかります、表示ウィンドウを介してチャンバを入力するとセルを見ることによって進捗状況を追跡ことができます。ドロップを取るようにすべてのセルは、商工会議所、溶離液のガラス スライド上に配置し、顕微鏡下で表示。これは商工会議所での保持を確認するサンプルがそのままなセルのフリーの場合
   。
2. 室にすべてのセルを入力し、セルが均衡商工会議所の最も広い部分で明確な境界がある分数を収集を開始します。
   1. 開始 50 mL の円錐管に出力管を移動しては、W1 をラベル付けします。50 mL のリザーバ タンクに目を離さないし、飛び出しバッファー必要があるときに補充するようにして、この分数の飛びだしバッファーを収集します
      。 注: システムにすべてのセルが入力されていることを確認、するためにリザーバ タンク初めて貯水池を充填する前にほぼ空になることができます。最初の詰め替え後貯水池ほぼ空になるを待つ必要があります。また、これまで泡と背圧を作成するシステムで、これが空になるためにタンクを許可するしないで
   。
   2. W1 の 50 mL が収集されて、一度同時に 821 x g に速度を変更 W2 というラベルの付いた円錐管の出力管を移動し、50 mL この速度でより多くを収集します
   。
   3. は、速度を変更して、表 1 に示されているように、分数を収集を続けます。貯留層におけるメディア タンクし、常に氷の上の円錐管があることを確認します。さらに、速度が減少、徐々 つまみを右に回して、表示ウィンドウを調整します
   。
   4. 20 のすべての分数は収集されているし、遠心分離機を停止、停止というラベルの付いた円錐形の管の 50 mL を収集します
   。

6。飛び出し系フラッシング

1. 遠心分離機が停止した後完全にフラッシュ システム オートクレーブ水と廃棄物のボトルに戻る出力管の 1 L ボトルで貯留管を置くことによって。
   1. 50 mL/min までポンプの速度を切り、水がなくなるまで、システムを介して実行するを許可します
   。
2. 電源、ポンプをオフ クイック リリース アセンブリから入力と出力のホースを取り外し、アンカー ケーブルからピンを抜きます。
   1. ローターからクイック リリース アセンブリを削除します
      。 注: 遠心分離機が使用されるか、によって飛び出しシステム今をそのままです。それ以外の場合、アセンブリ全体が前述を逆の順序で閉鎖することができます。飛びだしチャンバーをクイック リリース アセンブリから削除し、清掃超音波水浴を使用して実行できます。これは後の実行に悪影響を及ぼす室壁から瓦礫や汚染物質を削除します
   。

7。分数と G1 または G2/M プールのコレクションの分析

。

注: 浄化の有効性を示すために各分画、細胞数、細胞径および DNA 量を分析し、に従って、イムノブロット解析の G1 または G2/M の段階で細胞のプールが作成されます代表の結果。このプロトコルのセクションは、これらのプールを作成し、実験用のためにそれらを準備する方法を説明します

。

1. 4 ° C と飛びだしバッファーを吸引で 5 分間 2000 x g で各分画をスピンします
。
2. G1 相プールと G2/M 段階プールの両方を取得するために一緒に結合分画。
   1. のための G1 相プール、リン酸緩衝生理食塩水液 (PBS) 1 mL、15 mL の円錐管への転送の合計で 661 × g (F1 - f5 キーを押して) 788 × g の速度範囲で収集した画分を再懸濁します。G2/M 段階プール × g と 333 x グラム (F17 - F20) 387 の速度範囲で集められた分数を再懸濁します。
   。
   2. 細胞 4 ° C と PBS を吸引で 5 分間 2000 x g でスピンダウンします
   。
3. 細胞数をとり成長媒体の 10 mL の細胞を再懸濁します
。
4. Propidium ヨウ化染色を介してコンテンツの DNA を分析するのに各プールから、因数を取るし、フローサイトメトリー解析 ¹⁵ をフローします
   。 注: 各プールの残りの部分は、さらに実験のため使用できます
。

結果

プライマリのすべてのセル (10 x 3 4⁸) 遠心浄化を受けるし、プロトコルで説明されているように 2 つの洗浄分数と 20 の主な分数に収集されました。対応するローターの速度と同様、各画分のセルの合計数が表示されます代表的なデータを表 1 に示します。全体収率は通常 80% では以上。留分の細胞径の測定は、そのセル径に伴って飛び出し (図 2) を確認しました。これらの結果は、2 つの独立した測定の平均値を表し、データ再現性の高度を反映します。分数は、propidium ヨウ化染色が施された次におよびフローサイトメトリー DNA 量 (図 3) を決定します。初期分数 (F1 - f5 キー) は、G1 期を表す 2N DNA 量とほとんど専ら細胞を含まれています。G1 期と S 期の細胞の混合物は中間留分 (F6 - f9 キー) で観察されたと 4 n の DNA 量と細胞観察 [f10] キーで開始。後の分数は、G2/M...

ディスカッション

CCE を使用して細胞周期の異なった段階でプライマリを取得するためのメソッドのすべてのセルを説明しました。最適な条件で G1 期の細胞の本質的に純粋な人口と G2/M の段階で細胞の高濃縮人口に容易に得ることができた優れた収率で、必要な場合、S 期で高濃縮のセルを取得することも。ここで示された結果は、独立した文化、すべて 2¹⁵ですべての文化 (具体的には、すべての-5) と本質的に同一の結果が得られている 1 つのプライマリを使用して得られました。さらに、他のすべてのプライマリ日付を調べてすべての文化非同期成長中に同じような密度の範囲があるし、可能性が高い実行同様に CCE を受けるとき。私たちの先行研究も CCE^19,20を使用して異なる細胞周期段階分け他白血病細胞株 HL60 と K562 などを含むことができますを示しました。重要なステップの手順では、実行の開始時、セルの単分散とない周辺固定支持が確実対向速度と回転速度の条件の最適化汚れや破片; がないは、システムの...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
ハンクスの平衡塩溶液	ロンザ	10-508Q	1 L ボトル
胎児プラス ウシ血清	アトラス バイオロジカルズ	FP-0500-A	500 mL ボトル
2-ナプトール-6,8-ジスルホン酸 ジカリウム塩	アクロス オーガニックス	212-672-4	100 g 粉末
50 mL コンシェルチューブ	デンビル サイエンティフィック	C1062-P	500/ケース
PES メンブレン 0.22&マイクロ;m フィルターユニット	Millipore	SLGP033RB	250/pack
Avanti J-26S XPI w/ Elut.非IVD - 50/60 Hz、200/208/240V	ベックマン・コールター	B14544	遠心分離機、水簸システム
JE 5.0 水簸装置ローターキット	ベックマン・コールター	356900	ローターキット(ローター、Tハンドル六角レンチ、クイックリリースアセンブリ(水簸チャンバーなし)、アンカーケーブル、ストロボアセンブリを含む
チャンバー、標準、4 mL、「A」	ベックマン・コールター	356943	標準水簸室
Masterflex L/S Easy-Load ポンプヘッド	Cole-Parmer	EW-07518-10
Masterflex L/S 可変速ドライブ	Cole-Parmer	EW-07528-10
Masterflex BioPharm プラチナ硬化シリコーンポンプチューブ、L/S 16	Cole-Parmer	EW-96420-16
25 G x 1.5 Precision Glide Needle	BD	305127	滅菌済み、使い捨てニードル
10 mL Luer-Lokシリンジ	BD	309604	滅菌済み、使い捨てシリンジ
Vi-Cell XR	Beckman Coulter	383556
PI/RNase 染色緩衝液	BD Pharmingen	550825	ヨウ化プロピジウム/RNase 染色緩衝液
cyclin B1 (GNS1) マウスモノクローナルIgG抗体	Santa Cruz Biotechnology	sc-245
cyclin D1 (DCS-6) マウスモノクローナルIgG抗体	SantaCruz Biotechnology	sc-20044
P-Rb (S807/811) (D20B12) XPR ウサギモノクローナル抗体	細胞シグナル伝達技術	8516s
GAPDH (14C10) ウサギモノクローナル抗体	細胞シグナル伝達技術	2118s
ヤギ抗マウス IgG (H+L)-HRP 結合体	BioRad	170-6516
ヤギ抗ウサギ IgG (H+L)-HRP 結合体	BioRad	〒170-6515